引用本文： 谢雨宣, 唐红梅, 李欣, 潘登科, 周佳. GGTA1 基因敲除猪胰岛细胞移植到Ⅰ型糖尿病猕猴 3 例报道. 中国普外基础与临床杂志, 2021, 28(5): 561-565. doi: 10.7507/1007-9424.202104047 复制
糖尿病是目前严重威胁人类健康的世界性疾病之一[1]，中国的糖尿病患者数量位居世界第一[2]，而胰岛细胞移植是唯一一种能彻底根治糖尿病的治疗方法[3]，其推广受限于人供体胰腺的稀缺。猪胰岛素与人胰岛素非常相似，只有一个氨基酸与人的不同[4]，同时异种移植用猪胰岛细胞可以无限供应，用于治疗Ⅰ型糖尿病（T1DM）有一定的可行性，因此猪胰岛细胞得到了广泛的研究[5-6]，猪胰岛细胞被认为是人类胰岛的最佳代替来源[7]。国内外已报道了多例猪胰岛细胞移植治疗非人类灵长类糖尿病猴，取得了良好的效果[8-10]。笔者所在团队利用 α-1, 3-半乳糖基转移酶基因（α-1, 3-galactosyltransferase，GGTA1）敲除猪作为胰岛细胞来源，开展了胰岛移植治疗 T1DM 猴的临床前实验研究，来探索猪胰岛细胞治疗 T1DM 的可行性，现将本实验研究结果汇报如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康成年猕猴由四川省人民医院实验动物研究所提供（3 只雄猴，年龄分别为 3.0、3.5 和 5.0 岁，体质量分别为 3.7、4.8 和 5.3 kg）。本研究中使用的动物和程序均经四川省医学科学院·四川省人民医院伦理委员会批准。此外，实验动物的照顾和使用完全符合当地动物福利法律、指导方针和政策 ［批文编号：伦审（研）2019 第 240 号］。
1.2 主要耗材和设备
包括注射用盐酸替来他明盐酸唑拉西泮（法国维克有限公司）、异氟烷（河北一品制药股份有限公司）、甘精胰岛素注射液（赛诺菲制药有限公司）、胰岛素注射液（江苏万邦生物制药有限公司）和血糖仪（江苏鱼跃血糖仪）。
1.3 糖尿病猴模型的构建
1.3.1 糖尿病猴模型的成模标准
成模后的糖尿病猕猴出现典型糖尿病症状（多饮、多食、多尿和体质量明显减轻）；空腹血糖水平持续≥11.1 mmol/L；尿糖（+++）；空腹血清 C 肽水平低于 0.4 μg/L；在静脉注射葡萄糖耐量试验（IVGTT）后，C 肽释放没有增加，缺乏 C 肽反应。满足以上条件，则认为猕猴患有糖尿病，造模成功[10]。
1.3.2 糖尿病猴模型的构建方法
造模前猕猴禁食 12 h，不禁水，配制 0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液作为链尿佐菌素（STZ）溶剂，柠檬酸缓冲液的 pH 值在 4.2～4.5。麻醉后猕猴称重，按 75 mg/kg 剂量称取 STZ，使用柠檬酸缓冲液溶解 STZ，然后用 0.22 μm 微孔滤膜过滤，配制好后最好在 10 min 内使用。下肢建立静脉通路，用 10 mL 生理盐水推注，观察管路通畅情况，固定好留置针；将配好的 STZ 溶液通过留置针在 5 min 内快速推注进猕猴的血管里，推注时注意观察猕猴的血压和心率的变化。推注后补充生理盐水，可以减少 STZ 的肾毒性，有助于降低糖尿病猴造模时的副作用发生率和死亡率[11-12]。3 只猕猴的低血糖在 STZ 注射后 17～20 h 出现，STZ 注射后 24 h 内每 2 小时监测血糖变化，当血糖低时可在背部皮下注射 50% 葡萄糖注射液使其缓慢吸收，或喂食苹果等含糖食物升高血糖。STZ 容易潮解失活，快速称取后需要在 2～8 ℃、干燥避光环境中保存，现配现用。本实验 3 只猕猴均已达到糖尿病成模标准，实验过程符合动物伦理学标准。
