引用本文： 冯世明, 胡继仲, 刘威, 李立. 组织工程化胆管研究进展. 中国普外基础与临床杂志, 2021, 28(11): 1504-1509. doi: 10.7507/1007-9424.202101053 复制
组织工程化胆管可以替代临床上医源性胆管损伤、胆管的离断伤、电灼伤、肝移植等[1-2]原因导致的肝外胆管狭窄以及一些先天性胆管疾病的肝外胆管（extrahepatic bile duct，EHBD），此法可以避免传统胆肠吻合治疗所带来的 Oddi’s 括约肌功能损害，术后发生胆汁漏、胆管阻塞、胆管感染甚至胆汁性肝硬化等并发症的风险极大降低，也为患者减轻了经济负担[3-8]。胆道并发症作为死亡供体肝移植术后移植物失败的主要原因，也给胆道损伤的治疗提出了更迫切的要求[9-10]。组织工程化管状系统的发展给肝外胆道损伤疾病及肝移植术后胆道良性狭窄的治疗带来了新的治疗方式[11]。针对组织工程化胆管的研究主要集中在支架材料、种子细胞及两者的复合培养上[12]。近来，众多研究者指出，通过自体或干细胞再细胞化的脱细胞异体细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是最有前途的支架材料[13]。由于来自动物的异种组织可能具有残留的免疫原性，并可能受到生物制剂的污染，故而人异基因组织是获得适合于再细胞化和植入的 ECM 的理想材料。针对胆管 ECM 的国内外研究包括脐静脉脱细胞基质[1]、输尿管脱细胞基质[14]、人胎盘绒毛膜脱细胞血管基质[15-16]、脱细胞胰腺基质[17]等。组织工程化胆管的研究较组织工程化血管落后，主要原因是胆道特殊的生理环境要求支架材料具有较强的抗腐蚀性、具有一定的拉力，同时也要求种子细胞能耐受高碱性环境。性能优越的组织工程胆管支架需要有利于细胞的增殖、黏附和迁移，同时它还需要促进血管生成。管状组织工程的发展是一个具有挑战性的研究领域，旨在提供组织替代品，此外也为药物和医疗设备的测试提供体外模型，甚至用于研究疾病的生理和病理过程[18]。现将组织工程化胆管的发展现状作一综述，旨在给临床及科研人员提供新的治疗方案及科研思路。
1 胆管的体内修复
目前胆管的缺损及离断损伤修复模型的构建主要集中在兔、狗、猪等实验动物，相关的研究主要集中在支架材料的制备、种子细胞的获取、种子细胞在支架材料上的生物相容性及支架在动物模型中的应用效果上。
1.1 支架材料
国内外关于支架材料的研究包括不可吸收材料、可降解材料、复合材料等。其中，复合材料是当下研究的热点。
1.1.1 不可吸收材料
在人工胆管研究初期，包括涤纶、各种合金、聚四氟乙烯等聚合物在内的不可吸收材料的应用较为广泛[12]。在不可吸收材料的研究领域，2011 年 Schanaider 团队[19]对 10 只胆道梗阻的狗使用膨胀聚四氟乙烯补片治疗，结果在 6 只狗中发现补片作为游离腔异物部分黏附于胆总管，提示了聚四氟乙烯的使用应该慎重。2017 年，Tal 等[20]通过一项多中心随机试验，比较了 48 例被确诊为原位肝移植术后吻合口胆管狭窄（anastomotic biliary stricture，ABS）患者使用塑料和金属支架的不同效果，发现有 10 例（20.8%）患者在中位随访 500 d 后（范围 48～1 317 d）出现狭窄复发。这不仅给患者增加了经济负担，也提示了不可吸收材料在组织工程化胆管领域的发展中具有局限性。
1.1.2 可降解高分子合成材料
