引用本文： 赵帅华, 张先舟, 蒙博, 曹胜利. 肝内胆管癌组织胆汁酸G蛋白偶联受体5和热休克蛋白75表达及与预后的关系. 中国普外基础与临床杂志, 2022, 29(2): 218-225. doi: 10.7507/1007-9424.202104073 复制
肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是第二常见的原发性肝脏恶性肿瘤，起源于肝内胆管上皮细胞，生长在肝内二级分支胆管以上部位，占所有原发性肝癌的 10%～15%，且其发病率在全球范围内持续攀升[1-2]。ICC 与肝细胞肝癌的临床表现有较大区别，以早期淋巴结及肝内转移为特征，其侵袭转移能力更强。目前手术切除仍是 ICC 的首选且最有效的治疗方法，但即使能够手术切除肿瘤的患者，由于术后早期复发、肿瘤生长迅速、远处转移等因素，患者预后较差，患者 3 年及5 年生存率只有 30% 和 18%[3-4]。因此，探寻 ICC 细胞侵袭转移的关键分子对筛查及防治肿瘤复发和改善治疗效果具有重要的临床意义。胆汁酸 G 蛋白偶联受体 5（takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5）也被称为 G 蛋白耦联胆汁酸受体 1（G-protein-coupled bile acid receptor 1，GPBAR1），是 G 蛋白偶联受体家族的成员，在机体内广泛表达，在肝脏、肠道和免疫细胞中表达较高[5]。TGR5 能被胆汁酸激活，其激活后具有多种生物学功能，在调节糖类、脂类、能量代谢以及胆汁代谢中发挥重要作用[6]。已有研究[7]证实，TGR5 参与消化系统恶性肿瘤的发生，可作为消化系统恶性肿瘤的潜在治疗靶点。热休克蛋白 75 是热休克蛋白 70 家族蛋白的一种，广泛存在于细胞器内，具有调节细胞分化及肿瘤发展的作用[8]。有研究[9]发现，热休克蛋白 75 在乳腺癌、肝癌和膀胱癌中呈高表达，且具有癌基因特征，与肿瘤的发生发展密切相关。在胆管癌的研究中发现，TGR5 通过结合并上调热休克蛋白 75 促进胆管癌细胞增殖[10]，推测 TGR5 与热休克蛋白 75 可能与 ICC 的预后有关。本研究探讨了 TGR5 和热休克蛋白 75 与 ICC 患者病理特征及预后的关系，为探寻 ICC 的筛查和预后评估相关的生物学指标提供依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取 2015 年 3 月至 2018 年 3 月期间濮阳市安阳地区医院收治住院并行手术治疗的 ICC 患者 94 例作为研究对象，其中男 61 例，女 33 例；年龄 50～69 岁，中位年龄 60 岁；肿瘤直径≥5 cm 27 例，<5 cm 67 例；肿瘤位于肝左叶 40 例，肝右叶 27 例，横跨肝左右叶 27 例。按照 WHO 病理分级标准[11]，高分化 17 例，中分化 46 例，低分化 31 例；TNM 分期：Ⅰ期 25 例，Ⅱ期 31 例，Ⅲ期 28 例，Ⅳ期 10 例；46 例有淋巴结转移，神经受累 17 例，微血管侵犯 11 例，20 例存在肿瘤卫星灶，18 例伴肝硬变。病例纳入标准：① 完整切除肿物，经术后病理学检查证实为 ICC，切缘阴性患者；② 临床病理资料完整，所有患者术前均未行放化疗、免疫疗法、中医中药等治疗；③ 患者及家属均知情同意并签署知情同意书；④ 随访信息完整。排除标准：① 其他部位胆管癌转移至肝内及合并肝细胞癌患者；② 术前肿瘤自发性破裂；③ 入院前有抗肿瘤治疗史；④ 严重心肝肾功能不全者。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》的相关要求。
1.2 主要试剂与仪器
TGR5 一抗（武汉益普生物科技有限公司，货号：ATA38633），热休克蛋白 75 一抗（北京安诺论生物科技有限公司，货号：APR07835G），SP 免疫组织化学试剂盒（上海瑞楚生物科技有限公司，货号：R200821），DAB 显色剂（上海煊雅生物科技有限公司，货号：XY-MY-0075），BCA 试剂盒、SDS-PAGE 胶制备试剂盒（上海信裕生物科技有限公司，货号：XY12001A、ZD304-01），半干式电转膜仪（北京赛百奥科技有限公司），化学发光仪（济南欧莱博电子商务有限公司，型号：CIA1800）。
1.3 研究方法
1.3.1 样本的采集与保存
ICC 患者经手术切除ICC组织，同时取其对应的癌旁组织（距肿瘤边缘 2 cm 以上且病理检查未发现癌细胞），组织标本取出后先切取约 1.0 cm 见方的组织块置入 15 mL 中性甲醛液中固定约 12 h，实验脱水剂将样本脱水，后将组织样本用石蜡包埋切片、HE 染色，经病理专家复诊及组织定位后，再用切片机连续切片，厚度为 4 μm，制作成组织切片保存于液氮罐中储存备用。切取后剩余的组织标本立即置入 –80 ℃ 冰箱冻存备用。
1.3.2 癌组织及其癌旁组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达检测
