引用本文： 王海清, 冯燮林, 李磊, 郝景程, 龚辰. 肝细胞癌复发前后干细胞性标志物的变化特征及其与临床病理特征的关系. 中国普外基础与临床杂志, 2021, 28(5): 587-594. doi: 10.7507/1007-9424.202007121 复制
近年来，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）“干细胞理论”的提出，使学者们对 HCC 发生、发展、复发和转移机制有了新的认识，并为肝癌的治疗及预后提供了新的思路[1-2]。干细胞性标志物指的是部分肝癌细胞表面表达的一类分子标志物，常见的干细胞性标志物包括表皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、CD133、CD90、CD117 等。这些标志物的表达代表了肿瘤细胞具有更强的侵袭性行为和更差的预后，是肝癌根治性治疗后复发和转移的关键因素[3]。Kim 等[4]的一项研究进一步证实，这些干细胞性标志物不但影响肝癌患者根治性切除术后的预后，还是维持端粒长度和染色体稳定性的关键机制。该研究[4]通过 HCC 切除后的标本发现，HCC 细胞中端粒的长度缩短，但在 K19、EpCAM、CD133 和 CD117 阳性表达的亚组细胞中，端粒酶活性增加、端粒长度反而增加。因此认为，干细胞性标志物的表达维持了端粒的长度，因而也导致了更差的预后。HCC 根治性切除后的 5 年复发率仍高达 70%[4-5]，复发性肝癌的治疗也逐渐成为临床关注的焦点。而肿瘤在演进过程中因获得性遗传不稳定性，常出现多个不同生物学特征的细胞亚群。因此，肝癌复发后的肿瘤特性也可能发生改变[6]。对于复发肝癌所表达的干细胞性标志物以及端粒的长度是否会有所改变，目前鲜见相关研究，因此对复发肝癌干细胞性标志物和端粒长度的研究对预测复发肝癌的预后以及采取进一步辅助治疗具有一定的临床意义。本研究拟通过比较肝癌复发前后的病理标本，探讨干细胞性标志物表达及端粒长度的改变情况，及其对临床的意义。
1 资料和方法
1.1 临床资料
纳入标准：① 同时于四川省肿瘤医院行首次切除和复发后再次切除的 HCC 患者；② 首次、复发肝癌患者行病理检查均证实为 HCC；③ 首次治疗的 HCC 为巴塞罗那（BCLC） 0～C 期；④ 两次治疗均采用手术切除，且达到根治性切除标准（根治性切除判断标准：肝癌患者无远处转移，无门静脉主干、肝静脉以及其他大血管侵犯；完全切除肿瘤；病理证实切缘无 HCC 细胞残留）。排除标准：① 排除胆管细胞癌和肝细胞-胆管细胞混合型肝癌；② 排除远处转移、淋巴结转移以及侵犯大血管（门静脉主干、肝静脉以及其他大血管）的患者；③ 排除行射频消融和无水乙醇治疗的患者；④ 排除失访和无法提供足够 HCC 组织进行检测的患者；⑤ 排除复发前针对肿瘤进行过化疗、放疗、介入等治疗的患者；⑥ 排除合并其他恶性肿瘤的患者。
本研究回顾性纳入 2010 年 1 月至 2018 年 10 月期间于四川省肿瘤医院行肝癌根治性切除术后复发、再次行手术治疗的患者。收集该患者的临床资料，并配对收集复发前后的病理标本；检测病理标本中干细胞性标志物（EpCAM、CD133、CD90 和 CD177）的表达和端粒长度。本研究通过四川省肿瘤医院医学伦理委员会审批，患者及家属均签署知情同意书。最终纳入 25 例患者，男 22 例（88.0%），女 3 例（12.0%）；年龄 20～74 岁，中位年龄 51 岁 ［（46，63）岁］；合并乙肝（hetatitis B virus，HBV）感染 20 例（80.0%）；所有患者的肝功能 Child-Pugh 分级均为 A 级。所有患者均获得了根治性肝切除并进行了病理检查，并行 CD90、CD133、CD117 和 EpCAM 的免疫组织化学检测，以及端粒长度测量。
1.2 免疫组织化学染色方法
