引用本文： 刘家瑞, 肖衡, 杜成友. 肝细胞肝癌免疫分型的研究进展. 中国普外基础与临床杂志, 2021, 28(9): 1237-1242. doi: 10.7507/1007-9424.202011062 复制
肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的原发性肝癌类型，占原发性肝癌病例的 75%～85%[1]。全球每年新增 HCC 病例超 50 万例[2]，其致死率位于恶性肿瘤的第 2 位，主要与病毒感染和肝纤维化密切相关[3]。在过去的 10 年中，基因测序技术的突破推动了肿瘤基因组的研究，阐明了肝癌发生发展的部分分子机制，为肝癌的治疗提供了更多的选择[4-5]。近年来，恶性肿瘤免疫治疗取得了突破性进展[6]。在晚期肝癌的治疗中，多种免疫检查点抑制剂（ICIs），如纳武单抗（nivolumab）、派姆单抗（pembrolizumab）、卡瑞利珠单抗等被国内外多个指南推荐作为肝癌的临床治疗选择。遗憾的是，对当前现有的 ICIs 药物在肝癌治疗中效果的多项研究显示出令人不满意的功效：单药低反应率[7-8]。肝癌作为一种免疫原性肿瘤，与相关病毒感染和形成的炎症环境密切相关。在近 5 年里，研究人员开始聚焦于肿瘤微环境的探究，揭露了在肝脏这个免疫特赦器官中[9]免疫微环境与肿瘤的相互作用关系、免疫逃逸和治疗抵抗的机制，以及挖掘潜在的免疫治疗靶点。基于这些发现，研究人员将 HCC 进行了免疫分型，旨在更好地评估 HCC 患者的预后以及为免疫治疗的决策提供指导，同时也是目前 HCC 治疗趋向个性化的一项重要补充。笔者现就 HCC 基于肿瘤微环境的免疫分型及其临床应用价值进行综述。
1 目前 HCC 的诊疗现状
HCC 患者的治疗主要依据病理分类分型，根据综合各因素的分期方案以指导治疗决策。国外有多种分期方案，如：巴塞罗那临床肝癌分期（BCLC 分期）、TNM 分期、Edmondson 分期、亚太肝病学会分期（APASL 分期）等，其中 BCLC 分期方案被国内外所广泛认可。2019 年版《原发性肝癌诊疗规范》 [10]依据我国患者的一般情况、肝肿瘤情况以及肝功能情况，更新了中国肝癌的分期方案（China liver cancer staging，CNLC），包括：Ⅰ a 期、Ⅰ b 期、Ⅱa 期、Ⅱb 期、Ⅲa 期、Ⅲb 期和Ⅳ期。针对Ⅰ期和Ⅱa 期的患者，主要采用手术切除和肝移植治疗；对于Ⅱb 期和Ⅲ期患者，除了肝动脉化疗栓塞术（TACE）和手术切除外，还有推荐的一线药物治疗，如索拉菲尼、仑伐替尼等。随着 2017 年美国食品药品监督管理局（FDA）批准纳武单抗用于晚期肝癌的二线治疗[8]，更多的 ICIs 被推荐应用于晚期肝癌的治疗。同时，近 20 年来，研究者通过基因技术对转录组分子进行分型，发现了许多 HCC 分子亚型与 HCC 的预后有显著的相关性，这也为不同类型患者采用相应的分子靶向药物奠定了基础[11]。由于免疫治疗在晚期肝癌中的治疗效果未达预期，研究者开始将目光转向肿瘤的免疫微环境，旨在揭露肝癌的免疫机制，进而对 HCC 患者进行更准确的分类，从而选择更有效的个性化治疗方案。
2 基于肿瘤微环境基因组的免疫分型
2017 年，TCGA 团队[12]对 196 例肝癌的组织病理学资料的分析显示，22% 的肝癌显示出高度或中度的淋巴细胞浸润；该团队进一步对 66 种免疫标志物的基因表达结果进行无监督分层聚类，识别了 6 个肿瘤样本簇，其中有两个簇显示免疫标志物的高表达，包括的免疫检查点基因有：细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4（CTLA-4）、程序性死亡受体 1（PD-1）和程序性死亡配体 1（PD-L1）。这可能说明了：ICIs 治疗对含有中度或高度淋巴细胞浸润，以及免疫抑制分子高表达的 HCC 能产生强烈的效应[13]。
同年，Sia 等[14]通过检测 228 例 HCC 样本中与免疫相关的基因组信号，进一步进行无监督聚类，最终发现了一个新类群，占总样本数的 24%（55/228），他们将其定义为“免疫类（immune class）”。与非免疫类样本比较，免疫类患者具有炎症反应的标志，其特征包括免疫细胞的高度浸润、增强的细胞溶解活性、PD-1 和 PD-L1 的高表达、活跃的干扰素-g（IFN-g）信号以及类似于对免疫治疗有强反应的黑色素瘤的分子特征；再以 728 例患者的 HCC 样本进行验证，也发现近 25% 的患者有炎症反应的标志，推测这类患者可能是接受免疫治疗的理想人选；此外，在对肿瘤微环境免疫信号的进一步探究中，发现了 3 种特征性的样本，具有不同的免疫浸润细胞类型和免疫反应，可以进一步分为不同的亚型（图 1）。