采用免疫组织化学（EnVision）SP 法。取 1.3.1 制备的石蜡切片，常规脱蜡至水，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行，DAB 显色后在显微镜下控制显色强度，并苏木精复染，脱水、封片，最后镜检采集数据。以 PBS 代替一抗作为阴性对照，试剂公司提供的阳性着色图片为阳性对照。染色结果由两位对病理资料不知情的病理科医师进行判定，TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 阳性表达评定标准参照文献 [12] 的定性法进行评定，即于光镜下随机选取 5 个视野（200 倍），以每个视野计数 100 个癌细胞为基数，按照阳性细胞所占百分比进行评分：阳性细胞占比≤10% 为 1 分，10%～50% 为 2 分，50%～75% 为 3 分，≥75% 为 4 分；按染色强度评分：镜下观察胆管上皮细胞细胞质和细胞核内出现棕黄色或褐色颗粒，其中浅黄色为 1 分，棕黄色为 2 分，棕褐色为 3 分；最后以两项评分的乘积作为最终判定结果，0～2 分判为阴性，≥3 分判为阳性。
1.3.3 Western blot（WB）法检测癌组织及其癌旁组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 相对表达量
取 1.3.1 中冻存样本，严格按照蛋白提取试剂盒说明书提取组织总蛋白，并采用 BCA 试剂盒检测蛋白浓度，取 20 μL 样品上样，使用 SDS-PAGE 胶电泳分离蛋白，半干式电转膜仪转移蛋白至 PVDF 膜上，脱脂奶粉封闭，加入 TGR5（稀释比 1∶2 000）、热休克蛋白 75（稀释比 1∶2 000）和 GAPDH 内参抗体（稀释比 1∶3 000），4 ℃ 孵育过夜，加入二抗 IgG（稀释比 1∶5 000），室温孵育 2 h，用增强化学发光法显色，以化学发光仪观察条带并拍照，并以 Image-J 软件分析各组蛋白相对表达量。
1.4 随访
纳入本研究的患者术后均进行常规随访，术后 1 年内每 3 个月随访 1 次，1 年后每 6 个月随访 1 次，随访时进行相关实验室及影像学检查，主要通过腹部 CT 和 MRI 检查诊断复发。如患者出现复发，则采用手术切除、局部放射治疗、全身化学治疗、动脉栓塞等措施控制病情发展。随访截止日期为 2021 年 3 月 31 日，以术后生存情况作为终点事件，将生存患者作为预后良好组，将死亡患者作为预后不良组进行分析。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 21.0 统计学软件进行统计学分析。计数资料比较采用配对样本或成组样本χ2检验；计量资料符合正态分布，组间比较采用配对样本 t 检验。绘制 Kaplan-Meier 生存曲线并行 log-rank 检验，分析 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达与 ICC 患者预后的关系；采用多因素 Cox 比例风险回归模型分析 ICC 患者不良预后的危险因素；ROC 曲线分析 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达对 ICC 患者预后的诊断价值，曲线下面积（AUC）比较行Z检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 ICC 癌组织及其癌旁组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 的表达情况
免疫组织化学结果显示，TGR5 蛋白阳性表达主要定位于细胞膜和细胞质，热休克蛋白 75 阳性表达主要定位于细胞质中，均呈浅黄色或棕褐色颗粒状（图 1a～1d）。按照染色评分标准评价 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 的免疫评分，发现 ICC 癌旁组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 未表达或阳性表达较少，其表达阳性率分别为 13.83%（13/94）和 11.70%（11/94）；在癌组织中 TGR5 蛋白表达阳性率为 79.79%（75/94），热休克蛋白 75 表达阳性率为 84.04%（79/94），均高于癌旁组织中的表达（χ2=82.122，P<0.001；χ2=98.561，P<0.001）。WB 结果（图 1e、1f）显示：癌组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 相对表达量高于癌旁组织（P<0.05）。
图1
示 ICC 癌组织及其癌旁组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达检测结果
a、b：分别示癌旁组织（a）和 ICC 癌组织（b）中 TGR5 蛋白表达结果（免疫组织化学 SP ×200）；c、d：分别示癌旁组织（c）和 ICC 癌组织（d）中热休克蛋白 75 表达结果（免疫组织化学 SP ×200）；e、f：示 WB 法检测 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达的电泳图（e）及其定量结果（f），e 图中 1 代表癌组织，2 代表癌旁组织