1.4 猪胰岛细胞移植治疗糖尿病猴的实验方法
1.4.1 胰岛细胞的分离和移植
异种胰岛移植的 GGTA1 基因敲除猪胰岛细胞由成都中科奥格生物科技有限公司提供，新生猪胰岛移植用量按照猕猴每千克体质量 50 000 IEQ（IEQ 为胰岛当量）进行移植，胰岛活性分别为 90.0%、85.0% 和 90.0%。猕猴禁食禁水 12 h 后麻醉，采用平卧位固定四肢，常规消毒、铺巾，取右上腹腹直肌旁切口，暴露腹腔，找到肠系膜上静脉进行穿刺置管，固定静脉穿刺管后，连接胰岛输注管路。重力作用下输注猪胰岛细胞悬液（内加肝素抗凝），利用门静脉的回流将胰岛细胞分布至肝脏（图 1）。术中严密观察猕猴状态及生命体征；输入完毕后用冲洗液冲洗输液管道，取出静脉穿刺管，按压穿刺点止血，回纳肠管至腹腔，关闭腹腔。
图1
示经受体猴肠系膜静脉输注猪胰岛细胞悬液
1.4.2 免疫抑制方案
① 兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白（ATG）：术前 2 d 至术后 2 d，每日以 2.2 mg/kg 剂量静脉输入 1 次，进行免疫诱导治疗；② 他克莫司：术前 3 d 开始每天早晨和晚上各 1 次，每次 1 mg 灌服，每周监测血药浓度，维持在 3～8 ng/mL；③ 西罗莫司：术前 3 d 开始每日 1 mg，1 d 1 次灌服，每周监测血药浓度，维持在 8～12 ng/mL。
1.4.3 IVGTT
移植后第 3～4 周行 IVGTT 试验，在没有外源性胰岛素干扰的前提下，每只猕猴禁食 12 h 后以 0.5 g/kg 静脉推注 50% 葡萄糖注射液，在 1 min 内推注完毕，分别于 0、5、15、30、45、60、90、120 和 150 min 取静脉血测血糖，检测猕猴移植后猪胰岛细胞对葡萄糖刺激的反应。
1.5 手术管理
1.5.1 术前管理
① 完成各种常规术前检查：如血常规、糖化血红蛋白、血生化、C 肽、IVGTT 等检查。② 血糖控制：每日早、中、晚 3 餐前监测空腹血糖，根据血糖情况调整胰岛素用量，使血糖尽量控制在正常范围 3.9～6.1 mmol/L[13]。③ 术前用药观察：术前使用兔抗人 ATG 进行免疫诱导，密切观察用药后的不良反应[14]，如是否发生寒战、发热等症状，并控制输液速度（1 h 以上），使用兔抗人 ATG 前准备好抗过敏和抗休克的药物，如地塞米松。④ 猕猴准备：术前禁食 12 h、禁饮 8 h。按腹腔手术需要备皮（上方齐平乳头连线，下方至耻骨联合两侧到腋后线），清洗皮肤，这有利于消毒和保持无菌状态。⑤ 手术器械、用物准备：准备普通开腹器械、无菌包、高频电刀、刀片、无菌纱布若干、一次性无菌手套若干、22G 静脉留置针、一次性使用输液器、血糖仪、血糖试纸和猕猴防挠背心。
1.5.2 术后管理
① 生命体征监测：术后继续给予心电监护和氧气吸入，密切观察生命体征变化，保持呼吸道通畅，直至麻醉苏醒、恢复自主呼吸。② 伤口护理：因术后常规应用免疫抑制剂，抵抗力低，容易发生切口感染，需注意护理。③ 血糖控制：异种移植后容易发生免疫排斥反应，胰岛细胞被破坏、释放胰岛素，导致低血糖的发生，因此应注意观察猕猴术后的精神状态和饮食情况，24 h 内每2 小时监测 1 次血糖变化，血糖≤2.0 mmol/L 时给予 50% 葡萄糖注射液静脉注射，根据血糖波动情况调整胰岛素用量，警惕低血糖和高血糖的发生。④ 用药管理：胰岛移植后需要长时间服用西罗莫司、他克莫司免疫抑制剂，需要定期监测血药浓度[15]。除常规移植后用药，还需应用依那西普（一种用于治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎的药物），用于减轻经血液介导的炎症反应对胰岛细胞的损害[16]，依那西普用药时易发生过敏反应，还需观察用药后不良反应，准备抗过敏和抗休克的药物。⑤ 指标检测：用常规检测方法检测术后血常规、肝肾功能指标，由于经受手术，体内内环境会发生明显变化，需要随时监测体内内环境的恢复情况，以及门静脉移植后肝肾功能的受损情况。