选取纳入患者复发前后的石蜡包埋标本，对肝癌组织进行 4 μm 连续切片；切片后进行 HE 染色及兔抗人 EpCAM 多克隆抗体、兔抗人 CD90 多克隆抗体、兔抗人 CD133 多克隆抗体和兔抗人 CD117 多克隆抗体免疫组织化学染色。免疫组织化学染色采用 EnVision 两步法，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。每例样本的每种标志物选取 3 张组织切片进行免疫组织化学染色，由两名病理医师采用双盲法分别进行评定和分析。阳性对照根据抗体官方说明书推荐组织进行染色，其中 EpCAM 使用人结肠癌组织，CD90 使用人扁桃体组织，CD133 使用人胰腺组织，CD117 使用人肺腺癌组织进行对照。阴性对照使用同型对照方式进行，上述四类染色在一抗孵化时均加做以非免疫 IgG 代替一抗的阴性对照。结果采用计算机软件（Image J，NIH）进行阳性细胞/每高倍镜视野（cells/HPF）计数，最终结果采用 2 位病理科医师的 3 张切片结果的平均值。
1.3 端粒长度原位荧光杂交检测
石蜡切片经脱蜡后进行热诱导抗原修复，随后与荧光素 Cy3 标记的端粒序列特异性探针 ［N-C 端：CCCTAACCCTAACCCTAA；N 端共价连接 Cy3 荧光素（韩国 Panagene 公司）］ 进行杂交培育。然后将切片以直接荧光法染色，采用 4x, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行对照染色。
1.4 随访
术后门诊定期复查，每 3～6 个月进行胸部 CT 平扫、腹部增强 CT 或彩超，以及 AFP 检查；采用门诊或电话方式进行术后随访，随访内容主要为了解患者生存情况。本组患者的随访截止时间为 2019 年 12 月 1 日。
1.5 统计学方法
应用 SPSS 17.0 统计软件进行分析。计量资料采用 K-S 检验正态性，服从正态分布的计量资料以均数±标准差（
±s）表示，否则采用中位数（P25，P75）表示，组间比较采用配对 t 检验；偏态分布计量资料组间比较采用非参数检验（秩和检验 Mann-Whitney U）。计数资料组间比较采用配对 χ2 检验或者 Fisher 确切概率法。采用 Kaplan-Meier 法计算生存率并绘制生存曲线，采用 log-rank 检验或 Breslow 检验进行生存分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 随访情况
本研究共纳入 25 例 HCC 患者，所有患者均进行了 2 次 HCC 切除术（首次 HCC 切除和复发后 HCC 的切除）。25 例患者均获访，总随访时间为 8～94 个月（第 1 次术后的随访时间），中位随访时间为 31 个月。首次切除后肿瘤复发时间为 4～84 个月，中位复发时间为 14 个月。所有患者从第 1 次术后至随访截止时间的中位生存时间为 50.1 个月，1、3 和 5 年总生存率分别为 95.7%、78.2% 和 44.7%（图1a）。
图1
示 HCC 患者总体的生存曲线和复发前后的无瘤生存曲线
a：示 HCC 患者总体的生存曲线；b：示 HCC 患者首次切除和复发切除后的无瘤生存曲线
2.2 HCC 复发前后的临床、病理和生物学特征比较
HCC 复发前后的临床病理学特点总体趋于一致。患者复发前后的肝功能指标（总胆红素、白蛋白、AST 和 ALT）、国际标准化比值（INR）、AFP、卫星结节、BCLC 分期、分化程度、解剖性肝切除、肝硬化、输血情况以及干细胞标志物（EpCAM、CD90、CD133 和 CD117）的表达水平比较差异均没有统计学意义（P>0.05）。但 HCC 复发前的 PLT 计数和肿瘤直径均高于（大于）复发后，且肿瘤多发和微血管癌栓（MVI）占比较低，端粒长度较短（P<0.05）。复发肿瘤具有直径小和多发的特点，但肿瘤的其他生物学特性并无明显改变；尽管复发前后的肿瘤直径和数量具有差异，但由于经过严格的手术指征筛选，纳入患者复发前和复发后肿瘤的 BCLC 分期和分化程度差异不大。具体见表1。