图1
示基于肿瘤微环境基因组的免疫分型
2.1 免疫衰竭型（exhausted immune subtype）
在 33%（18/55）的免疫类患者中，其肿瘤微环境的免疫簇表现出抑制的免疫反应，以促瘤信号为特征，如 T 细胞衰竭，转化生长因子-β（TGF-β）、M2 型巨噬细胞等免疫抑制成分富集，Sia 等[14]将具有该特征的免疫类患者定义为免疫衰竭型。值得一提的是，TGF-β 是一种在侵袭性癌症中经常过度表达的有效免疫调节细胞因子，其活化后能调节肿瘤上皮-间质的相互作用、血管生成和转移，并通过诱导 T 细胞衰竭[15-16]和促进 M2 型巨噬细胞形成[17]来抑制宿主免疫应答，提示免疫衰竭型是一种更具有侵袭性的免疫亚型。吴志超等[18]的研究显示，TGF-β1的高表达与肿瘤大小、血管侵犯、AFP 水平、肿瘤数目和分化程度有相关性。因而该类患者通过TGF-β 抑制剂联合 ICIs 治疗获得更多收益是可能的。
2.2 免疫激活型（active immune subtype）
在剩余的免疫类患者中（67%，37/55），其肿瘤微环境的免疫簇表现出抗肿瘤特征，如 T 细胞和干扰素（IFN）信号的富集以及适应性免疫反应基因的过度表达，Sia 等[14]将其称为主动免疫反应，并将拥有该特征的免疫类患者定义为免疫激活型；同时将免疫衰竭型和免疫激活型的免疫簇与临床参数相关联，发现主动免疫反应组（免疫激活型）的肿瘤复发率更低且生存趋势更好。
2.3 免疫豁免型（privileged immune subtype）
在总的患者样本中，有一类始终被排除在免疫类之外，樊嘉等[19]将其定义为免疫豁免型，其特征是肝脏相关的 Wnt 靶基因过表达、核型 β-连环蛋白染色的富集和 CTNNB1 基因的突变。CTNNB1 途径的激活与 T 细胞排斥相关。与免疫类患者和非免疫类其他类型患者相比较，免疫豁免型表现出更低水平的免疫特征信号富集，特别是 T 细胞浸润的缺乏。
3 基于肿瘤微环境免疫细胞的免疫分型
2018 年，Kurebayashi 等[20]利用多重免疫组织化学染色方法，对来自 141 例患者的 158 份肝癌样本的 919 个区域的免疫细胞进行了全面的聚类分析，将其分为了 3 种不同的免疫亚型：高免疫亚型（immune-high subtype）、中免疫亚型（immune-mid subtype）和低免疫亚型（immune-high subtype）。高免疫亚型以 B 细胞、浆细胞以及 T 细胞浸润增多为特征，中免疫亚型的 T 细胞和其他免疫细胞浸润中度增加、B 细胞和浆细胞浸润较少，低免疫亚型的免疫细胞浸润程度很低；同时，该研究还阐述了高免疫亚型和 B 细胞浸润是独立的预后因素。以高免疫亚型为主的高级别肝癌患者的预后明显较好，特别是 CK19+ 或 SALL4+ 高级别 HCC[5, 21]。以高免疫亚型为主的 HCC 约占低分化 HCC 的 25%[20]，在低分化 HCC 中也发现高免疫亚型会获得明显更好的预后。特别地，高免疫亚型有一个富含 CXCL9、CXCL10 趋化因子以及 Th1、CTL 型细胞因子的免疫微环境，而 CXCL9 和 CXCL10 的表达与许多肿瘤的淋巴细胞浸润有关[22-23]，这与上述基于基因组方法定义的“免疫类”相一致。
随后，在 2019 年，Zhang 等[24]收集了来自 8 例 HCC 患者的 42 份样本，通过聚集肿瘤微环境的免疫细胞，比较样本之间的相似性并进行分层聚类，最终形成了 3 个聚类。接着，该研究还进一步揭示了不同亚型的免疫状态、趋化因子和细胞因子表达水平以及细胞代谢的特征。同时，为了临床实用性，该团队利用两种免疫组织化学检测的标志物的密度界值定义了这 3 种免疫亚型（图 2）。
图2
示基于肿瘤微环境免疫细胞的免疫分型
3.1 免疫活性亚型（immunocompetent subtype）
将 HCC 组织进行免疫组织化学染色，以 CD45+ 细胞 ≥100 个/mm2 定义为 CD45 高表达，同时以 Foxp3+ 细胞 <25 个/mm2 定义为 Foxp3 低表达，CD45 高表达和 Foxp3 低表达定义为免疫活性亚型。免疫活性亚型有相对正常的 T 细胞浸润水平 ［包含抗肿瘤 T 细胞（CD8+CD127+ T 细胞、CD4+CD127+ T 细胞和 γδT 细胞）］ 以及较少浸润的 B 细胞特别是 Breg 细胞。而且该亚型特有的尿素循环代谢提供了更多的精氨酸，可通过增强 T 细胞存活能力及其抗肿瘤功能来增强免疫[25]。因而免疫活性亚型 HCC 患者具有相对较强的抗肿瘤免疫能力，预后更加良好。然而，该亚型的细胞毒性分子的释放水平相对较低，这提示其浸润性 T 细胞的抗肿瘤功能可被进一步激活，所以就免疫活性亚型患者而言，T 细胞反应激活剂（如 IL-12 和 CpG 寡核苷酸）和 ICIs 的联合使用可能是有效的治疗方案[26-28]。