2.2 ICC 癌组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达情况与患者临床病理特征的关系
ICC 癌组织中 TGR5 蛋白的表达状态与患者年龄、肿瘤部位、淋巴结转移、神经受累和微血管侵犯无关（P>0.05），但与患者性别、肿瘤直径、分化程度、TNM 分期、卫星灶和肝硬变相关（P<0.05）。ICC 癌组织中热休克蛋白 75 的表达状态与患者性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移和微血管侵犯无关（P>0.05），但与肿瘤直径、TNM 分期、神经受累、卫星灶和肝硬变相关（P<0.05）。见表 1。
表1
ICC 癌组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达与患者临床病理特征的关系（例）
2.3 不同预后情况 ICC 患者的 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达情况及其临床病理特征
根据随访结果将本组 94 例 ICC 患者分为预后不良组（已死亡者，58 例）和预后良好组（仍生存者，36 例），分析 2 组患者的 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达情况及其临床病理特征，结果见表 2。由表 2 可见，2 组患者在年龄、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移和神经受累方面比较其差异无统计学意义（P>0.05），而 2 组患者在性别、肿瘤直径、TNM 分期、微血管侵犯、卫星灶、肝硬变以及 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达情况方面比较差有统计学意义（P<0.05）。
表2
不同预后情况 ICC 患者的 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达情况及其临床病理特征比较（例）
进一步绘制 Kaplan-Meier 生存曲线分析 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 的表达与 ICC 患者预后的关系，结果显示 TGR5 蛋白表达阳性者的累积 3 年总生存率（32.00%）低于 TGR5 蛋白表达阴性者（63.16%），χ2=6.228，P=0.013；热休克蛋白 75 表达阳性者的累积 3 年总生存率（32.91%）也低于热休克蛋白 75 表达阴性者（66.67%），χ2=6.079，P=0.014。具体见图 2a、2b。
图2
示 ICC 癌组织中 TGR5 蛋白（a）和热休克蛋白 75（b）不同表达状态患者的生存曲线，以及 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达水平对 ICC 患者预后诊断的 ROC 曲线（c）
2.4 多因素 Cox 比例风险回归模型分析 ICC 患者预后不良的危险因素
以预后作为应变量（预后不良=1，预后良好=0），以 TGR5 蛋白、热休克蛋白 75、TNM 分期、淋巴结转移、卫星灶、肝硬变为自变量进行多因素 Cox 比例风险回归模型分析，其结果显示：TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达阳性、TNM Ⅲ+Ⅳ期、有卫星灶和肝硬变为 ICC 患者预后不良的危险因素（P<0.05），见表 3。
表3
多因素 Cox 比例风险回归模型分析 ICC 患者预后不良的危险因素
2.5 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达水平对 ICC 预后的诊断价值
以癌组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达水平绘制 ROC 曲线，约登指数最大值时对应的值为截断值。其结果显示：以 TGR5 蛋白表达水平 0.932 为截断值，其诊断 ICC 患者预后不良的AUC为 0.783，95%CI为（0.691，0.874），P<0.001，敏感度为 72.4%，特异度为 72.2%；以热休克蛋白 75 表达水平 0.756 为截断值，其诊断 ICC 患者预后不良的AUC为 0.805，95%CI为（0.717，0.892），P<0.001，敏感度为 84.4%，特异度为 63.9%；二者联合诊断 ICC 患者预后不良的AUC为 0.884，95%CI为（0.818，0.949），P<0.001，敏感度为 79.3%，特异度为 83.3%；二者联合诊断 ICC 患者预后不良的AUC高于 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 单独诊断者（Z=2.848、P=0.004；Z=2.326、P=0.020），具体见图 2c。
3 讨论
