引用本文： 何建春, 裴昌贞, 杨雷, 王丹, 陈虹佑. 某院普外科高MRSA检出率及其分子流行病学调查. 中国普外基础与临床杂志, 2022, 29(7): 897-903. doi: 10.7507/1007-9424.202109098 复制
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是一种革兰阳性球菌，在血平板上易产生透明的β溶血环，其也是典型的导致社区及医院获得性感染的重要条件致病菌[1]。正常人对SA的携带率可达30%～50%，当患者免疫力低下时大量繁殖，引起呼吸道感染、皮肤组织感染、伤口感染、引流管相关感染、血液感染等多样性感染[2-3]，导致患者住院时间延长、治疗费用增加和预后不良[4]。自1959年在欧洲出现耐甲氧西林SA（methicillin-resistant SA，MRSA）以来，MRSA在世界范围内开始流行，成为世界范围内最难解决的感染性疾病之一[5]。由于MRSA具有多重耐药性、毒性大、容易感染且死亡率高等特性，近10年来全球对MRSA进行了严格的监控，使得MRSA的检出率在全球开始呈现出逐步降低的趋势。在美国和一些西方国家的研究报告中发现， MRSA 的检出率呈下降趋势[6-7]。我国，胡付品等[8-9]在中国耐药监测网（China Antimicrobial Surveillance Network，CHINET）公布的数据中显示， MRSA 的检出率由2005年的 69.0%逐年下降至2018年的34.0%，说明不管国际还是国内MRSA感染均有明显下降的趋势。然而在笔者所在医院（以下简称我院）MRSA的流行趋势恰好呈现出相反的趋势，从2013年的26.0%逐步上升至2019年的48.2%，呈明显上升趋势，引发本研究团队反思和研究。进一步研究发现，普外科为我院MRSA检出最多的科室。因此，本研究主要以我院MRSA检出最多的科室普外科患者为研究对象，从标本种类、药敏情况、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、耐药基因、毒力基因、生物膜基因、MRSA感染危险因素和预后多方位多角度进行综合性分析，旨在为MRSA感染的预防和控制提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
本研究以在我院普外科从2016年1月到2020年12月住院期间感染MRSA的患者为研究对象。5年间分离培养的非重复SA共119株。根据SA是否对苯唑西林耐药分为2组，分别是对苯唑西林耐药的菌株为MRSA组（n=69），对苯唑西林敏感的菌株则为甲氧西林敏感SA（methicillin-sensitive SA，MSSA）组（n=50）。本研究通过了大足区人民医院伦理委员会的审批。
1.2 方法
1.2.1 细菌的鉴定及药敏测定
依据《全国临床检验操作规程》第4版[10]完成样本的采集和细菌培养，所有细菌均通过梅里埃Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统（法国梅里埃公司）进行鉴定，并采用配套的药敏卡测定SA对常规抗生素的最小抑菌浓度；最后依据美国临床和实验室标准协会制定的微生物临床检验标准进行药敏结果的判读。质控菌株购自卫生部临床检验中心，为SA ATCC29213。
1.2.2 提取DNA模板
使用DNA 试剂提取盒 ［天根生化科技（北京）有限公司］ 完成SA的DNA的提取，相关步骤参照其说明书的方法进行。具体为菌体裂解（收集菌悬液，加入缓冲液GA重悬细菌，并加入溶菌酶，混匀后37 ℃温育60 min，再加入缓冲液GB和蛋白酶K，混匀后70 ℃温育10 min，最后加入100%乙醇，混匀）；DNA与膜结合及纯化，将上述裂解后菌液加入收集管中， 10 000 r/min 离心30 s、r=8 cm（离心速度、时间及半径下同），然后重复2次加入缓冲液GD后离心，再加入灭菌蒸馏水，离心得到DNA； 最后将得到的DNA分装，并保存于–20 ℃备检。
1.2.3 检测 MLST 并构建进化树