表1
25 例 HCC 复发前后的临床病理特点
在肿瘤复发方面，Kaplan-Meier 分析结果表明，复发前患者的 1 年和 3 年无瘤生存率分别为 52.1% 和 12.4%；复发再次手术后患者的 1 年和3 年无瘤生存率分别为 49.7% 和 23.2%；复发前后患者的无瘤生存率比较差异无统计学意义（χ2=1.948，P=0.163），见图1b。
2.3 干细胞性标志物、端粒长度与肿瘤病理特征的关系
本研究对 25 例患者复发前后的 50 例肿瘤标本进行病理特征和干细胞性标志物分析，探讨干细胞性标志物与肿瘤病理特征的关系。相关分析发现，端粒长度与 EpCAM（r=–0.092，P=0.513）、CD90（r=–0.235，P=0.100）、CD133（r=0.024，P=0.867）和 CD117（r=–0.277，P=0.052）的表达水平均没有相关性；但 EpCAM 与 CD133 呈正相关（r=0.358，P=0.011）。
分析临床病理特征与干细胞性标志物表达水平和端粒长度之间的相关性发现，肿瘤直径、肿瘤数量、BCLC 分期、卫星结节以及分化程度均不影响 CD90、CD133、CD117 和 EpCAM 的表达水平（P>0.05）；但对于 MVI 阳性的肿瘤，其 EpCAM 表达水平（P=0.016）和端粒长度（P=0.001）均高于 MVI 阴性的患者（表2）；同时直径<5 cm 的肿瘤（P=0.038）和低分化（P=0.046）的肿瘤其端粒长度也更长。该结果提示，MVI 与 EpCAM 表达和端粒延长相关，端粒的长度还与肿瘤直径和分化程度相关。
表2
干细胞性标志物表达水平及端粒长度与 HCC 临床病理特征的关系［M（P25，P75） ］
2.4 影响 HCC 无瘤生存的因素
本研究对 HCC 复发前后无瘤生存的影响因素分别进行了单因素分析。对于复发前，单因素分析发现，BCLC 分期（P=0.040）和分化程度（P=0.003）是影响 HCC 患者首次切除后无瘤生存的影响因素，见表3。对复发后 HCC，单因素分析发现，BCLC 分期（P=0.017）和肿瘤直径（P=0.035）是影响无瘤生存的影响因素，见表3。因此，本研究结果提示，干细胞性标志物表达水平和端粒长度并不是 HCC 复发的影响因素。
表3
HCC 复发前后无瘤生存的影响因素分析
3 讨论
本研究通过对 25 例 HCC 患者的病理标本的研究发现，复发 HCC 患者具有肿瘤多发、直径小和端粒长度增加的特点；干细胞性标志物在 HCC 复发前后的表达水平并没有明显差异。但进一步的研究发现，MVI 阳性的 HCC 其 EpCAM 表达水平较 MVI 阴性的 HCC 增加，其端粒也进一步延长。端粒的长度还与肿瘤直径和分化程度相关。对于复发前，BCLC 分期和分化程度是 HCC 患者首次切除后无瘤生存的影响因素；对于复发后 HCC，BCLC 分期和肿瘤直径是无瘤生存的影响因素，但干细胞性标志物和端粒长度并不是影响 HCC 复发的影响因素。因此，干细胞性标志物的表达在同一患者不同时期的 HCC 中总体趋于一致，其表达体现了 HCC 的分子生物学特点，但本研究有限的样本发现其并不影响 HCC 的预后。
端粒是染色体末端的 TTAGGG 重复序列，起到保护染色体末端衰退的作用[7]。对多种实体肿瘤的研究均表明，端粒酶活性以及端粒长度与肿瘤的形成密切相关[8-11]。肝癌干细胞性相关标志物是指角蛋白 19（（keratin 19，K19）、EpCAM、CD133、CD117 等标志物。研究[12]已证明，表达干细胞性标志物的肿瘤细胞凋亡减少、分化能力增强，比传统的肝癌恶性程度更高，也与肝癌的预后密切相关。总的来说，表达干细胞性标志物的肝癌常无包膜，更易呈现出浸润性生长、血管侵犯、肿瘤更大、分化程度更差、纤维基质成分更常见等特征[5, 13-16]。这些侵袭性的特征能够促进 HCC 复发和转移。