1.5.3 并发症的预防及处理
① 预防糖尿病酮症酸中毒：使用 STZ 会对恒河猴胰岛 β 细胞造成损害[17]，此时胰岛无法分泌胰岛素，身体发生不适，产生应激反应，进食量减少，甚至不进食。当机体缺乏胰岛素时，组织和细胞也无法有效摄取和利用血液中的葡萄糖，会促使脂肪分解产生大量酸性酮体，从而导致糖尿病酮症酸中毒的发生。应多观察猕猴每日三餐进食情况，合理运用胰岛素，防止发生低血糖反应。② 糖尿病酮症酸中毒的处理措施：术后观察猕猴是否出现酮症酸中毒症状，酮症酸中毒表现为高血糖（血糖≥30.0 mmol/L）、高血酮（≥1.0 mmol/L）、多饮、多尿、食欲减退、恶心呕吐等。可通过静脉补液（输入氯化钾、复方氨基酸、复方氯化钠等）纠正水、电解质平衡，补充营养，使用碳酸氢钠注射液静脉滴注，补充胰岛素，促进机体利用葡萄糖，减少脂肪分解，当血糖降低至 13.9 mmol/L以下时，同时补充 5% 葡萄糖注射液和胰岛素，快速减少酮体的产生[18]。同时插胃管温水灌胃，喂服碳酸氢钠片中和胃酸，给予多酶片增加食欲。
2 结果
移植治疗效果：3 例实验猴成功进行胰岛细胞移植治疗，术后生命体征平稳，未发生静脉栓塞症状，均健康存活。12 周内能检测到特异性猪 C 肽，移植后血糖较术前均有较明显降低，3 只猴术前平均空腹血糖分别为：19.8、16.7 和 15.9 mmol/L，术后平均空腹血糖分别为 14.3、15.2 和 13.3 mmol/L；平均每日外源性胰岛素用量也明显下降，术前平均分别为 15.38、14.23 和 16.55 U，术后平均分别为 10.24、12.96 和 11.24 U；胰岛移植前后 IVGTT 试验结果差异显著：胰岛移植前，高糖静脉注射后血糖在 150 min 内维持高位，没有下降；胰岛移植后，高糖静脉注射后血糖在 5 min 时血糖达到最高值，而后开始降低，150 min 时血糖恢复到高糖注射前水平（图 2）。
图2
示第 3 只猕猴移植前后 IVGTT 实验期间血糖水平的变化
术后有 1 只猕猴发生伤口感染，出现发炎、红肿症状，予以每日消毒伤口、更换敷料、头孢唑啉钠 10 mg/kg 肌肉注射抗感染等处理后，伤口感染得到控制。3 只猕猴移植术后服用阿司匹林抗凝，未发生静脉栓塞等症状。实验过程中 3 只猕猴在成模后 1 周左右、胰岛移植术后均出现了酮症酸中毒症状，血糖持续≥25.0 mmol/L，进食量减少，经静脉补液、补充营养、插胃管温水灌胃等治疗后，血酮、血糖恢复正常，酸中毒缓解。实验期间猕猴应用他克莫司、西罗莫司、依那西普等免疫抑制剂后没有发生用药不良反应；1 和 3 号猕猴在手术当天胰岛细胞进入肝脏后，血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）指标对比手术前有升高，2 号猴移植后肝功能无明显损伤，可能与胰岛细胞进入肝脏定植对肝脏产生影响有关；1 和 3 号猕猴在 4 周后指标开始逐渐下降，2 号猴在 8 周后指标开始下降，16 周时均基本恢复正常（表 1）；移植物进入肝脏后未对其他的器官造成损害，猕猴均健康存活达16 周。
表1
移植前后 3 只猕猴的血常规及血生化指标变化
3 讨论