MLST是将SA的7个管家基因（分别为arcC、aroE、glpF、Gmk、pta、tpi和yqiL基因）进行PCR扩增，基因引物参照相关文献[11]，反应条件为预变性 94 ℃ 5 min，30次循环（变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 90 s，延伸72 ℃ 90 s），72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。并将PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司双向测序拼接。所得测序结果在MLST官方网站（
1.2.4 耐药、毒力和生物膜基因的PCR检测
将1.2.2项提取的DNA用于PCR扩增，扩增的基因分别为耐药基因 ［包括β-内酰胺类耐药基因mecA、mecC，氨基糖苷类修饰酶基因Aac（6′ ）/Aph（2′ ′ ）、Aph（3） -Ⅲ、ant（4′）- Ⅰ a，四环素类耐药基因tetM和喹诺酮类qnrA］、毒力基因 ［包括杀白细胞素（panton-valentine leukocidin，PVL）基因、纤维蛋白结合蛋白A（fibronectin- binding protein A，FnbA）基因、葡萄球菌肠毒素A （staphylococcal enterotoxin A，SEA）基因、葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）基因和α-溶血素（α-hemolysins，Hla）基因］ 以及生物膜基因 ［包括细胞内黏附素A（intracellular adhesion A，ICAA）基因、葡萄球菌辅助调节因子A（staphylococcal accessory regulators A，SarA）基因和纤维蛋白结合蛋白B（fibronectin-binding protein B，FnbB）基因］；基因扩增引物参照相关文献[10]，反应条件为预变性（94 ℃ 5 min），35次循环（变性94 ℃ 60 s，退火 30 s，延伸72 ℃ 60 s），72 ℃延伸10 min，最后将PCR产物进行电泳和凝胶成像观察。
1.2.5 MRSA 感染相关危险因素分析
MRSA 感染危险因素分析采用病例对照方式进行，查询我院电子病历系统和检验科LIS系统收集MRSA 感染相关危险因素，包括患者年龄、性别、吸烟、饮酒、是否转院、慢性基础疾病、低蛋白血症、创面感染、导管相关感染、尿路感染、肺部感染、腹腔感染、感染前手术史、呼吸机辅助通气、导尿管、引流管、抗菌药物使用史和患者住院时间。
1.3 统计学方法
所有数据分析均使用SPSS 22.0软件进行。 计量资料采用单样本K-S检验验证其是否符合正态分布，符合正态分布者用均数±标准差（
±s）表示，采用两独立样本t检验进行组间比较；计数资料采用率表示，使用成组χ2检验；多因素分析采用logistic回归模型（逐步前进法）进行并计算OR值、95%CI和P值。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MRSA检出率及标本类别分布情况
2016年1月至2020年12月共5年，纳入患者824例，共检出762株非重复SA，其中检出最多的前3个科室依次为：普外科119株（15.62%，119/762），耳鼻喉科98株（12.86%，98/762）和儿科85株（11.15%，85/762）。在普外科检出的119株SA中MRSA 69株，MRSA检出率为57.98%，其中2016–2020年期间每年MRSA检出数和检出率见图1。从送检的119份标本类别看，96份脓液中检出MRSA 58株（48.7%，58/119），11份伤口分泌物中检出MRSA 5株（4.2%，5/119），7份痰液中检出MRSA 4株（3.4%，4/119），3份引流液中检出MRSA 1株（0.8%，1/119），2份血液中检出MRSA 1株（0.8%，1/119）。
图1
示2016–2020年我院普外科MRSA检出数和检出率
2.2 MRSA药敏结果分析