3.2 免疫缺陷亚型（immunodeficient subtype）
以 CD45+ 细胞 <100 个/mm2定义为 CD45 低表达，此类患者归为免疫缺陷亚型，其特点是树突状细胞（DC 细胞）和自然杀伤细胞（NK 细胞）的富集，淋巴细胞浸润的减少以及 CD45+ 细胞的缺乏（与其他 2 个亚型相比减少约 40%[24]）。在免疫缺陷亚型样本中发现髓系抑制细胞（MDSCs）的增加，同时所有与免疫抑制相关的标记信号：如淋巴细胞活化基因-3（LAG3）、程序性细胞死亡基因（PDCD1）、T 细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（TIM-3）、带有免疫球蛋白及 ITIM 结构域的 T 细胞免疫受体（TIGIT）、肿瘤坏死因子受体超家族 9（TNFRSF9）以及功能基因 ［如颗粒酶 A（GZMA）和颗粒酶 B（GZMB）］ 的表达水平均上调，所有趋化因子和细胞因子的表达水平都很低，这些特点与其免疫缺陷相符合。免疫缺陷亚型肝癌更像是所谓的“冷”肿瘤，几乎没有浸润的淋巴细胞，这限制了 ICIs 的疗效。因此，ICIs 与溶瘤病毒（如 JX-594）或多肽（如 LTX-315）联合应用可显著增强淋巴细胞浸润[29-31]，对该亚型肝癌有较好的治疗前景。抗肿瘤血管生成的靶向药物（如索拉非尼或贝伐单抗）通过促进 T 细胞转运或抑制 MDSCs 也可能提高 ICIs 对该亚型患者的疗效[32-33]。
3.3 免疫抑制亚型（immunosuppressive subtype）
CD45 高表达和 Foxp3 高表达者定义为免疫抑制亚型。该亚型以 Treg 细胞和免疫抑制性 CD4+ T 细胞（CD4+CD25+CD127–Foxp3+ T 细胞）增多为特征[34]，免疫抑制亚型样本显示为高密度的 Treg 细胞、Breg 细胞和 M2 型巨噬细胞，这些细胞都是免疫抑制细胞，且包括 PD-1、PD-L1、TIM-3 和 CTLA-4在内的免疫抑制分子的表达水平显著上调；同时，还观察到血管内皮生长因子 A（VEGFA）和许多编码抑制肿瘤的趋化因子或细胞因子的基因（如 TGF-β1、CCL8 和 IL-10）的过度表达。免疫抑制型 HCC 患者具有正常的淋巴细胞浸润，但免疫抑制细胞的数目显著增加。然而，值得注意的是，尽管免疫抑制成分在 RNA 和蛋白质水平上都被检测到过表达，但具有细胞毒功能的基因（如颗粒酶家族成员和 IFN-g）的上调表明抑制的细胞毒性 T 细胞是在激活时诱导的，而不是由固有缺陷诱导的[35]。所以在这种情况下，多种 ICIs 治疗可以恢复这些抑制性 T 细胞的抗肿瘤效力，提高免疫治疗反应效率；而且，VEGFA 和 TGF-β1 的过度表达提示 ICIs 联合抗血管生成药物可能使患者获益更多。
4 免疫分型在临床中的应用价值
目前，基于免疫治疗的精准识别主要依赖生物标志物（biomarker），以预测免疫治疗反应，确定哪些患者将从治疗中受益最大，从而提供有价值的决策和预后信息。肿瘤细胞或浸润性免疫细胞的PD-L1 表达上调、高肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）和肿瘤浸润性 CD8+ T 细胞密度增加是最被认可的与治疗反应相关的生物标志物。在 2015 和 2016 年，美国 FDA 将 PD-L1 的免疫组织化学染色分别纳入肺癌和黑色素瘤的辅助检查中，肯定了 PD-L1 的表达在两种疾病诊断和治疗中的价值。但在 CheckMate 040 研究中[8]，纳武单抗治疗晚期 HCC 患者的亚组分析结果显示，PD-L1 表达阳性（PD-L1≥1%）患者的有效率比 PD-L1 阴性患者（PD-L1<1%）略高（爬坡组：27% 比 12%；扩展组：26% 比 19%），表明对 HCC 而言，PD-L1 作为反应生物标志物的能力一般。Yarchoan 等[36]汇总了公开发表的临床试验中接受过 PD-1/PD-L1 抑制剂治疗的 27 种肿瘤（包括 HCC）的结果，发现各肿瘤的免疫应答率与 TMB 呈线性关系：TMB 越大，PD-1 抑制剂有效率越高。