常用的可降解高分子合成材料有聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚己内酯（PCL）等各种聚合物[12]。同时，研究者也在不断地开发各种新型材料。2016 年马利锋等[21]对 15 只巴马小型猪采用团队新制备的聚癸二酸丙二醇聚酯支架联合大网膜进行胆道损伤修复，术后的修复效果优于单纯的对胆道进行间断缝合（对照组），术后 6 个月可见 α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）明显较对照组减少，说明他们制备的新型生物可降解支架材料具有良好的生物特性，应用于胆道损伤中可以获得理想的修复效果，但是由于胆道的瘢痕形成及由于瘢痕导致的胆道狭窄及梗阻最常发生于术后的 12～18 个月，所以该种材料的修复效果还有待进一步的深入研究。
1.1.3 脱细胞的 ECM
在脱细胞方案标准化后，大多数的研究表明，脱细胞 ECM 支架可以为不同类型的种子细胞生长提供一个最佳的平台，通过对该平台再细胞化处理后、开发完全个性化的临床方法成为研究热点[13]。针对胆管替代 ECM 材料的国内外研究包括脐静脉脱细胞基质、输尿管脱细胞基质、人胎盘绒毛膜无细胞血管基质等[14, 22-23]。
2016 年，Struecker 等[3]使用自体胆管细胞再细胞化的同种异体血管脱细胞基质构建的新胆管，植入 5 头家猪体内，14 d 后处死实验动物。所有猪都在整个研究期间存活，血液检查及磁共振结果未见严重并发症；组织学检查发现中性粒细胞侵入新胆管，并在植入组织周围和内部观察到新血管生成。2019 年，Liu 等[24]使用异体胆管上皮细胞再细胞化的异种脱细胞动脉基质修复滇南小耳猪肝外胆道缺损模型，取得了良好的效果，实验组动物可长期存活达 8 周；在术后 1、2、4 和 8 周通过磁共振胆道成像、肝功能检测、血常规检测、HE 染色、免疫荧光、蛋白质印迹（Western Blot）等方法初步评价了再细胞化人源脱细胞动脉基质修复猪胆总管节段性缺损的可行性。
1.1.4 复合材料
复合材料是当下研究的热点，各种支架材料均可以经过浸涂、电镀、叠层组装、水解、等离子处理、电子束辐射、接枝共聚合、界面聚合等表层修饰方法获得一定的表面改性，进而增加细胞在材料上的黏附及增殖效果[25-27]。2018 年，Khorramirouz 等[28]考虑到支架材料在体内可能发生形变而影响效果，通过大鼠皮下植入手术证明了与传统方法相比，由 PCL 纤维组成的支架是一种有效的支撑结构，可以有效地保持支架的位置，防止降解，减少炎症。这提示复合材料可能更加适用于于组织工程化胆管的构建。
2020 年 Park 等[29]使用涂覆有银纳米颗粒（silver nanoparticles，AgNPs）的自膨胀金属支架（SEMS）对 24 只兔进行胆管重建，通过胆道造影、大体观察、Masson 染色等方法证明了覆有 AgNPs 涂层的金属支架网可以显著抑制支架诱导的组织增生和兔胆管内胆汁淤积物的形成。而 Yan 等[30]为了增强 3D 打印支架内的生物反应特性，开发了一种添加肽两亲物（peptides amphiphiles，PAs）的 3D 可印刷巯基化明胶生物，以定制其生物活性和纳米结构，从而增强细胞与支架材料的生物相容性。他们证明了通过在含有胆管细胞的 3D 打印生物油墨中使用基于层黏连蛋白 A 链肽 I-5-V（ile-lys-val-ala-val，IKVAV）的 PAs 系统，可以刺激胆管细胞形成功能性管状结构。总之，材料学的发展会极大地促进组织工程化胆管的发展。
1.2 种子细胞