SA药敏结果显示，普外科分离的SA对各类抗生素的耐药情况各异，对青霉素、苯唑西林、头孢西丁和红霉素的耐药率均在75%以上，未发现对奎奴普丁/达福普汀、替考拉宁、利奈唑胺和万古霉素耐药的SA。进一步将MRSA组和MSSA组对比分析发现，2组间青霉素和红霉素的耐药率差异有统计学意义（P<0.05），其余抗生素的耐药率2组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
表1
2016–2020年5年间MRSA对常见抗生素的耐药情况
2.3 MLST结果分析
MLST结果显示：69株MRSA共检出10个ST型别，具体见表2。从表2可见，构成比在10%以上的ST型别有3个，分别是ST88、ST951和ST59，此3个ST型别占全部菌株的84.06%（58/69），未发现新的ST型别。进一步将ST型别构建遗传进化树，可以看出所有MRSA未出现明显聚类现象，见图2。
表2
MRSA等位基因编码和序列型
图2
示MRSA的ST型别进化树
不同颜色的圆圈表示不同标本种类，黄色代表脓液，红色代表痰液，蓝色代表伤口分泌物，绿色代表血液，紫色代表引流液
2.4 MRSA耐药基因、毒力基因和生物膜基因检测结果
MRSA耐药基因、毒力基因和生物膜基因检测结果见表3。由表3可见：耐药基因中所有菌株均携带mecA基因，其次为Aph（3）-Ⅲ基因；毒力基因检出最多的为FnbA基因，其次为Hla基因；生物膜基因检出最多的为SarA基因，其次为ICAA基因。
表3
MRSA耐药基因、毒力基因和生物膜相关基因的检测结果［株（%） ］
2.5 MRSA感染的单因素分析结果
将MRSA感染的相关危险因素先进行单因素分析（采用成组χ2检验），结果见表4。从表4中可见，与MSSA组相比，MRSA组患者在转院、创面感染、引流管和头孢菌素类使用史方面的差异有统计学意义（P<0.05），MRSA组患者的住院时间长于MSSA组（P<0.05），其余危险因素2组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
表4
MRSA感染的单因素分析结果
2.6 MRSA感染的多因素分析结果
进一步将上述单因素分析中P<0.10变量及临床认为有关系的变量纳入多因素分析，其结果（表5）显示，转院、创面感染、导管相关感染、引流管和头孢菌素类使用史是MRSA感染的独立危险因素。
表5
MRSA感染的多因素logistic回归分析结果
3 讨论
MRSA广泛存在于人体呼吸道、消化道、皮肤黏膜等部位，常引起肺部、软组织等部位感染，也是引起社区和医院获得性感染的重要致病菌[13-14]。自第1例MRSA检出后[5]，其感染遍及全球，引起世界各国高度关注，已成为常规监控菌，一经发现，需将患者进行隔离。相关研究[15]显示，SA在急诊科和儿科感染较多见。本研究发现，我院普外科MRSA检出率在所有科室中最高，达57.98%，高于2019年中国CHINET对1 400多家医院监测结果的平均检出率31.4%[9]。故需引起重点关注和研究。
首先，从药敏结果来看，与MSSA组相比，MRSA组对青霉素（100% 比82.00%）、苯唑西林（100%比 0.00%）和头孢西丁（100% 比 0.00%）的耐药率更高，其原因可能是MRSA常常携带mecA基因，而该基因编码的青霉素结合蛋白2a（penicillin binding protein 2a，PBP2a）与β-内酰胺类的亲和力低，引起PBP2a催化细菌合成细胞壁，从而使得MRSA对β-内酰胺类抗生素耐药[16]。这也与MRSA耐药基因mecA检出率为100%相一致。进一步研究发现，2组均未发现对奎奴普丁/达福普汀、替考拉宁、利奈唑胺和万古霉素耐药的SA。故对于MRSA感染，可采用万古霉素或利奈唑胺甚至联合用药的治疗方式。目前，临床上常使用万古霉素通过时间依赖性杀菌的方式治疗严重 MRSA 感染，但该抗生素存在耳毒性和肾毒性不良反应，故需要严格控制血药浓度。在国外已有报道耐万古霉素的SA存在。而利奈唑胺在临床治疗MRSA感染效果显著，是由于其不与其他抗生素发生交叉耐药[17]，临床可考虑联合用药治疗MRSA感染，以防止更高一级抗生素耐药菌的出现。