ICC 是一种高度恶性的原发性肝脏恶性肿瘤，多数 ICC 患者缺乏典型症状，常在体检进行影像学检查时发现肝内占位性病变[13]，在肝硬变肝脏中，ICC 的鉴别诊断相对困难。随着筛查项目的改进及医疗水平的提高，ICC 的诊断率有所提高。根治性肿瘤切除是帮助 ICC 患者获得长期生存最有效的治疗手段。病因学和流行病学研究[14]显示，肝硬变、病毒性肝炎（乙肝、丙肝）、原发性硬化性胆管炎及肝内胆管结石可作为 ICC 的高危风险因素。ICC 主要通过淋巴系统进行肿瘤远处播散，有研究[15]发现，肿瘤分化程度、肿瘤直径等对患者总体预后评价具有一定的临床价值，但仅以其评估患者预后较片面，且由于病因、治疗等情况的不同，临床预后有所差异。因此，寻找能更客观、更简便的评估 ICC 患者预后的生物学指标，对治疗方案的制定及预后情况的改善十分重要。
TGR5 受体由 330 个氨基酸组成，包括 7 个跨膜结构域，基因定位于人染色体 2q35，在静息状态下由 α、β 和 γ 亚基组成，一旦与胆汁酸结合后，分离的 α 蛋白亚基激活腺苷酸环化酶（AC），诱导环磷酸腺苷（cAMP）产生增加，激活蛋白激酶 A（PKA）途径及下游信号通路[16-18]。在胃腺癌研究[19]中发现，TGR5 在大部分胃肠型腺癌中过表达，且其在细胞膜和细胞质内中度到强度表达与胃腺癌患者生存率下降有关。TGR5 在 ICC 中的研究较少，本研究免疫组织化学染色结果显示，ICC 癌组织中 TGR5 蛋白表达阳性率为 79.79%，高于在癌旁组织中的表达；WB 检测结果显示，ICC 癌组织中 TGR5 蛋白相对表达量高于癌旁组织，提示 TGR5 可能与 ICC 的发生有关，是 ICC 癌组织演变中的重要因子。
热休克蛋白 75 作为一种线粒体常驻蛋白，分子量约为 74×103，编码基因定位于人染色体 5q31.1，具有 46 个氨基酸，热休克蛋白 75 与热激活蛋白具有高度相似序列，被归为热休克蛋白 70 家族伴侣蛋白成员之一[20-22]。热休克蛋白 75 具有蛋白质修饰、免疫应答、参与胞内运输、受体的内化等功能[23]。有研究[24]显示，热休克蛋白 75 参与了细胞生长周期的调控、外界应激、肿瘤发生等多种生物学过程，在多种恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤转移密切相关。在结直肠癌中的研究[25]发现，热休克蛋白 75 的高表达与患者预后不良密切相关。另有研究[26]发现，肝癌患者术后早期复发与无复发患者相比，热休克蛋白 75 表达增高，热休克蛋白 75 高表达与肝癌的 TNM 分期及静脉浸润密切相关。本研究结果显示，ICC 癌组织中热休克蛋白 75 蛋白表达阳性率高于癌旁组织；WB 检测结果显示，癌组织中热休克蛋白 75 蛋白相对表达量也高于癌旁组织，提示热休克蛋白 75 可能与 ICC 的发生有关，热休克蛋白 75 可能作为“分子伴侣”参与调节和稳定癌细胞的异常增殖过程。
另外，本研究结果还显示，预后不良组和预后良好组 ICC 患者在性别、肿瘤直径、TNM 分期、微血管侵犯、卫星灶、肝硬变以及 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达情况方面比较差异均有统计学意义，提示肿瘤直径>5 cm 患者预后不良风险较大，肿瘤直径大小与手术切缘及淋巴结转移情况有关，从而对患者预后产生影响。Kaplan-Meier 生存曲线显示，TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达阳性患者的累积 3 年总生存率均低于 TGR5 蛋白及热休克蛋白 75 表达阴性患者；进一步进行多因素 Cox 比例风险回归模型分析显示，TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达阳性、TNM Ⅲ+Ⅳ期以及有卫星灶和肝硬变均为 ICC 患者预后不良的危险因素，提示 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达可作为对 ICC 患者预后不良预测的辅助指标。另 ROC 结果显示，TGR5 蛋白表达水平诊断 ICC 患者预后不良的AUC为 0.783，热休克蛋白 75 表达水平诊断 ICC 患者预后不良的AUC为 0.805，二者联合诊断的AUC为 0.884，联合诊断价值高于二者单独诊断，提示二者联合诊断对 ICC 患者预后不良具有一定预测价值，可作为预测 ICC 患者预后不良情况的潜在生物学指标。
综上所述，ICC 癌组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 高表达，是 ICC 患者预后不良的危险因素，并对预后具有一定的预测价值。但本研究结果仅能得出癌组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 的表达可能与 ICC 的发生有关，二者与 ICC 发生的因果关系尚不能明确，在今后的研究中需将其作为重点继续探讨。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：赵帅华负责本研究的设计、试验、数据统计及论文写作；张先舟、蒙博和曹胜利共同参与完成本研究的设计、试验、数据统计及论文修改。