胆道完全接受肝动脉单一供血，加上胆管上皮细胞具有高耗氧、高代谢、低缺氧耐受的特性，胆管上皮细胞损伤后更加难以恢复，不仅给各种胆道损伤的治疗带来困扰，也给组织工程化胆管中种子细胞的选取带来不便[10, 31-32]。近年来，随着干细胞技术的发展，种子细胞的选择又增加了一种途径[25, 33]。有大量的研究者已经通过干细胞的定向诱导分化得到了胆管上皮细胞，例如，Cardinale 等[34]和 Carpino 等[35]团队成功将胆管来源的干细胞在体外诱导分化为胆管上皮细胞。随后，Zhou 等[36]利用类似方法将猪骨髓间充质干细胞（BMSCs）成功诱导分化为胆管上皮样细胞。笔者所在团队在李立教授的带领下，在滇南小耳猪及大鼠[37]肝卵圆细胞（HOC）的定向诱导分化中也取得了良好的效果，团队采用表皮生长因子（EGF）、干细胞生长因子（SCF）、白血病抑制因子（LIF）等细胞因子联合定向诱导 HOC 定向分化为表达胆管上皮细胞特异标志物的细胞，表明经定向诱导分化后的 HOC 亦可作为组织工程化胆管的种子细胞。2019 年 Wu等[38]报道了一种在体外使用混合培养基将人类多能干细胞（PSCs）分化为具有胆囊和胆管的肝组织的方法，该方法分为 3 个阶段、共 45 d。这一发现不仅为体外研究人类肝胆疾病的分子基础提供了一个强有力的方法，而且为组织工程化胆管的建立提供了新的方向。不同来源的胆管上皮细胞的优劣见表 1。
表1
不同来源胆管上皮细胞的优劣
1.3 细胞和材料的复合及体内修复
胆管的生理位置及功能要求组织工程化胆管不仅具有引流功能，还能够耐受胆汁的浸泡，这就要求支架材料在植入前最好就在表面形成覆膜，这给种子细胞与材料的相容性提出了更高的要求[12, 25]。
2015 年，杨扬等[39]将来源于猪的 BMSCs 定向诱导分化为胆管内皮细胞，并证实了其与聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）纳米纤维具有良好的生物相容性。2017 年 Zong 等[40]利用新型双层聚合物支架结合人骨髓间充质干细胞（hMSCs）用于胆道疾病的治疗，他们首先通过体外实验证实 PCL/PLGA 支架与 hMSCs 具有生物相容性，证明了新型支架能够支持 hMSCs 的黏附、增殖和基质沉积，并制备了 hMSCs-PCL/PLGA 构建体（MPPCs）；然后通过大体观察和组织学方法评估了 MPPCs 在 18 只猪中的体内胆管修复效果，结果所有实验动物均无胆管狭窄和胆汁淤积的迹象，且发现该支架不仅能支撑胆道，允许胆汁自由流动，而且对损伤胆管的修复具有直接或间接的积极作用；移植后 4 周通过冰冻切片、并使用共聚焦显微镜进行体内细胞追踪，可见移植后猪模型中的人类细胞仍然存活，在 12 周后人类细胞消失；6 个月时，与空白 PCL/PLGA 支架相比，MPPCs 对胆管损伤具有更好的再灌注效果。该结果说明 hMSCs 在胆道的修复过程中可能起到了一定的过渡作用，在宿主细胞未移行至覆盖支架前对支架具有一定的保护作用。2019 年，Liu 等[24]在异种脱细胞动脉基质修复滇南小耳猪肝外胆道缺损的研究中到了类似的效果：在免疫荧光检测中可见移植 8 周后术前植入的绿色荧光蛋白 GFP+ 的胆管细胞仍然存活，这也提示了移植前植入的胆管上皮细胞形成了被覆上皮，可以成功地抵抗胆汁入侵，保护无细胞动脉基质，直至新生胆管形成。
2019 年，Chen 等[41]在工程化大鼠肝移植后肝内胆管再生的研究中，在灌注条件下对移植物再细胞化，通过组织学分析发现胆道上皮细胞形成了管状结构，存活的肝细胞团驻留在实质间隙，其排列方式与天然组织高度相似。这一发现不仅证明了在脱细胞大鼠肝脏中重建胆管的可行性，也给 EHBD 支架表层覆膜的构建提供了新的思路。
2 体外胆管平台