其次，从遗传特性来看，有研究[11, 16]表明，MRSA流行一般是由少数流行菌株导致的，这些流行菌株可造成一定范围的爆发流行。而及时掌控这些流行菌株的分子特征对于鉴别菌株间的亲缘性具有重要的防控作用。脉冲场凝胶电泳分型可较准确判定某地的流行菌株的同源性，但其耗时长，操作复杂，且不适合多地区对比研究。而MLST通过世界公认的检测其7个管家基因来进行国际间宏观对比研究。本研究中69株MRSA共显示10个ST型别，最多的3个型别分别为ST88占37.68%、ST951占27.54%和ST59占18.84%，与亚洲国家多流行ST88和ST59相一致[18]，而美国以ST1和ST8多见，欧洲国家以ST80多见[19-20]。
再次，MRSA的多重药耐特性和高致病特性与其携带的基因紧密相关[11,16]。从耐药基因携带情况来看，mecA携带率为100%，而mecC携带率为0.00%，说明我院普外科MRSA流行菌株对β-内酰胺类抗生素的耐药为mecA基因引起，与上述药敏结果相一致。MRSA菌对Aac（6′ ）/Aph（2′ ′ ）、Aph（3） -Ⅲ和ant（4′ ）- Ⅰ a与氨基糖苷类相关耐药基因的携带率分别为27.54%、34.78%和18.84%；主要通过产生氨基糖苷乙酰转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶或氨基糖苷核苷转移酶对氨基糖苷类抗生素的氨基或羟基进行修饰，使得这类抗生素与MRSA的核糖体的亲和力降低，从而无法起到抑菌作用[21]。进一步分析发现，对氨基糖苷类耐药基因的携带率高于对庆大霉素的耐药率（11.59%），产生这种现象的原因可能系细菌的异质性耐药所致，部分细菌虽携带耐药基因但体外实验未表现耐药，这可能只是细菌耐药进化的一个阶段，如果在体内抗生素连续压力作用下，这些菌株最终会进化为耐药菌株。从毒力基因来看，在检测的5种毒力基因中， FnbA、Hla和SEB检出率较高，分别为98.55%、94.20%和91.30%。FnbA基因编码的黏附因子FnbA，能加强细菌间的黏附聚集作用，不仅能在MRSA侵袭宿主过程中发挥重要作用，还能封闭细菌识别机体的一些免疫系统位点[22]。Hla是一种重要的外毒素，能破坏红细胞和溶酶体，收缩血管平滑肌，使血管阻滞，血流不畅，造成局部组织缺血坏死[23]。从生物膜基因来看，SarA和ICAA的携带率为97.10%和92.75%，均在90%以上。ICAA是胞间黏附基因操纵子4个功能基因中最常见的一个，其与多糖胞间黏附素（最主要的生物膜基质）紧密相关，在生物膜形成过程中扮演最重要的角色。而葡萄球菌辅助调节子SarA是一种重要的调控因子，可以通过对核酸酶和蛋白酶的活性进行抑制，促进MRSA的黏附而形成生物膜[24]。
本研究通过对MRSA感染的危险因素分析，其结果显示，转院是MRSA感染的独立危险因素，说明在转入我院前，部分患者已经在其他医院感染了MRSA，从而引起我院普外科的高MRSA检出率。故应加强转院患者的监控，及时隔离并进行治疗，减少该菌传播。创面感染也是MRSA感染的独立危险因素，与先前研究结果[25]相似，MRSA在医院的各个环境中大量定植，患者在住院过程中特别是普外科的患者，因创面的存在，大大增加了感染MRSA的概率，加上临床工作者需对患者创面进行反复护理，也增加了感染概率[26]。故普外科应加强院感监测，临床工作者注意手卫生，勤洗手，保持无菌操作，定期进行环境卫生消毒，防止发生交叉感染，从而减少患者创面感染。另外，引流管也是MRSA感染的独立危险因素，引流管是外科常见的侵入性操作，长期的引流使得细菌积聚，增加内源性感染，加上该菌极易形成生物膜而定居在管壁[27]，使得患者容易发生MRSA感染。最后，头孢菌素类使用史是MRSA感染的独立危险因素。患者在手术前一般需要预防性用药，在抗生素的选择压力下，MRSA容易出现。此外，预防性用药使得大部分其他菌被抑制，剩下MRSA成为优势菌，更加促进该菌的大量繁殖。且MRSA感染的患者住院时间更长，增加了患者负担。
综上，我院普外科MRSA检出率高，ST型别以ST88最为常见，耐药、毒力和生物膜相关基因携带率高，转院、创面感染、引流管、头孢菌素类使用史等是MRSA感染的高危因素。临床应减少侵入性操作，合理使用抗生素，注意手卫生，定期进行环境卫生消毒，加强MRSA监测，从而减少和控制MRSA的感染和传播。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：何建春负责数据分析和撰写论文；裴昌贞负责统计临床资料；杨雷和王丹负责PCR扩增实验；陈虹佑负责指导论文撰写和提出研究思路。