胰岛细胞移植能够纠正糖尿病患者的糖代谢异常[19]，能实现完全脱离外源性胰岛素，并有微创治疗的特性，是一种有巨大潜力和应用前景的治疗方法[20-24]。由于人供体胰岛的稀缺，对猪胰岛细胞移植的研究受到了广泛关注。随着近年来基因编辑技术的快速发展，能更加高效的开发基因修饰猪，推进了异种移植的临床前研究。使用更有效的免疫抑制方案和基因修饰猪胰岛的异种移植有可能实现长期持续的胰岛素脱离，但预计得到猪胰岛移植临床 T1DM 标准治疗方法和结果还需要一些时间[25-26]。
本研究猪胰岛移植采用的是 GGTA1 基因敲除的新生猪胰岛细胞，GGTA1 基因敲除基本解决了异种移植的超急性排斥反应。传统的 Edmonton 免疫抑制方案是由抗 CD25 单克隆抗体、他克莫司和西罗莫司组成的三联用药方案，本实验在 Edmonton 方案的基础上，将抗 CD25 单克隆抗体改为 ATG，从而有利于移植免疫耐受的形成。移植后糖尿病猴的血糖降低，结合外源性胰岛素治疗，3 只糖尿病猴均健康存活，未出现其他并发症。笔者通过总结这几例异种胰岛细胞移植，认为要延长猪胰岛细胞存活并发挥功能的时间，还需加强对基因修饰猪的改造，筛选适用于异种胰岛移植的基因型组合，得到免疫原性更低、人源化的猪胰岛细胞。应摸索围手术期及手术后的免疫抑制剂方案，探索应用如单克隆抗体之类的高靶向性的免疫抑制剂，以阻断主要的协同刺激通路，抑制 T 细胞的激活，诱导免疫耐受，从而极大地降低免疫排斥反应程度。笔者总结手术过程：严格执行无菌操作，采用适当的抗凝和预防感染治疗措施，可以减少术后严重感染、血管栓塞等并发症的发生；移植时尽量选择粗细合适的静脉穿刺管，保证穿刺成功和胰岛悬液输注通畅；剪去输液器上的滤膜，防止对胰岛细胞的过滤；严密监测血糖，控制血糖保持稳定，有利于胰岛细胞存活，观察免疫抑制剂用药后的不良反应，对保证治疗疗效有重要意义。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：谢雨宣收集资料并撰写论文；唐红梅修改论文；李欣审核资料，潘登科负责课题设计和修改论文；周佳对文稿进行审阅及修改。
伦理声明：本研究已通过四川省医学科学院·四川省人民医院的伦理审核批准［批文编号：伦审（研）2019 第 240 号］。
糖尿病是目前严重威胁人类健康的世界性疾病之一[1]，中国的糖尿病患者数量位居世界第一[2]，而胰岛细胞移植是唯一一种能彻底根治糖尿病的治疗方法[3]，其推广受限于人供体胰腺的稀缺。猪胰岛素与人胰岛素非常相似，只有一个氨基酸与人的不同[4]，同时异种移植用猪胰岛细胞可以无限供应，用于治疗Ⅰ型糖尿病（T1DM）有一定的可行性，因此猪胰岛细胞得到了广泛的研究[5-6]，猪胰岛细胞被认为是人类胰岛的最佳代替来源[7]。国内外已报道了多例猪胰岛细胞移植治疗非人类灵长类糖尿病猴，取得了良好的效果[8-10]。笔者所在团队利用 α-1, 3-半乳糖基转移酶基因（α-1, 3-galactosyltransferase，GGTA1）敲除猪作为胰岛细胞来源，开展了胰岛移植治疗 T1DM 猴的临床前实验研究，来探索猪胰岛细胞治疗 T1DM 的可行性，现将本实验研究结果汇报如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康成年猕猴由四川省人民医院实验动物研究所提供（3 只雄猴，年龄分别为 3.0、3.5 和 5.0 岁，体质量分别为 3.7、4.8 和 5.3 kg）。本研究中使用的动物和程序均经四川省医学科学院·四川省人民医院伦理委员会批准。此外，实验动物的照顾和使用完全符合当地动物福利法律、指导方针和政策 ［批文编号：伦审（研）2019 第 240 号］。
1.2 主要耗材和设备
包括注射用盐酸替来他明盐酸唑拉西泮（法国维克有限公司）、异氟烷（河北一品制药股份有限公司）、甘精胰岛素注射液（赛诺菲制药有限公司）、胰岛素注射液（江苏万邦生物制药有限公司）和血糖仪（江苏鱼跃血糖仪）。
1.3 糖尿病猴模型的构建