最近，Samstein 等[37]还证实了 TMB 能预测多种肿瘤免疫治疗后的生存率，并与接受 ICIs 治疗的患者的存活率提高有关，ICIs 的疗效随着 TMB 值的增加而增高。遗憾的是，该研究没有纳入 HCC 患者，高突变是否与接受 ICIs 的 HCC 患者的预后呈正相关有待进一步研究。此外，一些临床试验也评估了 CD8+ T 细胞密度与抗PD-1/PD-L1 治疗的临床疗效之间的相关性。例如，在抗 PD1 治疗黑色素瘤的一项研究中[38]，CD8+ T 细胞密度与抗 PD1 治疗的反应呈正相关。最近的一项研究[39]显示，抑制性的高表达 PD-1 的 CD8+ T 细胞密度与 HCC 的临床预后不良相关，其密度随肿瘤分期的增加而增加，提示抑制性的 CD8+ T 细胞密度与 HCC 的进展有关，可作为一个潜在的免疫治疗靶点。此外，病毒相关肿瘤对 PD-1 通路阻断有很高的反应率，HBV 和 HCV 导致的 HCC 对抗 PD-1 治疗的有效应答率已有报道。Yarchoan 等[36]的研究也显示一些与病毒相关的肿瘤（包括 HCC）的客观应答率高于预期，这表明在某些肿瘤类型中出现病毒抗原可能会增加抗 PD-1 治疗的应答率。这可能是因为致癌病毒的整合代表了肿瘤的另一种基因改变，赋予了新的抗原性，亦或是病毒感染与慢性炎症的作用赋予了上述相关的免疫类型。
肿瘤特异性突变可导致编码新抗原，基因突变负荷较大的肿瘤可能拥有更多的新抗原，因此患者拥有更多浸润的肿瘤特异性 T 细胞。由此可见，PD-L1 的表达、TMB 以及肿瘤浸润性淋巴细胞在功能上是相互关联的，并且经常在单个肿瘤标本中协同发现。同样，基于分子水平和细胞水平的两种免疫分型方法，在免疫类型的特征上有高度相似的地方，说明了在异质性很强的 HCC 中，其免疫微环境是相对稳定的，这使 HCC 的免疫分型成为可能。此外，与单因素标记相比，多因素标记具有更强的预测能力，这奠定了 HCC 免疫分型的临床应用基础。对肿瘤微环境进行广泛的免疫分析，从不同水平并综合多因素进行分类分型，可以更全面地指导 HCC 的治疗，从而改善预后。例如：在免疫激活亚型中，其正常的 T 淋巴细胞浸润以及较少的细胞毒性分子提示 ICIs 与 T 细胞反应激活剂联合应用可能有效。免疫豁免型或免疫缺陷亚型的 HCC 患者由于缺乏 T 细胞的浸润而限制了 ICIs 的疗效，这与肿瘤浸润性淋巴细胞密度作为生物标志物的研究结果相一致，对该类患者采用 ICIs 与增强淋巴细胞浸润的溶瘤病毒或者促进 T 细胞转运的抗肿瘤血管生成的靶向药物（索拉非尼或贝伐单抗）联合治疗可能会提高反应率。同样地，在免疫抑制亚型的 HCC 患者中，包括 PD-1、PD-L1、TIM-3 和 CTLA-4 在内的免疫抑制性分子的表达水平增加，且 VEGFA 和 TGF-β1 过表达，提示多种 ICIs 联用可能对逆转免疫抑制性 T 细胞更有效，ICIs 联合抗血管生成药物也可能带来更多获益。樊嘉团队[40]筛选出了几个特定的肝癌微环境免疫生物标志物（包括 CD3、CD27、CD68、CD103 和PD-1），并联合肿瘤大小、分化程度和 γ-谷氨酰转肽酶（GGT）构建了一个预后模型，其准确性显著优于传统的临床分期。另一项研究[41]建立了一个整合免疫类型、病理表现（肿瘤出芽）、AFP 水平、HBV 感染、微血管侵犯（MVI）和肿瘤分级信息的预后模型，该模型在试验组和验证组均显示出比单独的 BCLC 或 TNM 分期更好的预后能力。所以，基于 HCC 肿瘤微环境的免疫分型在生物标志物的基础上，还综合了更多影响患者治疗效应以及生存预后的因素，对未来 HCC 的治疗和预后有更全面、更准确的临床指导作用。
5 小结与展望
免疫治疗为晚期肝癌患者带来了新的治疗途径，而如今较低的客观反应率以及治疗效果阻碍了它的发展。基于肿瘤免疫微环境的免疫分型与 HCC 患者的抗肿瘤能力以及生存有显著的关联，能够更全面指导 HCC 患者免疫治疗的筛选和决策，以提高免疫治疗的疗效和预后评估，让更多的患者从中获益。近几年，肿瘤微环境成为国内外研究的热点，基于它对 HCC 进行免疫分型还在研究初期，其潜在的临床应用价值需要进一步的大规模队列研究来验证。同时可以发现，不管是目前发现的生物标志物，还是各种免疫分型方案，它们都有显著的共性，因而寻找制定出统一规范的 HCC 免疫微环境评估方案是可行的，相信这是 HCC 免疫治疗未来的研究方向。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们无相互竞争的利益。