伦理声明：本研究已通过重庆市大足区人民医院伦理委员会的审核批准。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是一种革兰阳性球菌，在血平板上易产生透明的β溶血环，其也是典型的导致社区及医院获得性感染的重要条件致病菌[1]。正常人对SA的携带率可达30%～50%，当患者免疫力低下时大量繁殖，引起呼吸道感染、皮肤组织感染、伤口感染、引流管相关感染、血液感染等多样性感染[2-3]，导致患者住院时间延长、治疗费用增加和预后不良[4]。自1959年在欧洲出现耐甲氧西林SA（methicillin-resistant SA，MRSA）以来，MRSA在世界范围内开始流行，成为世界范围内最难解决的感染性疾病之一[5]。由于MRSA具有多重耐药性、毒性大、容易感染且死亡率高等特性，近10年来全球对MRSA进行了严格的监控，使得MRSA的检出率在全球开始呈现出逐步降低的趋势。在美国和一些西方国家的研究报告中发现， MRSA 的检出率呈下降趋势[6-7]。我国，胡付品等[8-9]在中国耐药监测网（China Antimicrobial Surveillance Network，CHINET）公布的数据中显示， MRSA 的检出率由2005年的 69.0%逐年下降至2018年的34.0%，说明不管国际还是国内MRSA感染均有明显下降的趋势。然而在笔者所在医院（以下简称我院）MRSA的流行趋势恰好呈现出相反的趋势，从2013年的26.0%逐步上升至2019年的48.2%，呈明显上升趋势，引发本研究团队反思和研究。进一步研究发现，普外科为我院MRSA检出最多的科室。因此，本研究主要以我院MRSA检出最多的科室普外科患者为研究对象，从标本种类、药敏情况、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、耐药基因、毒力基因、生物膜基因、MRSA感染危险因素和预后多方位多角度进行综合性分析，旨在为MRSA感染的预防和控制提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
本研究以在我院普外科从2016年1月到2020年12月住院期间感染MRSA的患者为研究对象。5年间分离培养的非重复SA共119株。根据SA是否对苯唑西林耐药分为2组，分别是对苯唑西林耐药的菌株为MRSA组（n=69），对苯唑西林敏感的菌株则为甲氧西林敏感SA（methicillin-sensitive SA，MSSA）组（n=50）。本研究通过了大足区人民医院伦理委员会的审批。
1.2 方法
1.2.1 细菌的鉴定及药敏测定
依据《全国临床检验操作规程》第4版[10]完成样本的采集和细菌培养，所有细菌均通过梅里埃Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统（法国梅里埃公司）进行鉴定，并采用配套的药敏卡测定SA对常规抗生素的最小抑菌浓度；最后依据美国临床和实验室标准协会制定的微生物临床检验标准进行药敏结果的判读。质控菌株购自卫生部临床检验中心，为SA ATCC29213。
1.2.2 提取DNA模板
使用DNA 试剂提取盒 ［天根生化科技（北京）有限公司］ 完成SA的DNA的提取，相关步骤参照其说明书的方法进行。具体为菌体裂解（收集菌悬液，加入缓冲液GA重悬细菌，并加入溶菌酶，混匀后37 ℃温育60 min，再加入缓冲液GB和蛋白酶K，混匀后70 ℃温育10 min，最后加入100%乙醇，混匀）；DNA与膜结合及纯化，将上述裂解后菌液加入收集管中， 10 000 r/min 离心30 s、r=8 cm（离心速度、时间及半径下同），然后重复2次加入缓冲液GD后离心，再加入灭菌蒸馏水，离心得到DNA； 最后将得到的DNA分装，并保存于–20 ℃备检。
1.2.3 检测 MLST 并构建进化树