体外胆管平台的建立可以弥补传统二维细胞培养和动物实验的不足，可以动态操控和实时观察重要的生理病理过程，提高疾病的研究水平和药物的研发效率。近年来，组织工程化胆管的体外平台建设取得一些阶段性的成果，特别是 3D 打印技术的普遍应用也助力了胆管体外测试平台的进展。在生物材料领域中，关于 3D 打印的研究[42]表明，利用生物相容性打印角化细胞、成纤维细胞和干细胞是可能的。虽然重塑组织或器官的结构完整性和功能尚未实现，但是 3D 打印制备的组织工程化的管状组织可以作为体外测试平台，用于药物测试和管状组织的功能测定（包括力学、生物学等功能的测定），以及用于建立肿瘤模型。2019 年 Tysoe 等[43]开发了一种适用于胆管重建的生物工程化胆管组织的生成方案，他们在人源胆总管上分离胆管细胞，2 周内即可衍生出表达关键胆汁标志物并保留原代肝外或肝内胆管细胞功能的胆管细胞器官样细胞（COs）。COs 对应于成熟的功能性胆管细胞，为胆管生理学和病理生理学的研究提供了一个独特的平台，由此产生的生物工程组织在再生医学和胆管疾病方面有着广泛的应用。2020 年，Li 等[44]采用三维打印技术制备了 PCL/明胶/PCL 复合支架，作为 COs 增殖、迁移和分化的基质；其具有良好的力学性能，压缩模量可达 17.41 kPa，杨氏模量可达 5.03 kPa，能够满足植入体内的相关要求，亦可用于未来仿生人工胆管的构建。Thomas 等[45]通过计算机辅助设计（CAD）生成 EHBD 模型，并评估了福拉思弹性树脂、柔性树脂和耐久树脂 3 种材料在37 ℃ 下浸泡于水、PBS 或胆汁酸溶液中 1 周后的机械性能变化，最终建立了精确的 EHBD 模型，其有助于更真实的胆道支架原型临床前体外测试。已有大量研究证明，在生物反应器系统中培养的 3D 多孔支架上干细胞的扩增有利于在组织工程策略中维持原始细胞功能，但这也使获取祖细胞群成为一项挑战[46]。Du 等[47]报道了一种具有功能的胆管芯片，作为一个体外平台，这种胆管芯片在结构和器官功能上具有胆管的基本特征，可利用各种来源的胆管细胞对胆管的病理生理学进行研究。
2018 年，在组织工程化血管领域，Loy 等[18]报道了一种新颖的具有成本效益的管状多层组织培养系统（TMCS），其利用纤维素化胶原凝胶作为支架，采用简单的成型技术和旋转系统上的内皮化步骤，在 48 h 内轻松制备出细胞结构精细的三层动脉壁模型。该方法在未来亦可在组织工程化胆管的体外测试平台建立中加以应用。
总之，组织工程化胆管的体外测试平台的发展给临床及动物模型的研究带来了极大的便利，推动着管状组织工程的进步（图 1）。
图1
示体外胆管测试平台的应用
3 小结
组织工程化胆管在过去的几十年中得到了较为广泛的研究，但在临床上的研究还较为落后。一方面是因为随着胆肠吻合技术的标准化，临床上的大部分医源性胆道损伤可以通过此术式或简单的吻合在一定程度上得以重建；另一方面是因为，目前的组织工程化的胆管解决不了移植物在体内的快速血管化过程，这就限制了其在临床上的应用价值。虽然 Struecker 团队[3]及李立团队[24]在动物模型中，分别于术后 2 周及 8 周都检测到了移植物上有胆管上皮细胞的覆盖，且经磁共振胰胆管成像（magnetic resonance cholangiopancreatography，MRCP）证实了胆道的通畅；但是考虑到移植物的血管重建进程及胆管上皮细胞不耐受缺血缺氧的特性，在移植部位检测到的胆管上皮细胞的来源尚有待商榷，相应的组织工程化胆管发挥的究竟是过渡还是替代作用尚未有明确的结论。在胆道吻合手术后 6～18 个月吻合部位的瘢痕形成问题也缺乏有力的研究，组织工程化胆管是否能长期替代天然胆管仍需科研工作者进行更长时间、更深层次的研究。体外胆管测试平台的发展仅仅对组织工程化胆管生物学、力学等特性的研究提供了便利，给动物实验提供一定的指导，但并不能代替动物实验。组织工程化胆管的血管形成问题仍在极大程度上限制着其临床应用，但是随着材料学、表面改性技术、细胞学和 3D 打印技术的发展，包括血管内皮生长因子的使用，以及支架上联合培养周细胞、内皮细胞等方法的使用[48]，组织工程化胆管材料的性能会更加全面、优越，在未来组织工程化胆管的发展会更加迅速。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：冯世明负责文章撰写；李立负责文章内容的审阅及提出意见；胡继仲及刘威负责文献的补充查阅。