作者贡献声明：刘家瑞和肖衡参与了文章的起草和修改，以及图的制作；杜成友对文章进行了审阅。
肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的原发性肝癌类型，占原发性肝癌病例的 75%～85%[1]。全球每年新增 HCC 病例超 50 万例[2]，其致死率位于恶性肿瘤的第 2 位，主要与病毒感染和肝纤维化密切相关[3]。在过去的 10 年中，基因测序技术的突破推动了肿瘤基因组的研究，阐明了肝癌发生发展的部分分子机制，为肝癌的治疗提供了更多的选择[4-5]。近年来，恶性肿瘤免疫治疗取得了突破性进展[6]。在晚期肝癌的治疗中，多种免疫检查点抑制剂（ICIs），如纳武单抗（nivolumab）、派姆单抗（pembrolizumab）、卡瑞利珠单抗等被国内外多个指南推荐作为肝癌的临床治疗选择。遗憾的是，对当前现有的 ICIs 药物在肝癌治疗中效果的多项研究显示出令人不满意的功效：单药低反应率[7-8]。肝癌作为一种免疫原性肿瘤，与相关病毒感染和形成的炎症环境密切相关。在近 5 年里，研究人员开始聚焦于肿瘤微环境的探究，揭露了在肝脏这个免疫特赦器官中[9]免疫微环境与肿瘤的相互作用关系、免疫逃逸和治疗抵抗的机制，以及挖掘潜在的免疫治疗靶点。基于这些发现，研究人员将 HCC 进行了免疫分型，旨在更好地评估 HCC 患者的预后以及为免疫治疗的决策提供指导，同时也是目前 HCC 治疗趋向个性化的一项重要补充。笔者现就 HCC 基于肿瘤微环境的免疫分型及其临床应用价值进行综述。
1 目前 HCC 的诊疗现状
HCC 患者的治疗主要依据病理分类分型，根据综合各因素的分期方案以指导治疗决策。国外有多种分期方案，如：巴塞罗那临床肝癌分期（BCLC 分期）、TNM 分期、Edmondson 分期、亚太肝病学会分期（APASL 分期）等，其中 BCLC 分期方案被国内外所广泛认可。2019 年版《原发性肝癌诊疗规范》 [10]依据我国患者的一般情况、肝肿瘤情况以及肝功能情况，更新了中国肝癌的分期方案（China liver cancer staging，CNLC），包括：Ⅰ a 期、Ⅰ b 期、Ⅱa 期、Ⅱb 期、Ⅲa 期、Ⅲb 期和Ⅳ期。针对Ⅰ期和Ⅱa 期的患者，主要采用手术切除和肝移植治疗；对于Ⅱb 期和Ⅲ期患者，除了肝动脉化疗栓塞术（TACE）和手术切除外，还有推荐的一线药物治疗，如索拉菲尼、仑伐替尼等。随着 2017 年美国食品药品监督管理局（FDA）批准纳武单抗用于晚期肝癌的二线治疗[8]，更多的 ICIs 被推荐应用于晚期肝癌的治疗。同时，近 20 年来，研究者通过基因技术对转录组分子进行分型，发现了许多 HCC 分子亚型与 HCC 的预后有显著的相关性，这也为不同类型患者采用相应的分子靶向药物奠定了基础[11]。由于免疫治疗在晚期肝癌中的治疗效果未达预期，研究者开始将目光转向肿瘤的免疫微环境，旨在揭露肝癌的免疫机制，进而对 HCC 患者进行更准确的分类，从而选择更有效的个性化治疗方案。
2 基于肿瘤微环境基因组的免疫分型
2017 年，TCGA 团队[12]对 196 例肝癌的组织病理学资料的分析显示，22% 的肝癌显示出高度或中度的淋巴细胞浸润；该团队进一步对 66 种免疫标志物的基因表达结果进行无监督分层聚类，识别了 6 个肿瘤样本簇，其中有两个簇显示免疫标志物的高表达，包括的免疫检查点基因有：细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4（CTLA-4）、程序性死亡受体 1（PD-1）和程序性死亡配体 1（PD-L1）。这可能说明了：ICIs 治疗对含有中度或高度淋巴细胞浸润，以及免疫抑制分子高表达的 HCC 能产生强烈的效应[13]。
同年，Sia 等[14]通过检测 228 例 HCC 样本中与免疫相关的基因组信号，进一步进行无监督聚类，最终发现了一个新类群，占总样本数的 24%（55/228），他们将其定义为“免疫类（immune class）”。与非免疫类样本比较，免疫类患者具有炎症反应的标志，其特征包括免疫细胞的高度浸润、增强的细胞溶解活性、PD-1 和 PD-L1 的高表达、活跃的干扰素-g（IFN-g）信号以及类似于对免疫治疗有强反应的黑色素瘤的分子特征；再以 728 例患者的 HCC 样本进行验证，也发现近 25% 的患者有炎症反应的标志，推测这类患者可能是接受免疫治疗的理想人选；此外，在对肿瘤微环境免疫信号的进一步探究中，发现了 3 种特征性的样本，具有不同的免疫浸润细胞类型和免疫反应，可以进一步分为不同的亚型（图 1）。