MLST是将SA的7个管家基因（分别为arcC、aroE、glpF、Gmk、pta、tpi和yqiL基因）进行PCR扩增，基因引物参照相关文献[11]，反应条件为预变性 94 ℃ 5 min，30次循环（变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 90 s，延伸72 ℃ 90 s），72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。并将PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司双向测序拼接。所得测序结果在MLST官方网站（
1.2.4 耐药、毒力和生物膜基因的PCR检测
将1.2.2项提取的DNA用于PCR扩增，扩增的基因分别为耐药基因 ［包括β-内酰胺类耐药基因mecA、mecC，氨基糖苷类修饰酶基因Aac（6′ ）/Aph（2′ ′ ）、Aph（3） -Ⅲ、ant（4′）- Ⅰ a，四环素类耐药基因tetM和喹诺酮类qnrA］、毒力基因 ［包括杀白细胞素（panton-valentine leukocidin，PVL）基因、纤维蛋白结合蛋白A（fibronectin- binding protein A，FnbA）基因、葡萄球菌肠毒素A （staphylococcal enterotoxin A，SEA）基因、葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）基因和α-溶血素（α-hemolysins，Hla）基因］ 以及生物膜基因 ［包括细胞内黏附素A（intracellular adhesion A，ICAA）基因、葡萄球菌辅助调节因子A（staphylococcal accessory regulators A，SarA）基因和纤维蛋白结合蛋白B（fibronectin-binding protein B，FnbB）基因］；基因扩增引物参照相关文献[10]，反应条件为预变性（94 ℃ 5 min），35次循环（变性94 ℃ 60 s，退火 30 s，延伸72 ℃ 60 s），72 ℃延伸10 min，最后将PCR产物进行电泳和凝胶成像观察。
1.2.5 MRSA 感染相关危险因素分析
MRSA 感染危险因素分析采用病例对照方式进行，查询我院电子病历系统和检验科LIS系统收集MRSA 感染相关危险因素，包括患者年龄、性别、吸烟、饮酒、是否转院、慢性基础疾病、低蛋白血症、创面感染、导管相关感染、尿路感染、肺部感染、腹腔感染、感染前手术史、呼吸机辅助通气、导尿管、引流管、抗菌药物使用史和患者住院时间。
1.3 统计学方法
所有数据分析均使用SPSS 22.0软件进行。 计量资料采用单样本K-S检验验证其是否符合正态分布，符合正态分布者用均数±标准差（±s）表示，采用两独立样本t检验进行组间比较；计数资料采用率表示，使用成组χ2检验；多因素分析采用logistic回归模型（逐步前进法）进行并计算OR值、95%CI和P值。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MRSA检出率及标本类别分布情况
2016年1月至2020年12月共5年，纳入患者824例，共检出762株非重复SA，其中检出最多的前3个科室依次为：普外科119株（15.62%，119/762），耳鼻喉科98株（12.86%，98/762）和儿科85株（11.15%，85/762）。在普外科检出的119株SA中MRSA 69株，MRSA检出率为57.98%，其中2016–2020年期间每年MRSA检出数和检出率见图1。从送检的119份标本类别看，96份脓液中检出MRSA 58株（48.7%，58/119），11份伤口分泌物中检出MRSA 5株（4.2%，5/119），7份痰液中检出MRSA 4株（3.4%，4/119），3份引流液中检出MRSA 1株（0.8%，1/119），2份血液中检出MRSA 1株（0.8%，1/119）。
图1
示2016–2020年我院普外科MRSA检出数和检出率
2.2 MRSA药敏结果分析
SA药敏结果显示，普外科分离的SA对各类抗生素的耐药情况各异，对青霉素、苯唑西林、头孢西丁和红霉素的耐药率均在75%以上，未发现对奎奴普丁/达福普汀、替考拉宁、利奈唑胺和万古霉素耐药的SA。进一步将MRSA组和MSSA组对比分析发现，2组间青霉素和红霉素的耐药率差异有统计学意义（P<0.05），其余抗生素的耐药率2组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