组织工程化胆管可以替代临床上医源性胆管损伤、胆管的离断伤、电灼伤、肝移植等[1-2]原因导致的肝外胆管狭窄以及一些先天性胆管疾病的肝外胆管（extrahepatic bile duct，EHBD），此法可以避免传统胆肠吻合治疗所带来的 Oddi’s 括约肌功能损害，术后发生胆汁漏、胆管阻塞、胆管感染甚至胆汁性肝硬化等并发症的风险极大降低，也为患者减轻了经济负担[3-8]。胆道并发症作为死亡供体肝移植术后移植物失败的主要原因，也给胆道损伤的治疗提出了更迫切的要求[9-10]。组织工程化管状系统的发展给肝外胆道损伤疾病及肝移植术后胆道良性狭窄的治疗带来了新的治疗方式[11]。针对组织工程化胆管的研究主要集中在支架材料、种子细胞及两者的复合培养上[12]。近来，众多研究者指出，通过自体或干细胞再细胞化的脱细胞异体细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是最有前途的支架材料[13]。由于来自动物的异种组织可能具有残留的免疫原性，并可能受到生物制剂的污染，故而人异基因组织是获得适合于再细胞化和植入的 ECM 的理想材料。针对胆管 ECM 的国内外研究包括脐静脉脱细胞基质[1]、输尿管脱细胞基质[14]、人胎盘绒毛膜脱细胞血管基质[15-16]、脱细胞胰腺基质[17]等。组织工程化胆管的研究较组织工程化血管落后，主要原因是胆道特殊的生理环境要求支架材料具有较强的抗腐蚀性、具有一定的拉力，同时也要求种子细胞能耐受高碱性环境。性能优越的组织工程胆管支架需要有利于细胞的增殖、黏附和迁移，同时它还需要促进血管生成。管状组织工程的发展是一个具有挑战性的研究领域，旨在提供组织替代品，此外也为药物和医疗设备的测试提供体外模型，甚至用于研究疾病的生理和病理过程[18]。现将组织工程化胆管的发展现状作一综述，旨在给临床及科研人员提供新的治疗方案及科研思路。
1 胆管的体内修复
目前胆管的缺损及离断损伤修复模型的构建主要集中在兔、狗、猪等实验动物，相关的研究主要集中在支架材料的制备、种子细胞的获取、种子细胞在支架材料上的生物相容性及支架在动物模型中的应用效果上。
1.1 支架材料
国内外关于支架材料的研究包括不可吸收材料、可降解材料、复合材料等。其中，复合材料是当下研究的热点。
1.1.1 不可吸收材料
在人工胆管研究初期，包括涤纶、各种合金、聚四氟乙烯等聚合物在内的不可吸收材料的应用较为广泛[12]。在不可吸收材料的研究领域，2011 年 Schanaider 团队[19]对 10 只胆道梗阻的狗使用膨胀聚四氟乙烯补片治疗，结果在 6 只狗中发现补片作为游离腔异物部分黏附于胆总管，提示了聚四氟乙烯的使用应该慎重。2017 年，Tal 等[20]通过一项多中心随机试验，比较了 48 例被确诊为原位肝移植术后吻合口胆管狭窄（anastomotic biliary stricture，ABS）患者使用塑料和金属支架的不同效果，发现有 10 例（20.8%）患者在中位随访 500 d 后（范围 48～1 317 d）出现狭窄复发。这不仅给患者增加了经济负担，也提示了不可吸收材料在组织工程化胆管领域的发展中具有局限性。
1.1.2 可降解高分子合成材料
常用的可降解高分子合成材料有聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚己内酯（PCL）等各种聚合物[12]。同时，研究者也在不断地开发各种新型材料。2016 年马利锋等[21]对 15 只巴马小型猪采用团队新制备的聚癸二酸丙二醇聚酯支架联合大网膜进行胆道损伤修复，术后的修复效果优于单纯的对胆道进行间断缝合（对照组），术后 6 个月可见 α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）明显较对照组减少，说明他们制备的新型生物可降解支架材料具有良好的生物特性，应用于胆道损伤中可以获得理想的修复效果，但是由于胆道的瘢痕形成及由于瘢痕导致的胆道狭窄及梗阻最常发生于术后的 12～18 个月，所以该种材料的修复效果还有待进一步的深入研究。