图1
示基于肿瘤微环境基因组的免疫分型
2.1 免疫衰竭型（exhausted immune subtype）
在 33%（18/55）的免疫类患者中，其肿瘤微环境的免疫簇表现出抑制的免疫反应，以促瘤信号为特征，如 T 细胞衰竭，转化生长因子-β（TGF-β）、M2 型巨噬细胞等免疫抑制成分富集，Sia 等[14]将具有该特征的免疫类患者定义为免疫衰竭型。值得一提的是，TGF-β 是一种在侵袭性癌症中经常过度表达的有效免疫调节细胞因子，其活化后能调节肿瘤上皮-间质的相互作用、血管生成和转移，并通过诱导 T 细胞衰竭[15-16]和促进 M2 型巨噬细胞形成[17]来抑制宿主免疫应答，提示免疫衰竭型是一种更具有侵袭性的免疫亚型。吴志超等[18]的研究显示，TGF-β1的高表达与肿瘤大小、血管侵犯、AFP 水平、肿瘤数目和分化程度有相关性。因而该类患者通过TGF-β 抑制剂联合 ICIs 治疗获得更多收益是可能的。
2.2 免疫激活型（active immune subtype）
在剩余的免疫类患者中（67%，37/55），其肿瘤微环境的免疫簇表现出抗肿瘤特征，如 T 细胞和干扰素（IFN）信号的富集以及适应性免疫反应基因的过度表达，Sia 等[14]将其称为主动免疫反应，并将拥有该特征的免疫类患者定义为免疫激活型；同时将免疫衰竭型和免疫激活型的免疫簇与临床参数相关联，发现主动免疫反应组（免疫激活型）的肿瘤复发率更低且生存趋势更好。
2.3 免疫豁免型（privileged immune subtype）
在总的患者样本中，有一类始终被排除在免疫类之外，樊嘉等[19]将其定义为免疫豁免型，其特征是肝脏相关的 Wnt 靶基因过表达、核型 β-连环蛋白染色的富集和 CTNNB1 基因的突变。CTNNB1 途径的激活与 T 细胞排斥相关。与免疫类患者和非免疫类其他类型患者相比较，免疫豁免型表现出更低水平的免疫特征信号富集，特别是 T 细胞浸润的缺乏。
3 基于肿瘤微环境免疫细胞的免疫分型
2018 年，Kurebayashi 等[20]利用多重免疫组织化学染色方法，对来自 141 例患者的 158 份肝癌样本的 919 个区域的免疫细胞进行了全面的聚类分析，将其分为了 3 种不同的免疫亚型：高免疫亚型（immune-high subtype）、中免疫亚型（immune-mid subtype）和低免疫亚型（immune-high subtype）。高免疫亚型以 B 细胞、浆细胞以及 T 细胞浸润增多为特征，中免疫亚型的 T 细胞和其他免疫细胞浸润中度增加、B 细胞和浆细胞浸润较少，低免疫亚型的免疫细胞浸润程度很低；同时，该研究还阐述了高免疫亚型和 B 细胞浸润是独立的预后因素。以高免疫亚型为主的高级别肝癌患者的预后明显较好，特别是 CK19+ 或 SALL4+ 高级别 HCC[5, 21]。以高免疫亚型为主的 HCC 约占低分化 HCC 的 25%[20]，在低分化 HCC 中也发现高免疫亚型会获得明显更好的预后。特别地，高免疫亚型有一个富含 CXCL9、CXCL10 趋化因子以及 Th1、CTL 型细胞因子的免疫微环境，而 CXCL9 和 CXCL10 的表达与许多肿瘤的淋巴细胞浸润有关[22-23]，这与上述基于基因组方法定义的“免疫类”相一致。
随后，在 2019 年，Zhang 等[24]收集了来自 8 例 HCC 患者的 42 份样本，通过聚集肿瘤微环境的免疫细胞，比较样本之间的相似性并进行分层聚类，最终形成了 3 个聚类。接着，该研究还进一步揭示了不同亚型的免疫状态、趋化因子和细胞因子表达水平以及细胞代谢的特征。同时，为了临床实用性，该团队利用两种免疫组织化学检测的标志物的密度界值定义了这 3 种免疫亚型（图 2）。
图2
示基于肿瘤微环境免疫细胞的免疫分型
3.1 免疫活性亚型（immunocompetent subtype）
将 HCC 组织进行免疫组织化学染色，以 CD45+ 细胞 ≥100 个/mm2 定义为 CD45 高表达，同时以 Foxp3+ 细胞 <25 个/mm2 定义为 Foxp3 低表达，CD45 高表达和 Foxp3 低表达定义为免疫活性亚型。免疫活性亚型有相对正常的 T 细胞浸润水平 ［包含抗肿瘤 T 细胞（CD8+CD127+ T 细胞、CD4+CD127+ T 细胞和 γδT 细胞）］ 以及较少浸润的 B 细胞特别是 Breg 细胞。而且该亚型特有的尿素循环代谢提供了更多的精氨酸，可通过增强 T 细胞存活能力及其抗肿瘤功能来增强免疫[25]。因而免疫活性亚型 HCC 患者具有相对较强的抗肿瘤免疫能力，预后更加良好。然而，该亚型的细胞毒性分子的释放水平相对较低，这提示其浸润性 T 细胞的抗肿瘤功能可被进一步激活，所以就免疫活性亚型患者而言，T 细胞反应激活剂（如 IL-12 和 CpG 寡核苷酸）和 ICIs 的联合使用可能是有效的治疗方案[26-28]。