伦理声明：该研究通过了濮阳市安阳地区医院伦理委员会的审批（批文编号：20190315-7526）
肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是第二常见的原发性肝脏恶性肿瘤，起源于肝内胆管上皮细胞，生长在肝内二级分支胆管以上部位，占所有原发性肝癌的 10%～15%，且其发病率在全球范围内持续攀升[1-2]。ICC 与肝细胞肝癌的临床表现有较大区别，以早期淋巴结及肝内转移为特征，其侵袭转移能力更强。目前手术切除仍是 ICC 的首选且最有效的治疗方法，但即使能够手术切除肿瘤的患者，由于术后早期复发、肿瘤生长迅速、远处转移等因素，患者预后较差，患者 3 年及5 年生存率只有 30% 和 18%[3-4]。因此，探寻 ICC 细胞侵袭转移的关键分子对筛查及防治肿瘤复发和改善治疗效果具有重要的临床意义。胆汁酸 G 蛋白偶联受体 5（takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5）也被称为 G 蛋白耦联胆汁酸受体 1（G-protein-coupled bile acid receptor 1，GPBAR1），是 G 蛋白偶联受体家族的成员，在机体内广泛表达，在肝脏、肠道和免疫细胞中表达较高[5]。TGR5 能被胆汁酸激活，其激活后具有多种生物学功能，在调节糖类、脂类、能量代谢以及胆汁代谢中发挥重要作用[6]。已有研究[7]证实，TGR5 参与消化系统恶性肿瘤的发生，可作为消化系统恶性肿瘤的潜在治疗靶点。热休克蛋白 75 是热休克蛋白 70 家族蛋白的一种，广泛存在于细胞器内，具有调节细胞分化及肿瘤发展的作用[8]。有研究[9]发现，热休克蛋白 75 在乳腺癌、肝癌和膀胱癌中呈高表达，且具有癌基因特征，与肿瘤的发生发展密切相关。在胆管癌的研究中发现，TGR5 通过结合并上调热休克蛋白 75 促进胆管癌细胞增殖[10]，推测 TGR5 与热休克蛋白 75 可能与 ICC 的预后有关。本研究探讨了 TGR5 和热休克蛋白 75 与 ICC 患者病理特征及预后的关系，为探寻 ICC 的筛查和预后评估相关的生物学指标提供依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取 2015 年 3 月至 2018 年 3 月期间濮阳市安阳地区医院收治住院并行手术治疗的 ICC 患者 94 例作为研究对象，其中男 61 例，女 33 例；年龄 50～69 岁，中位年龄 60 岁；肿瘤直径≥5 cm 27 例，<5 cm 67 例；肿瘤位于肝左叶 40 例，肝右叶 27 例，横跨肝左右叶 27 例。按照 WHO 病理分级标准[11]，高分化 17 例，中分化 46 例，低分化 31 例；TNM 分期：Ⅰ期 25 例，Ⅱ期 31 例，Ⅲ期 28 例，Ⅳ期 10 例；46 例有淋巴结转移，神经受累 17 例，微血管侵犯 11 例，20 例存在肿瘤卫星灶，18 例伴肝硬变。病例纳入标准：① 完整切除肿物，经术后病理学检查证实为 ICC，切缘阴性患者；② 临床病理资料完整，所有患者术前均未行放化疗、免疫疗法、中医中药等治疗；③ 患者及家属均知情同意并签署知情同意书；④ 随访信息完整。排除标准：① 其他部位胆管癌转移至肝内及合并肝细胞癌患者；② 术前肿瘤自发性破裂；③ 入院前有抗肿瘤治疗史；④ 严重心肝肾功能不全者。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》的相关要求。
1.2 主要试剂与仪器
TGR5 一抗（武汉益普生物科技有限公司，货号：ATA38633），热休克蛋白 75 一抗（北京安诺论生物科技有限公司，货号：APR07835G），SP 免疫组织化学试剂盒（上海瑞楚生物科技有限公司，货号：R200821），DAB 显色剂（上海煊雅生物科技有限公司，货号：XY-MY-0075），BCA 试剂盒、SDS-PAGE 胶制备试剂盒（上海信裕生物科技有限公司，货号：XY12001A、ZD304-01），半干式电转膜仪（北京赛百奥科技有限公司），化学发光仪（济南欧莱博电子商务有限公司，型号：CIA1800）。
1.3 研究方法
1.3.1 样本的采集与保存
ICC 患者经手术切除ICC组织，同时取其对应的癌旁组织（距肿瘤边缘 2 cm 以上且病理检查未发现癌细胞），组织标本取出后先切取约 1.0 cm 见方的组织块置入 15 mL 中性甲醛液中固定约 12 h，实验脱水剂将样本脱水，后将组织样本用石蜡包埋切片、HE 染色，经病理专家复诊及组织定位后，再用切片机连续切片，厚度为 4 μm，制作成组织切片保存于液氮罐中储存备用。切取后剩余的组织标本立即置入 –80 ℃ 冰箱冻存备用。
1.3.2 癌组织及其癌旁组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达检测