1.1.3 脱细胞的 ECM
在脱细胞方案标准化后，大多数的研究表明，脱细胞 ECM 支架可以为不同类型的种子细胞生长提供一个最佳的平台，通过对该平台再细胞化处理后、开发完全个性化的临床方法成为研究热点[13]。针对胆管替代 ECM 材料的国内外研究包括脐静脉脱细胞基质、输尿管脱细胞基质、人胎盘绒毛膜无细胞血管基质等[14, 22-23]。
2016 年，Struecker 等[3]使用自体胆管细胞再细胞化的同种异体血管脱细胞基质构建的新胆管，植入 5 头家猪体内，14 d 后处死实验动物。所有猪都在整个研究期间存活，血液检查及磁共振结果未见严重并发症；组织学检查发现中性粒细胞侵入新胆管，并在植入组织周围和内部观察到新血管生成。2019 年，Liu 等[24]使用异体胆管上皮细胞再细胞化的异种脱细胞动脉基质修复滇南小耳猪肝外胆道缺损模型，取得了良好的效果，实验组动物可长期存活达 8 周；在术后 1、2、4 和 8 周通过磁共振胆道成像、肝功能检测、血常规检测、HE 染色、免疫荧光、蛋白质印迹（Western Blot）等方法初步评价了再细胞化人源脱细胞动脉基质修复猪胆总管节段性缺损的可行性。
1.1.4 复合材料
复合材料是当下研究的热点，各种支架材料均可以经过浸涂、电镀、叠层组装、水解、等离子处理、电子束辐射、接枝共聚合、界面聚合等表层修饰方法获得一定的表面改性，进而增加细胞在材料上的黏附及增殖效果[25-27]。2018 年，Khorramirouz 等[28]考虑到支架材料在体内可能发生形变而影响效果，通过大鼠皮下植入手术证明了与传统方法相比，由 PCL 纤维组成的支架是一种有效的支撑结构，可以有效地保持支架的位置，防止降解，减少炎症。这提示复合材料可能更加适用于于组织工程化胆管的构建。
2020 年 Park 等[29]使用涂覆有银纳米颗粒（silver nanoparticles，AgNPs）的自膨胀金属支架（SEMS）对 24 只兔进行胆管重建，通过胆道造影、大体观察、Masson 染色等方法证明了覆有 AgNPs 涂层的金属支架网可以显著抑制支架诱导的组织增生和兔胆管内胆汁淤积物的形成。而 Yan 等[30]为了增强 3D 打印支架内的生物反应特性，开发了一种添加肽两亲物（peptides amphiphiles，PAs）的 3D 可印刷巯基化明胶生物，以定制其生物活性和纳米结构，从而增强细胞与支架材料的生物相容性。他们证明了通过在含有胆管细胞的 3D 打印生物油墨中使用基于层黏连蛋白 A 链肽 I-5-V（ile-lys-val-ala-val，IKVAV）的 PAs 系统，可以刺激胆管细胞形成功能性管状结构。总之，材料学的发展会极大地促进组织工程化胆管的发展。
1.2 种子细胞
胆道完全接受肝动脉单一供血，加上胆管上皮细胞具有高耗氧、高代谢、低缺氧耐受的特性，胆管上皮细胞损伤后更加难以恢复，不仅给各种胆道损伤的治疗带来困扰，也给组织工程化胆管中种子细胞的选取带来不便[10, 31-32]。近年来，随着干细胞技术的发展，种子细胞的选择又增加了一种途径[25, 33]。有大量的研究者已经通过干细胞的定向诱导分化得到了胆管上皮细胞，例如，Cardinale 等[34]和 Carpino 等[35]团队成功将胆管来源的干细胞在体外诱导分化为胆管上皮细胞。随后，Zhou 等[36]利用类似方法将猪骨髓间充质干细胞（BMSCs）成功诱导分化为胆管上皮样细胞。