3.2 免疫缺陷亚型（immunodeficient subtype）
以 CD45+ 细胞 <100 个/mm2定义为 CD45 低表达，此类患者归为免疫缺陷亚型，其特点是树突状细胞（DC 细胞）和自然杀伤细胞（NK 细胞）的富集，淋巴细胞浸润的减少以及 CD45+ 细胞的缺乏（与其他 2 个亚型相比减少约 40%[24]）。在免疫缺陷亚型样本中发现髓系抑制细胞（MDSCs）的增加，同时所有与免疫抑制相关的标记信号：如淋巴细胞活化基因-3（LAG3）、程序性细胞死亡基因（PDCD1）、T 细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（TIM-3）、带有免疫球蛋白及 ITIM 结构域的 T 细胞免疫受体（TIGIT）、肿瘤坏死因子受体超家族 9（TNFRSF9）以及功能基因 ［如颗粒酶 A（GZMA）和颗粒酶 B（GZMB）］ 的表达水平均上调，所有趋化因子和细胞因子的表达水平都很低，这些特点与其免疫缺陷相符合。免疫缺陷亚型肝癌更像是所谓的“冷”肿瘤，几乎没有浸润的淋巴细胞，这限制了 ICIs 的疗效。因此，ICIs 与溶瘤病毒（如 JX-594）或多肽（如 LTX-315）联合应用可显著增强淋巴细胞浸润[29-31]，对该亚型肝癌有较好的治疗前景。抗肿瘤血管生成的靶向药物（如索拉非尼或贝伐单抗）通过促进 T 细胞转运或抑制 MDSCs 也可能提高 ICIs 对该亚型患者的疗效[32-33]。
3.3 免疫抑制亚型（immunosuppressive subtype）
CD45 高表达和 Foxp3 高表达者定义为免疫抑制亚型。该亚型以 Treg 细胞和免疫抑制性 CD4+ T 细胞（CD4+CD25+CD127–Foxp3+ T 细胞）增多为特征[34]，免疫抑制亚型样本显示为高密度的 Treg 细胞、Breg 细胞和 M2 型巨噬细胞，这些细胞都是免疫抑制细胞，且包括 PD-1、PD-L1、TIM-3 和 CTLA-4在内的免疫抑制分子的表达水平显著上调；同时，还观察到血管内皮生长因子 A（VEGFA）和许多编码抑制肿瘤的趋化因子或细胞因子的基因（如 TGF-β1、CCL8 和 IL-10）的过度表达。免疫抑制型 HCC 患者具有正常的淋巴细胞浸润，但免疫抑制细胞的数目显著增加。然而，值得注意的是，尽管免疫抑制成分在 RNA 和蛋白质水平上都被检测到过表达，但具有细胞毒功能的基因（如颗粒酶家族成员和 IFN-g）的上调表明抑制的细胞毒性 T 细胞是在激活时诱导的，而不是由固有缺陷诱导的[35]。所以在这种情况下，多种 ICIs 治疗可以恢复这些抑制性 T 细胞的抗肿瘤效力，提高免疫治疗反应效率；而且，VEGFA 和 TGF-β1 的过度表达提示 ICIs 联合抗血管生成药物可能使患者获益更多。
4 免疫分型在临床中的应用价值
目前，基于免疫治疗的精准识别主要依赖生物标志物（biomarker），以预测免疫治疗反应，确定哪些患者将从治疗中受益最大，从而提供有价值的决策和预后信息。肿瘤细胞或浸润性免疫细胞的PD-L1 表达上调、高肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）和肿瘤浸润性 CD8+ T 细胞密度增加是最被认可的与治疗反应相关的生物标志物。在 2015 和 2016 年，美国 FDA 将 PD-L1 的免疫组织化学染色分别纳入肺癌和黑色素瘤的辅助检查中，肯定了 PD-L1 的表达在两种疾病诊断和治疗中的价值。但在 CheckMate 040 研究中[8]，纳武单抗治疗晚期 HCC 患者的亚组分析结果显示，PD-L1 表达阳性（PD-L1≥1%）患者的有效率比 PD-L1 阴性患者（PD-L1<1%）略高（爬坡组：27% 比 12%；扩展组：26% 比 19%），表明对 HCC 而言，PD-L1 作为反应生物标志物的能力一般。Yarchoan 等[36]汇总了公开发表的临床试验中接受过 PD-1/PD-L1 抑制剂治疗的 27 种肿瘤（包括 HCC）的结果，发现各肿瘤的免疫应答率与 TMB 呈线性关系：TMB 越大，PD-1 抑制剂有效率越高。