采用免疫组织化学（EnVision）SP 法。取 1.3.1 制备的石蜡切片，常规脱蜡至水，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行，DAB 显色后在显微镜下控制显色强度，并苏木精复染，脱水、封片，最后镜检采集数据。以 PBS 代替一抗作为阴性对照，试剂公司提供的阳性着色图片为阳性对照。染色结果由两位对病理资料不知情的病理科医师进行判定，TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 阳性表达评定标准参照文献 [12] 的定性法进行评定，即于光镜下随机选取 5 个视野（200 倍），以每个视野计数 100 个癌细胞为基数，按照阳性细胞所占百分比进行评分：阳性细胞占比≤10% 为 1 分，10%～50% 为 2 分，50%～75% 为 3 分，≥75% 为 4 分；按染色强度评分：镜下观察胆管上皮细胞细胞质和细胞核内出现棕黄色或褐色颗粒，其中浅黄色为 1 分，棕黄色为 2 分，棕褐色为 3 分；最后以两项评分的乘积作为最终判定结果，0～2 分判为阴性，≥3 分判为阳性。
1.3.3 Western blot（WB）法检测癌组织及其癌旁组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 相对表达量
取 1.3.1 中冻存样本，严格按照蛋白提取试剂盒说明书提取组织总蛋白，并采用 BCA 试剂盒检测蛋白浓度，取 20 μL 样品上样，使用 SDS-PAGE 胶电泳分离蛋白，半干式电转膜仪转移蛋白至 PVDF 膜上，脱脂奶粉封闭，加入 TGR5（稀释比 1∶2 000）、热休克蛋白 75（稀释比 1∶2 000）和 GAPDH 内参抗体（稀释比 1∶3 000），4 ℃ 孵育过夜，加入二抗 IgG（稀释比 1∶5 000），室温孵育 2 h，用增强化学发光法显色，以化学发光仪观察条带并拍照，并以 Image-J 软件分析各组蛋白相对表达量。
1.4 随访
纳入本研究的患者术后均进行常规随访，术后 1 年内每 3 个月随访 1 次，1 年后每 6 个月随访 1 次，随访时进行相关实验室及影像学检查，主要通过腹部 CT 和 MRI 检查诊断复发。如患者出现复发，则采用手术切除、局部放射治疗、全身化学治疗、动脉栓塞等措施控制病情发展。随访截止日期为 2021 年 3 月 31 日，以术后生存情况作为终点事件，将生存患者作为预后良好组，将死亡患者作为预后不良组进行分析。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 21.0 统计学软件进行统计学分析。计数资料比较采用配对样本或成组样本χ2检验；计量资料符合正态分布，组间比较采用配对样本 t 检验。绘制 Kaplan-Meier 生存曲线并行 log-rank 检验，分析 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达与 ICC 患者预后的关系；采用多因素 Cox 比例风险回归模型分析 ICC 患者不良预后的危险因素；ROC 曲线分析 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达对 ICC 患者预后的诊断价值，曲线下面积（AUC）比较行Z检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 ICC 癌组织及其癌旁组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 的表达情况
免疫组织化学结果显示，TGR5 蛋白阳性表达主要定位于细胞膜和细胞质，热休克蛋白 75 阳性表达主要定位于细胞质中，均呈浅黄色或棕褐色颗粒状（图 1a～1d）。按照染色评分标准评价 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 的免疫评分，发现 ICC 癌旁组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 未表达或阳性表达较少，其表达阳性率分别为 13.83%（13/94）和 11.70%（11/94）；在癌组织中 TGR5 蛋白表达阳性率为 79.79%（75/94），热休克蛋白 75 表达阳性率为 84.04%（79/94），均高于癌旁组织中的表达（χ2=82.122，P<0.001；χ2=98.561，P<0.001）。WB 结果（图 1e、1f）显示：癌组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 相对表达量高于癌旁组织（P<0.05）。
图1
示 ICC 癌组织及其癌旁组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达检测结果
a、b：分别示癌旁组织（a）和 ICC 癌组织（b）中 TGR5 蛋白表达结果（免疫组织化学 SP ×200）；c、d：分别示癌旁组织（c）和 ICC 癌组织（d）中热休克蛋白 75 表达结果（免疫组织化学 SP ×200）；e、f：示 WB 法检测 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达的电泳图（e）及其定量结果（f），e 图中 1 代表癌组织，2 代表癌旁组织