笔者所在团队在李立教授的带领下，在滇南小耳猪及大鼠[37]肝卵圆细胞（HOC）的定向诱导分化中也取得了良好的效果，团队采用表皮生长因子（EGF）、干细胞生长因子（SCF）、白血病抑制因子（LIF）等细胞因子联合定向诱导 HOC 定向分化为表达胆管上皮细胞特异标志物的细胞，表明经定向诱导分化后的 HOC 亦可作为组织工程化胆管的种子细胞。2019 年 Wu等[38]报道了一种在体外使用混合培养基将人类多能干细胞（PSCs）分化为具有胆囊和胆管的肝组织的方法，该方法分为 3 个阶段、共 45 d。这一发现不仅为体外研究人类肝胆疾病的分子基础提供了一个强有力的方法，而且为组织工程化胆管的建立提供了新的方向。不同来源的胆管上皮细胞的优劣见表 1。
表1
不同来源胆管上皮细胞的优劣
1.3 细胞和材料的复合及体内修复
胆管的生理位置及功能要求组织工程化胆管不仅具有引流功能，还能够耐受胆汁的浸泡，这就要求支架材料在植入前最好就在表面形成覆膜，这给种子细胞与材料的相容性提出了更高的要求[12, 25]。
2015 年，杨扬等[39]将来源于猪的 BMSCs 定向诱导分化为胆管内皮细胞，并证实了其与聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）纳米纤维具有良好的生物相容性。2017 年 Zong 等[40]利用新型双层聚合物支架结合人骨髓间充质干细胞（hMSCs）用于胆道疾病的治疗，他们首先通过体外实验证实 PCL/PLGA 支架与 hMSCs 具有生物相容性，证明了新型支架能够支持 hMSCs 的黏附、增殖和基质沉积，并制备了 hMSCs-PCL/PLGA 构建体（MPPCs）；然后通过大体观察和组织学方法评估了 MPPCs 在 18 只猪中的体内胆管修复效果，结果所有实验动物均无胆管狭窄和胆汁淤积的迹象，且发现该支架不仅能支撑胆道，允许胆汁自由流动，而且对损伤胆管的修复具有直接或间接的积极作用；移植后 4 周通过冰冻切片、并使用共聚焦显微镜进行体内细胞追踪，可见移植后猪模型中的人类细胞仍然存活，在 12 周后人类细胞消失；6 个月时，与空白 PCL/PLGA 支架相比，MPPCs 对胆管损伤具有更好的再灌注效果。该结果说明 hMSCs 在胆道的修复过程中可能起到了一定的过渡作用，在宿主细胞未移行至覆盖支架前对支架具有一定的保护作用。2019 年，Liu 等[24]在异种脱细胞动脉基质修复滇南小耳猪肝外胆道缺损的研究中到了类似的效果：在免疫荧光检测中可见移植 8 周后术前植入的绿色荧光蛋白 GFP+ 的胆管细胞仍然存活，这也提示了移植前植入的胆管上皮细胞形成了被覆上皮，可以成功地抵抗胆汁入侵，保护无细胞动脉基质，直至新生胆管形成。
2019 年，Chen 等[41]在工程化大鼠肝移植后肝内胆管再生的研究中，在灌注条件下对移植物再细胞化，通过组织学分析发现胆道上皮细胞形成了管状结构，存活的肝细胞团驻留在实质间隙，其排列方式与天然组织高度相似。这一发现不仅证明了在脱细胞大鼠肝脏中重建胆管的可行性，也给 EHBD 支架表层覆膜的构建提供了新的思路。
2 体外胆管平台
体外胆管平台的建立可以弥补传统二维细胞培养和动物实验的不足，可以动态操控和实时观察重要的生理病理过程，提高疾病的研究水平和药物的研发效率。近年来，组织工程化胆管的体外平台建设取得一些阶段性的成果，特别是 3D 打印技术的普遍应用也助力了胆管体外测试平台的进展。在生物材料领域中，关于 3D 打印的研究[42]表明，利用生物相容性打印角化细胞、成纤维细胞和干细胞是可能的。虽然重塑组织或器官的结构完整性和功能尚未实现，但是 3D 打印制备的组织工程化的管状组织可以作为体外测试平台，用于药物测试和管状组织的功能测定（包括力学、生物学等功能的测定），以及用于建立肿瘤模型。