最近，Samstein 等[37]还证实了 TMB 能预测多种肿瘤免疫治疗后的生存率，并与接受 ICIs 治疗的患者的存活率提高有关，ICIs 的疗效随着 TMB 值的增加而增高。遗憾的是，该研究没有纳入 HCC 患者，高突变是否与接受 ICIs 的 HCC 患者的预后呈正相关有待进一步研究。此外，一些临床试验也评估了 CD8+ T 细胞密度与抗PD-1/PD-L1 治疗的临床疗效之间的相关性。例如，在抗 PD1 治疗黑色素瘤的一项研究中[38]，CD8+ T 细胞密度与抗 PD1 治疗的反应呈正相关。最近的一项研究[39]显示，抑制性的高表达 PD-1 的 CD8+ T 细胞密度与 HCC 的临床预后不良相关，其密度随肿瘤分期的增加而增加，提示抑制性的 CD8+ T 细胞密度与 HCC 的进展有关，可作为一个潜在的免疫治疗靶点。此外，病毒相关肿瘤对 PD-1 通路阻断有很高的反应率，HBV 和 HCV 导致的 HCC 对抗 PD-1 治疗的有效应答率已有报道。Yarchoan 等[36]的研究也显示一些与病毒相关的肿瘤（包括 HCC）的客观应答率高于预期，这表明在某些肿瘤类型中出现病毒抗原可能会增加抗 PD-1 治疗的应答率。这可能是因为致癌病毒的整合代表了肿瘤的另一种基因改变，赋予了新的抗原性，亦或是病毒感染与慢性炎症的作用赋予了上述相关的免疫类型。
肿瘤特异性突变可导致编码新抗原，基因突变负荷较大的肿瘤可能拥有更多的新抗原，因此患者拥有更多浸润的肿瘤特异性 T 细胞。由此可见，PD-L1 的表达、TMB 以及肿瘤浸润性淋巴细胞在功能上是相互关联的，并且经常在单个肿瘤标本中协同发现。同样，基于分子水平和细胞水平的两种免疫分型方法，在免疫类型的特征上有高度相似的地方，说明了在异质性很强的 HCC 中，其免疫微环境是相对稳定的，这使 HCC 的免疫分型成为可能。此外，与单因素标记相比，多因素标记具有更强的预测能力，这奠定了 HCC 免疫分型的临床应用基础。对肿瘤微环境进行广泛的免疫分析，从不同水平并综合多因素进行分类分型，可以更全面地指导 HCC 的治疗，从而改善预后。例如：在免疫激活亚型中，其正常的 T 淋巴细胞浸润以及较少的细胞毒性分子提示 ICIs 与 T 细胞反应激活剂联合应用可能有效。免疫豁免型或免疫缺陷亚型的 HCC 患者由于缺乏 T 细胞的浸润而限制了 ICIs 的疗效，这与肿瘤浸润性淋巴细胞密度作为生物标志物的研究结果相一致，对该类患者采用 ICIs 与增强淋巴细胞浸润的溶瘤病毒或者促进 T 细胞转运的抗肿瘤血管生成的靶向药物（索拉非尼或贝伐单抗）联合治疗可能会提高反应率。同样地，在免疫抑制亚型的 HCC 患者中，包括 PD-1、PD-L1、TIM-3 和 CTLA-4 在内的免疫抑制性分子的表达水平增加，且 VEGFA 和 TGF-β1 过表达，提示多种 ICIs 联用可能对逆转免疫抑制性 T 细胞更有效，ICIs 联合抗血管生成药物也可能带来更多获益。樊嘉团队[40]筛选出了几个特定的肝癌微环境免疫生物标志物（包括 CD3、CD27、CD68、CD103 和PD-1），并联合肿瘤大小、分化程度和 γ-谷氨酰转肽酶（GGT）构建了一个预后模型，其准确性显著优于传统的临床分期。另一项研究[41]建立了一个整合免疫类型、病理表现（肿瘤出芽）、AFP 水平、HBV 感染、微血管侵犯（MVI）和肿瘤分级信息的预后模型，该模型在试验组和验证组均显示出比单独的 BCLC 或 TNM 分期更好的预后能力。所以，基于 HCC 肿瘤微环境的免疫分型在生物标志物的基础上，还综合了更多影响患者治疗效应以及生存预后的因素，对未来 HCC 的治疗和预后有更全面、更准确的临床指导作用。
5 小结与展望
免疫治疗为晚期肝癌患者带来了新的治疗途径，而如今较低的客观反应率以及治疗效果阻碍了它的发展。基于肿瘤免疫微环境的免疫分型与 HCC 患者的抗肿瘤能力以及生存有显著的关联，能够更全面指导 HCC 患者免疫治疗的筛选和决策，以提高免疫治疗的疗效和预后评估，让更多的患者从中获益。近几年，肿瘤微环境成为国内外研究的热点，基于它对 HCC 进行免疫分型还在研究初期，其潜在的临床应用价值需要进一步的大规模队列研究来验证。同时可以发现，不管是目前发现的生物标志物，还是各种免疫分型方案，它们都有显著的共性，因而寻找制定出统一规范的 HCC 免疫微环境评估方案是可行的，相信这是 HCC 免疫治疗未来的研究方向。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们无相互竞争的利益。
作者贡献声明：刘家瑞和肖衡参与了文章的起草和修改，以及图的制作；杜成友对文章进行了审阅。