表1
2016–2020年5年间MRSA对常见抗生素的耐药情况
2.3 MLST结果分析
MLST结果显示：69株MRSA共检出10个ST型别，具体见表2。从表2可见，构成比在10%以上的ST型别有3个，分别是ST88、ST951和ST59，此3个ST型别占全部菌株的84.06%（58/69），未发现新的ST型别。进一步将ST型别构建遗传进化树，可以看出所有MRSA未出现明显聚类现象，见图2。
表2
MRSA等位基因编码和序列型
图2
示MRSA的ST型别进化树
不同颜色的圆圈表示不同标本种类，黄色代表脓液，红色代表痰液，蓝色代表伤口分泌物，绿色代表血液，紫色代表引流液
2.4 MRSA耐药基因、毒力基因和生物膜基因检测结果
MRSA耐药基因、毒力基因和生物膜基因检测结果见表3。由表3可见：耐药基因中所有菌株均携带mecA基因，其次为Aph（3）-Ⅲ基因；毒力基因检出最多的为FnbA基因，其次为Hla基因；生物膜基因检出最多的为SarA基因，其次为ICAA基因。
表3
MRSA耐药基因、毒力基因和生物膜相关基因的检测结果［株（%） ］
2.5 MRSA感染的单因素分析结果
将MRSA感染的相关危险因素先进行单因素分析（采用成组χ2检验），结果见表4。从表4中可见，与MSSA组相比，MRSA组患者在转院、创面感染、引流管和头孢菌素类使用史方面的差异有统计学意义（P<0.05），MRSA组患者的住院时间长于MSSA组（P<0.05），其余危险因素2组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
表4
MRSA感染的单因素分析结果
2.6 MRSA感染的多因素分析结果
进一步将上述单因素分析中P<0.10变量及临床认为有关系的变量纳入多因素分析，其结果（表5）显示，转院、创面感染、导管相关感染、引流管和头孢菌素类使用史是MRSA感染的独立危险因素。
表5
MRSA感染的多因素logistic回归分析结果
3 讨论
MRSA广泛存在于人体呼吸道、消化道、皮肤黏膜等部位，常引起肺部、软组织等部位感染，也是引起社区和医院获得性感染的重要致病菌[13-14]。自第1例MRSA检出后[5]，其感染遍及全球，引起世界各国高度关注，已成为常规监控菌，一经发现，需将患者进行隔离。相关研究[15]显示，SA在急诊科和儿科感染较多见。本研究发现，我院普外科MRSA检出率在所有科室中最高，达57.98%，高于2019年中国CHINET对1 400多家医院监测结果的平均检出率31.4%[9]。故需引起重点关注和研究。
首先，从药敏结果来看，与MSSA组相比，MRSA组对青霉素（100% 比82.00%）、苯唑西林（100%比 0.00%）和头孢西丁（100% 比 0.00%）的耐药率更高，其原因可能是MRSA常常携带mecA基因，而该基因编码的青霉素结合蛋白2a（penicillin binding protein 2a，PBP2a）与β-内酰胺类的亲和力低，引起PBP2a催化细菌合成细胞壁，从而使得MRSA对β-内酰胺类抗生素耐药[16]。这也与MRSA耐药基因mecA检出率为100%相一致。进一步研究发现，2组均未发现对奎奴普丁/达福普汀、替考拉宁、利奈唑胺和万古霉素耐药的SA。故对于MRSA感染，可采用万古霉素或利奈唑胺甚至联合用药的治疗方式。目前，临床上常使用万古霉素通过时间依赖性杀菌的方式治疗严重 MRSA 感染，但该抗生素存在耳毒性和肾毒性不良反应，故需要严格控制血药浓度。在国外已有报道耐万古霉素的SA存在。而利奈唑胺在临床治疗MRSA感染效果显著，是由于其不与其他抗生素发生交叉耐药[17]，临床可考虑联合用药治疗MRSA感染，以防止更高一级抗生素耐药菌的出现。
其次，从遗传特性来看，有研究[11, 16]表明，MRSA流行一般是由少数流行菌株导致的，这些流行菌株可造成一定范围的爆发流行。而及时掌控这些流行菌株的分子特征对于鉴别菌株间的亲缘性具有重要的防控作用。脉冲场凝胶电泳分型可较准确判定某地的流行菌株的同源性，但其耗时长，操作复杂，且不适合多地区对比研究。而MLST通过世界公认的检测其7个管家基因来进行国际间宏观对比研究。本研究中69株MRSA共显示10个ST型别，最多的3个型别分别为ST88占37.68%、ST951占27.54%和ST59占18.84%，与亚洲国家多流行ST88和ST59相一致[18]，而美国以ST1和ST8多见，欧洲国家以ST80多见[19-20]。