1.3.1 糖尿病猴模型的成模标准
成模后的糖尿病猕猴出现典型糖尿病症状（多饮、多食、多尿和体质量明显减轻）；空腹血糖水平持续≥11.1 mmol/L；尿糖（+++）；空腹血清 C 肽水平低于 0.4 μg/L；在静脉注射葡萄糖耐量试验（IVGTT）后，C 肽释放没有增加，缺乏 C 肽反应。满足以上条件，则认为猕猴患有糖尿病，造模成功[10]。
1.3.2 糖尿病猴模型的构建方法
造模前猕猴禁食 12 h，不禁水，配制 0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液作为链尿佐菌素（STZ）溶剂，柠檬酸缓冲液的 pH 值在 4.2～4.5。麻醉后猕猴称重，按 75 mg/kg 剂量称取 STZ，使用柠檬酸缓冲液溶解 STZ，然后用 0.22 μm 微孔滤膜过滤，配制好后最好在 10 min 内使用。下肢建立静脉通路，用 10 mL 生理盐水推注，观察管路通畅情况，固定好留置针；将配好的 STZ 溶液通过留置针在 5 min 内快速推注进猕猴的血管里，推注时注意观察猕猴的血压和心率的变化。推注后补充生理盐水，可以减少 STZ 的肾毒性，有助于降低糖尿病猴造模时的副作用发生率和死亡率[11-12]。3 只猕猴的低血糖在 STZ 注射后 17～20 h 出现，STZ 注射后 24 h 内每 2 小时监测血糖变化，当血糖低时可在背部皮下注射 50% 葡萄糖注射液使其缓慢吸收，或喂食苹果等含糖食物升高血糖。STZ 容易潮解失活，快速称取后需要在 2～8 ℃、干燥避光环境中保存，现配现用。本实验 3 只猕猴均已达到糖尿病成模标准，实验过程符合动物伦理学标准。
1.4 猪胰岛细胞移植治疗糖尿病猴的实验方法
1.4.1 胰岛细胞的分离和移植
异种胰岛移植的 GGTA1 基因敲除猪胰岛细胞由成都中科奥格生物科技有限公司提供，新生猪胰岛移植用量按照猕猴每千克体质量 50 000 IEQ（IEQ 为胰岛当量）进行移植，胰岛活性分别为 90.0%、85.0% 和 90.0%。猕猴禁食禁水 12 h 后麻醉，采用平卧位固定四肢，常规消毒、铺巾，取右上腹腹直肌旁切口，暴露腹腔，找到肠系膜上静脉进行穿刺置管，固定静脉穿刺管后，连接胰岛输注管路。重力作用下输注猪胰岛细胞悬液（内加肝素抗凝），利用门静脉的回流将胰岛细胞分布至肝脏（图 1）。术中严密观察猕猴状态及生命体征；输入完毕后用冲洗液冲洗输液管道，取出静脉穿刺管，按压穿刺点止血，回纳肠管至腹腔，关闭腹腔。
图1
示经受体猴肠系膜静脉输注猪胰岛细胞悬液
1.4.2 免疫抑制方案
① 兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白（ATG）：术前 2 d 至术后 2 d，每日以 2.2 mg/kg 剂量静脉输入 1 次，进行免疫诱导治疗；② 他克莫司：术前 3 d 开始每天早晨和晚上各 1 次，每次 1 mg 灌服，每周监测血药浓度，维持在 3～8 ng/mL；③ 西罗莫司：术前 3 d 开始每日 1 mg，1 d 1 次灌服，每周监测血药浓度，维持在 8～12 ng/mL。
1.4.3 IVGTT
移植后第 3～4 周行 IVGTT 试验，在没有外源性胰岛素干扰的前提下，每只猕猴禁食 12 h 后以 0.5 g/kg 静脉推注 50% 葡萄糖注射液，在 1 min 内推注完毕，分别于 0、5、15、30、45、60、90、120 和 150 min 取静脉血测血糖，检测猕猴移植后猪胰岛细胞对葡萄糖刺激的反应。
1.5 手术管理
1.5.1 术前管理