2.2 ICC 癌组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达情况与患者临床病理特征的关系
ICC 癌组织中 TGR5 蛋白的表达状态与患者年龄、肿瘤部位、淋巴结转移、神经受累和微血管侵犯无关（P>0.05），但与患者性别、肿瘤直径、分化程度、TNM 分期、卫星灶和肝硬变相关（P<0.05）。ICC 癌组织中热休克蛋白 75 的表达状态与患者性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移和微血管侵犯无关（P>0.05），但与肿瘤直径、TNM 分期、神经受累、卫星灶和肝硬变相关（P<0.05）。见表 1。
表1
ICC 癌组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达与患者临床病理特征的关系（例）
2.3 不同预后情况 ICC 患者的 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达情况及其临床病理特征
根据随访结果将本组 94 例 ICC 患者分为预后不良组（已死亡者，58 例）和预后良好组（仍生存者，36 例），分析 2 组患者的 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达情况及其临床病理特征，结果见表 2。由表 2 可见，2 组患者在年龄、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移和神经受累方面比较其差异无统计学意义（P>0.05），而 2 组患者在性别、肿瘤直径、TNM 分期、微血管侵犯、卫星灶、肝硬变以及 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达情况方面比较差有统计学意义（P<0.05）。
表2
不同预后情况 ICC 患者的 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达情况及其临床病理特征比较（例）
进一步绘制 Kaplan-Meier 生存曲线分析 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 的表达与 ICC 患者预后的关系，结果显示 TGR5 蛋白表达阳性者的累积 3 年总生存率（32.00%）低于 TGR5 蛋白表达阴性者（63.16%），χ2=6.228，P=0.013；热休克蛋白 75 表达阳性者的累积 3 年总生存率（32.91%）也低于热休克蛋白 75 表达阴性者（66.67%），χ2=6.079，P=0.014。具体见图 2a、2b。
图2
示 ICC 癌组织中 TGR5 蛋白（a）和热休克蛋白 75（b）不同表达状态患者的生存曲线，以及 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达水平对 ICC 患者预后诊断的 ROC 曲线（c）
2.4 多因素 Cox 比例风险回归模型分析 ICC 患者预后不良的危险因素
以预后作为应变量（预后不良=1，预后良好=0），以 TGR5 蛋白、热休克蛋白 75、TNM 分期、淋巴结转移、卫星灶、肝硬变为自变量进行多因素 Cox 比例风险回归模型分析，其结果显示：TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达阳性、TNM Ⅲ+Ⅳ期、有卫星灶和肝硬变为 ICC 患者预后不良的危险因素（P<0.05），见表 3。
表3
多因素 Cox 比例风险回归模型分析 ICC 患者预后不良的危险因素
2.5 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达水平对 ICC 预后的诊断价值
以癌组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达水平绘制 ROC 曲线，约登指数最大值时对应的值为截断值。其结果显示：以 TGR5 蛋白表达水平 0.932 为截断值，其诊断 ICC 患者预后不良的AUC为 0.783，95%CI为（0.691，0.874），P<0.001，敏感度为 72.4%，特异度为 72.2%；以热休克蛋白 75 表达水平 0.756 为截断值，其诊断 ICC 患者预后不良的AUC为 0.805，95%CI为（0.717，0.892），P<0.001，敏感度为 84.4%，特异度为 63.9%；二者联合诊断 ICC 患者预后不良的AUC为 0.884，95%CI为（0.818，0.949），P<0.001，敏感度为 79.3%，特异度为 83.3%；二者联合诊断 ICC 患者预后不良的AUC高于 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 单独诊断者（Z=2.848、P=0.004；Z=2.326、P=0.020），具体见图 2c。
3 讨论