2019 年 Tysoe 等[43]开发了一种适用于胆管重建的生物工程化胆管组织的生成方案，他们在人源胆总管上分离胆管细胞，2 周内即可衍生出表达关键胆汁标志物并保留原代肝外或肝内胆管细胞功能的胆管细胞器官样细胞（COs）。COs 对应于成熟的功能性胆管细胞，为胆管生理学和病理生理学的研究提供了一个独特的平台，由此产生的生物工程组织在再生医学和胆管疾病方面有着广泛的应用。2020 年，Li 等[44]采用三维打印技术制备了 PCL/明胶/PCL 复合支架，作为 COs 增殖、迁移和分化的基质；其具有良好的力学性能，压缩模量可达 17.41 kPa，杨氏模量可达 5.03 kPa，能够满足植入体内的相关要求，亦可用于未来仿生人工胆管的构建。Thomas 等[45]通过计算机辅助设计（CAD）生成 EHBD 模型，并评估了福拉思弹性树脂、柔性树脂和耐久树脂 3 种材料在37 ℃ 下浸泡于水、PBS 或胆汁酸溶液中 1 周后的机械性能变化，最终建立了精确的 EHBD 模型，其有助于更真实的胆道支架原型临床前体外测试。已有大量研究证明，在生物反应器系统中培养的 3D 多孔支架上干细胞的扩增有利于在组织工程策略中维持原始细胞功能，但这也使获取祖细胞群成为一项挑战[46]。Du 等[47]报道了一种具有功能的胆管芯片，作为一个体外平台，这种胆管芯片在结构和器官功能上具有胆管的基本特征，可利用各种来源的胆管细胞对胆管的病理生理学进行研究。
2018 年，在组织工程化血管领域，Loy 等[18]报道了一种新颖的具有成本效益的管状多层组织培养系统（TMCS），其利用纤维素化胶原凝胶作为支架，采用简单的成型技术和旋转系统上的内皮化步骤，在 48 h 内轻松制备出细胞结构精细的三层动脉壁模型。该方法在未来亦可在组织工程化胆管的体外测试平台建立中加以应用。
总之，组织工程化胆管的体外测试平台的发展给临床及动物模型的研究带来了极大的便利，推动着管状组织工程的进步（图 1）。
图1
示体外胆管测试平台的应用
3 小结
组织工程化胆管在过去的几十年中得到了较为广泛的研究，但在临床上的研究还较为落后。一方面是因为随着胆肠吻合技术的标准化，临床上的大部分医源性胆道损伤可以通过此术式或简单的吻合在一定程度上得以重建；另一方面是因为，目前的组织工程化的胆管解决不了移植物在体内的快速血管化过程，这就限制了其在临床上的应用价值。虽然 Struecker 团队[3]及李立团队[24]在动物模型中，分别于术后 2 周及 8 周都检测到了移植物上有胆管上皮细胞的覆盖，且经磁共振胰胆管成像（magnetic resonance cholangiopancreatography，MRCP）证实了胆道的通畅；但是考虑到移植物的血管重建进程及胆管上皮细胞不耐受缺血缺氧的特性，在移植部位检测到的胆管上皮细胞的来源尚有待商榷，相应的组织工程化胆管发挥的究竟是过渡还是替代作用尚未有明确的结论。在胆道吻合手术后 6～18 个月吻合部位的瘢痕形成问题也缺乏有力的研究，组织工程化胆管是否能长期替代天然胆管仍需科研工作者进行更长时间、更深层次的研究。体外胆管测试平台的发展仅仅对组织工程化胆管生物学、力学等特性的研究提供了便利，给动物实验提供一定的指导，但并不能代替动物实验。组织工程化胆管的血管形成问题仍在极大程度上限制着其临床应用，但是随着材料学、表面改性技术、细胞学和 3D 打印技术的发展，包括血管内皮生长因子的使用，以及支架上联合培养周细胞、内皮细胞等方法的使用[48]，组织工程化胆管材料的性能会更加全面、优越，在未来组织工程化胆管的发展会更加迅速。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：冯世明负责文章撰写；李立负责文章内容的审阅及提出意见；胡继仲及刘威负责文献的补充查阅。