① 完成各种常规术前检查：如血常规、糖化血红蛋白、血生化、C 肽、IVGTT 等检查。② 血糖控制：每日早、中、晚 3 餐前监测空腹血糖，根据血糖情况调整胰岛素用量，使血糖尽量控制在正常范围 3.9～6.1 mmol/L[13]。③ 术前用药观察：术前使用兔抗人 ATG 进行免疫诱导，密切观察用药后的不良反应[14]，如是否发生寒战、发热等症状，并控制输液速度（1 h 以上），使用兔抗人 ATG 前准备好抗过敏和抗休克的药物，如地塞米松。④ 猕猴准备：术前禁食 12 h、禁饮 8 h。按腹腔手术需要备皮（上方齐平乳头连线，下方至耻骨联合两侧到腋后线），清洗皮肤，这有利于消毒和保持无菌状态。⑤ 手术器械、用物准备：准备普通开腹器械、无菌包、高频电刀、刀片、无菌纱布若干、一次性无菌手套若干、22G 静脉留置针、一次性使用输液器、血糖仪、血糖试纸和猕猴防挠背心。
1.5.2 术后管理
① 生命体征监测：术后继续给予心电监护和氧气吸入，密切观察生命体征变化，保持呼吸道通畅，直至麻醉苏醒、恢复自主呼吸。② 伤口护理：因术后常规应用免疫抑制剂，抵抗力低，容易发生切口感染，需注意护理。③ 血糖控制：异种移植后容易发生免疫排斥反应，胰岛细胞被破坏、释放胰岛素，导致低血糖的发生，因此应注意观察猕猴术后的精神状态和饮食情况，24 h 内每2 小时监测 1 次血糖变化，血糖≤2.0 mmol/L 时给予 50% 葡萄糖注射液静脉注射，根据血糖波动情况调整胰岛素用量，警惕低血糖和高血糖的发生。④ 用药管理：胰岛移植后需要长时间服用西罗莫司、他克莫司免疫抑制剂，需要定期监测血药浓度[15]。除常规移植后用药，还需应用依那西普（一种用于治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎的药物），用于减轻经血液介导的炎症反应对胰岛细胞的损害[16]，依那西普用药时易发生过敏反应，还需观察用药后不良反应，准备抗过敏和抗休克的药物。⑤ 指标检测：用常规检测方法检测术后血常规、肝肾功能指标，由于经受手术，体内内环境会发生明显变化，需要随时监测体内内环境的恢复情况，以及门静脉移植后肝肾功能的受损情况。
1.5.3 并发症的预防及处理
① 预防糖尿病酮症酸中毒：使用 STZ 会对恒河猴胰岛 β 细胞造成损害[17]，此时胰岛无法分泌胰岛素，身体发生不适，产生应激反应，进食量减少，甚至不进食。当机体缺乏胰岛素时，组织和细胞也无法有效摄取和利用血液中的葡萄糖，会促使脂肪分解产生大量酸性酮体，从而导致糖尿病酮症酸中毒的发生。应多观察猕猴每日三餐进食情况，合理运用胰岛素，防止发生低血糖反应。② 糖尿病酮症酸中毒的处理措施：术后观察猕猴是否出现酮症酸中毒症状，酮症酸中毒表现为高血糖（血糖≥30.0 mmol/L）、高血酮（≥1.0 mmol/L）、多饮、多尿、食欲减退、恶心呕吐等。可通过静脉补液（输入氯化钾、复方氨基酸、复方氯化钠等）纠正水、电解质平衡，补充营养，使用碳酸氢钠注射液静脉滴注，补充胰岛素，促进机体利用葡萄糖，减少脂肪分解，当血糖降低至 13.9 mmol/L以下时，同时补充 5% 葡萄糖注射液和胰岛素，快速减少酮体的产生[18]。同时插胃管温水灌胃，喂服碳酸氢钠片中和胃酸，给予多酶片增加食欲。
2 结果
移植治疗效果：3 例实验猴成功进行胰岛细胞移植治疗，术后生命体征平稳，未发生静脉栓塞症状，均健康存活。12 周内能检测到特异性猪 C 肽，移植后血糖较术前均有较明显降低，3 只猴术前平均空腹血糖分别为：19.8、16.7 和 15.9 mmol/L，术后平均空腹血糖分别为 14.3、15.2 和 13.3 mmol/L；平均每日外源性胰岛素用量也明显下降，术前平均分别为 15.38、14.23 和 16.55 U，术后平均分别为 10.24、12.96 和 11.24 U；胰岛移植前后 IVGTT 试验结果差异显著：胰岛移植前，高糖静脉注射后血糖在 150 min 内维持高位，没有下降；胰岛移植后，高糖静脉注射后血糖在 5 min 时血糖达到最高值，而后开始降低，150 min 时血糖恢复到高糖注射前水平（图 2）。