再次，MRSA的多重药耐特性和高致病特性与其携带的基因紧密相关[11,16]。从耐药基因携带情况来看，mecA携带率为100%，而mecC携带率为0.00%，说明我院普外科MRSA流行菌株对β-内酰胺类抗生素的耐药为mecA基因引起，与上述药敏结果相一致。MRSA菌对Aac（6′ ）/Aph（2′ ′ ）、Aph（3） -Ⅲ和ant（4′ ）- Ⅰ a与氨基糖苷类相关耐药基因的携带率分别为27.54%、34.78%和18.84%；主要通过产生氨基糖苷乙酰转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶或氨基糖苷核苷转移酶对氨基糖苷类抗生素的氨基或羟基进行修饰，使得这类抗生素与MRSA的核糖体的亲和力降低，从而无法起到抑菌作用[21]。进一步分析发现，对氨基糖苷类耐药基因的携带率高于对庆大霉素的耐药率（11.59%），产生这种现象的原因可能系细菌的异质性耐药所致，部分细菌虽携带耐药基因但体外实验未表现耐药，这可能只是细菌耐药进化的一个阶段，如果在体内抗生素连续压力作用下，这些菌株最终会进化为耐药菌株。从毒力基因来看，在检测的5种毒力基因中， FnbA、Hla和SEB检出率较高，分别为98.55%、94.20%和91.30%。FnbA基因编码的黏附因子FnbA，能加强细菌间的黏附聚集作用，不仅能在MRSA侵袭宿主过程中发挥重要作用，还能封闭细菌识别机体的一些免疫系统位点[22]。Hla是一种重要的外毒素，能破坏红细胞和溶酶体，收缩血管平滑肌，使血管阻滞，血流不畅，造成局部组织缺血坏死[23]。从生物膜基因来看，SarA和ICAA的携带率为97.10%和92.75%，均在90%以上。ICAA是胞间黏附基因操纵子4个功能基因中最常见的一个，其与多糖胞间黏附素（最主要的生物膜基质）紧密相关，在生物膜形成过程中扮演最重要的角色。而葡萄球菌辅助调节子SarA是一种重要的调控因子，可以通过对核酸酶和蛋白酶的活性进行抑制，促进MRSA的黏附而形成生物膜[24]。
本研究通过对MRSA感染的危险因素分析，其结果显示，转院是MRSA感染的独立危险因素，说明在转入我院前，部分患者已经在其他医院感染了MRSA，从而引起我院普外科的高MRSA检出率。故应加强转院患者的监控，及时隔离并进行治疗，减少该菌传播。创面感染也是MRSA感染的独立危险因素，与先前研究结果[25]相似，MRSA在医院的各个环境中大量定植，患者在住院过程中特别是普外科的患者，因创面的存在，大大增加了感染MRSA的概率，加上临床工作者需对患者创面进行反复护理，也增加了感染概率[26]。故普外科应加强院感监测，临床工作者注意手卫生，勤洗手，保持无菌操作，定期进行环境卫生消毒，防止发生交叉感染，从而减少患者创面感染。另外，引流管也是MRSA感染的独立危险因素，引流管是外科常见的侵入性操作，长期的引流使得细菌积聚，增加内源性感染，加上该菌极易形成生物膜而定居在管壁[27]，使得患者容易发生MRSA感染。最后，头孢菌素类使用史是MRSA感染的独立危险因素。患者在手术前一般需要预防性用药，在抗生素的选择压力下，MRSA容易出现。此外，预防性用药使得大部分其他菌被抑制，剩下MRSA成为优势菌，更加促进该菌的大量繁殖。且MRSA感染的患者住院时间更长，增加了患者负担。
综上，我院普外科MRSA检出率高，ST型别以ST88最为常见，耐药、毒力和生物膜相关基因携带率高，转院、创面感染、引流管、头孢菌素类使用史等是MRSA感染的高危因素。临床应减少侵入性操作，合理使用抗生素，注意手卫生，定期进行环境卫生消毒，加强MRSA监测，从而减少和控制MRSA的感染和传播。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：何建春负责数据分析和撰写论文；裴昌贞负责统计临床资料；杨雷和王丹负责PCR扩增实验；陈虹佑负责指导论文撰写和提出研究思路。
伦理声明：本研究已通过重庆市大足区人民医院伦理委员会的审核批准。