ICC 是一种高度恶性的原发性肝脏恶性肿瘤，多数 ICC 患者缺乏典型症状，常在体检进行影像学检查时发现肝内占位性病变[13]，在肝硬变肝脏中，ICC 的鉴别诊断相对困难。随着筛查项目的改进及医疗水平的提高，ICC 的诊断率有所提高。根治性肿瘤切除是帮助 ICC 患者获得长期生存最有效的治疗手段。病因学和流行病学研究[14]显示，肝硬变、病毒性肝炎（乙肝、丙肝）、原发性硬化性胆管炎及肝内胆管结石可作为 ICC 的高危风险因素。ICC 主要通过淋巴系统进行肿瘤远处播散，有研究[15]发现，肿瘤分化程度、肿瘤直径等对患者总体预后评价具有一定的临床价值，但仅以其评估患者预后较片面，且由于病因、治疗等情况的不同，临床预后有所差异。因此，寻找能更客观、更简便的评估 ICC 患者预后的生物学指标，对治疗方案的制定及预后情况的改善十分重要。
TGR5 受体由 330 个氨基酸组成，包括 7 个跨膜结构域，基因定位于人染色体 2q35，在静息状态下由 α、β 和 γ 亚基组成，一旦与胆汁酸结合后，分离的 α 蛋白亚基激活腺苷酸环化酶（AC），诱导环磷酸腺苷（cAMP）产生增加，激活蛋白激酶 A（PKA）途径及下游信号通路[16-18]。在胃腺癌研究[19]中发现，TGR5 在大部分胃肠型腺癌中过表达，且其在细胞膜和细胞质内中度到强度表达与胃腺癌患者生存率下降有关。TGR5 在 ICC 中的研究较少，本研究免疫组织化学染色结果显示，ICC 癌组织中 TGR5 蛋白表达阳性率为 79.79%，高于在癌旁组织中的表达；WB 检测结果显示，ICC 癌组织中 TGR5 蛋白相对表达量高于癌旁组织，提示 TGR5 可能与 ICC 的发生有关，是 ICC 癌组织演变中的重要因子。
热休克蛋白 75 作为一种线粒体常驻蛋白，分子量约为 74×103，编码基因定位于人染色体 5q31.1，具有 46 个氨基酸，热休克蛋白 75 与热激活蛋白具有高度相似序列，被归为热休克蛋白 70 家族伴侣蛋白成员之一[20-22]。热休克蛋白 75 具有蛋白质修饰、免疫应答、参与胞内运输、受体的内化等功能[23]。有研究[24]显示，热休克蛋白 75 参与了细胞生长周期的调控、外界应激、肿瘤发生等多种生物学过程，在多种恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤转移密切相关。在结直肠癌中的研究[25]发现，热休克蛋白 75 的高表达与患者预后不良密切相关。另有研究[26]发现，肝癌患者术后早期复发与无复发患者相比，热休克蛋白 75 表达增高，热休克蛋白 75 高表达与肝癌的 TNM 分期及静脉浸润密切相关。本研究结果显示，ICC 癌组织中热休克蛋白 75 蛋白表达阳性率高于癌旁组织；WB 检测结果显示，癌组织中热休克蛋白 75 蛋白相对表达量也高于癌旁组织，提示热休克蛋白 75 可能与 ICC 的发生有关，热休克蛋白 75 可能作为“分子伴侣”参与调节和稳定癌细胞的异常增殖过程。
另外，本研究结果还显示，预后不良组和预后良好组 ICC 患者在性别、肿瘤直径、TNM 分期、微血管侵犯、卫星灶、肝硬变以及 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达情况方面比较差异均有统计学意义，提示肿瘤直径>5 cm 患者预后不良风险较大，肿瘤直径大小与手术切缘及淋巴结转移情况有关，从而对患者预后产生影响。Kaplan-Meier 生存曲线显示，TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达阳性患者的累积 3 年总生存率均低于 TGR5 蛋白及热休克蛋白 75 表达阴性患者；进一步进行多因素 Cox 比例风险回归模型分析显示，TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达阳性、TNM Ⅲ+Ⅳ期以及有卫星灶和肝硬变均为 ICC 患者预后不良的危险因素，提示 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 表达可作为对 ICC 患者预后不良预测的辅助指标。另 ROC 结果显示，TGR5 蛋白表达水平诊断 ICC 患者预后不良的AUC为 0.783，热休克蛋白 75 表达水平诊断 ICC 患者预后不良的AUC为 0.805，二者联合诊断的AUC为 0.884，联合诊断价值高于二者单独诊断，提示二者联合诊断对 ICC 患者预后不良具有一定预测价值，可作为预测 ICC 患者预后不良情况的潜在生物学指标。
综上所述，ICC 癌组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 高表达，是 ICC 患者预后不良的危险因素，并对预后具有一定的预测价值。但本研究结果仅能得出癌组织中 TGR5 蛋白和热休克蛋白 75 的表达可能与 ICC 的发生有关，二者与 ICC 发生的因果关系尚不能明确，在今后的研究中需将其作为重点继续探讨。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：赵帅华负责本研究的设计、试验、数据统计及论文写作；张先舟、蒙博和曹胜利共同参与完成本研究的设计、试验、数据统计及论文修改。
伦理声明：该研究通过了濮阳市安阳地区医院伦理委员会的审批（批文编号：20190315-7526）