图2
示第 3 只猕猴移植前后 IVGTT 实验期间血糖水平的变化
术后有 1 只猕猴发生伤口感染，出现发炎、红肿症状，予以每日消毒伤口、更换敷料、头孢唑啉钠 10 mg/kg 肌肉注射抗感染等处理后，伤口感染得到控制。3 只猕猴移植术后服用阿司匹林抗凝，未发生静脉栓塞等症状。实验过程中 3 只猕猴在成模后 1 周左右、胰岛移植术后均出现了酮症酸中毒症状，血糖持续≥25.0 mmol/L，进食量减少，经静脉补液、补充营养、插胃管温水灌胃等治疗后，血酮、血糖恢复正常，酸中毒缓解。实验期间猕猴应用他克莫司、西罗莫司、依那西普等免疫抑制剂后没有发生用药不良反应；1 和 3 号猕猴在手术当天胰岛细胞进入肝脏后，血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）指标对比手术前有升高，2 号猴移植后肝功能无明显损伤，可能与胰岛细胞进入肝脏定植对肝脏产生影响有关；1 和 3 号猕猴在 4 周后指标开始逐渐下降，2 号猴在 8 周后指标开始下降，16 周时均基本恢复正常（表 1）；移植物进入肝脏后未对其他的器官造成损害，猕猴均健康存活达16 周。
表1
移植前后 3 只猕猴的血常规及血生化指标变化
3 讨论
胰岛细胞移植能够纠正糖尿病患者的糖代谢异常[19]，能实现完全脱离外源性胰岛素，并有微创治疗的特性，是一种有巨大潜力和应用前景的治疗方法[20-24]。由于人供体胰岛的稀缺，对猪胰岛细胞移植的研究受到了广泛关注。随着近年来基因编辑技术的快速发展，能更加高效的开发基因修饰猪，推进了异种移植的临床前研究。使用更有效的免疫抑制方案和基因修饰猪胰岛的异种移植有可能实现长期持续的胰岛素脱离，但预计得到猪胰岛移植临床 T1DM 标准治疗方法和结果还需要一些时间[25-26]。
本研究猪胰岛移植采用的是 GGTA1 基因敲除的新生猪胰岛细胞，GGTA1 基因敲除基本解决了异种移植的超急性排斥反应。传统的 Edmonton 免疫抑制方案是由抗 CD25 单克隆抗体、他克莫司和西罗莫司组成的三联用药方案，本实验在 Edmonton 方案的基础上，将抗 CD25 单克隆抗体改为 ATG，从而有利于移植免疫耐受的形成。移植后糖尿病猴的血糖降低，结合外源性胰岛素治疗，3 只糖尿病猴均健康存活，未出现其他并发症。笔者通过总结这几例异种胰岛细胞移植，认为要延长猪胰岛细胞存活并发挥功能的时间，还需加强对基因修饰猪的改造，筛选适用于异种胰岛移植的基因型组合，得到免疫原性更低、人源化的猪胰岛细胞。应摸索围手术期及手术后的免疫抑制剂方案，探索应用如单克隆抗体之类的高靶向性的免疫抑制剂，以阻断主要的协同刺激通路，抑制 T 细胞的激活，诱导免疫耐受，从而极大地降低免疫排斥反应程度。笔者总结手术过程：严格执行无菌操作，采用适当的抗凝和预防感染治疗措施，可以减少术后严重感染、血管栓塞等并发症的发生；移植时尽量选择粗细合适的静脉穿刺管，保证穿刺成功和胰岛悬液输注通畅；剪去输液器上的滤膜，防止对胰岛细胞的过滤；严密监测血糖，控制血糖保持稳定，有利于胰岛细胞存活，观察免疫抑制剂用药后的不良反应，对保证治疗疗效有重要意义。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：谢雨宣收集资料并撰写论文；唐红梅修改论文；李欣审核资料，潘登科负责课题设计和修改论文；周佳对文稿进行审阅及修改。
伦理声明：本研究已通过四川省医学科学院·四川省人民医院的伦理审核批准［批文编号：伦审（研）2019 第 240 号］。