Durnez 等[17]对 HCC 肝移植术后的研究发现，K19 阳性表达 HCC 患者肝移植后的 5 年复发率高达 50%，而阴性患者只有 25%。Kim 等[11]的研究进一步证实，干细胞性标志物可能是维持端粒长度和染色体稳定性的关键机制，该研究通过 HCC 切除后的标本发现，HCC 细胞中端粒的长度比癌旁组织和正常肝组织都短，但在 K19、EpCAM、CD133 和 CD117 表达的亚组细胞中，端粒酶逆转录酶表达上调、端粒酶活性增加、端粒的长度增加，尤其是在 K19 和 EpCAM 阳性的 HCC 细胞中更明显；而在常规肝癌细胞中，端粒仍具有较短的长度，进一步分析发现端粒的长度增加导致了更差的预后。因此，该研究认为，干细胞性标志物可能是维持端粒长度和染色体稳定性的关键机制。
由于肿瘤异质性的存在，不同 HCC 患者的癌组织中干细胞性标志物或端粒长度可能本身就存在差异，这不利于讨论和比较复发肝癌的生物学特性以及端粒长度是否存在变化。因此，本研究采用了同一患者前后两次 HCC 的病理组织进行比较，消除了不同患者间肿瘤的异质性。本研究通过对 25 例 HCC 复发前后切除标本的分析发现，复发前后 HCC 组织中干细胞性标志物的表达水平没有差异，而复发后端粒长度明显增加；但是相关分析发现，端粒的长度与干细胞性标志物的表达也没有关联。因此，同一 HCC 患者即使是肿瘤复发，其生物学特性也基本维持一致。本研究结果提示，暂不能认为干细胞性标志物是维持端粒长度和染色体稳定性的关键机制。
但是，本研究也有一些发现：首先发现了 MVI 阳性的患者，其 EpCAM 表达水平明显增高。端粒的长度与肿瘤直径、MVI 和分化程度相关。EpCAM 属于黏附分子家族，其作为上皮细胞间黏附分子，在上皮细胞癌变过程中发挥着重要作用，主要通过调节细胞增殖、免疫逃逸等机制促成肿瘤的发生，并与肿瘤的迁移和侵袭性密切相关[18-23]。同时这部分患者的端粒长度明显增加，因此也证实了表达干细胞性标志物的肿瘤具有侵袭性的特征，端粒长度也反映了肿瘤的恶性特征。但是针对端粒长度与干细胞性标志物表达的相关分析却发现并没有相关性，因此干细胞性标志物和端粒很可能是通过不同机制影响肝癌细胞的生物学特性。这与 Kim 的实验结果不同，其可能原因在于 Kim 的研究是针对 EpCAM 阳性肝癌细胞进行单个细胞的端粒长度测量[11]，而本研究测量了整个 HCC 组织中的端粒长度和 EpCAM 的表达水平。另外一个发现是，复发 HCC 患者具有更低的 PLT 计数、肿瘤直径小和多发的特点。首先，本研究对临床病理特征进行分析后发现，复发 HCC 患者具有更低的 PLT 计数（P=0.022）。这很可能是因为复发 HCC 患者由于手术切除导致了更少的残留肝组织，而肝体积减小会导肝门静脉压力增高和脾功能亢进[24]，因此 PLT 计数更低。其次，复发 HCC 患者的肿瘤直径更小（P=0.004），但肿瘤数量更多（P=0.005）。复发 HCC 患者面临更严格的术前筛查，因此诊断复发的时候 HCC 具有肿瘤直径小的特点，同时由于根据 BCLC 分期进行手术适应证的筛选，更多的多发肿瘤患者被筛查进来，因此导致初发和复发患者在 HCC 的 BCLC 分期方面没有差异。第三，HCC 患者复发前后 HCC 组织中 CD90、CD133、CD117 和 EpCAM 的表达水平没有差异，但复发 HCC 患者其端粒较长（P=0.003），这可能是由于 HCC 在复发过程中需要更长的端粒进行癌细胞的增殖和侵袭。在 25 例 HCC 中，19 例 HCC 在复发后端粒长度增加，而 6 例 HCC 患者复发后端粒长度反而缩小。因此也代表了端粒长度增加这一部分 HCC 患者可能具有侵袭性的肿瘤生物学特性。但是本研究的生存分析发现，HCC 复发前后的无瘤生存率并没有差异，生存分析也发现端粒长度以及干细胞性标志物的表达水平并不是影响无瘤生存的危险因素。但是由于本研究仅纳入了 25 例 HCC 患者，样本量也限制了对生存危险因素的鉴别力度。
本研究仍存在一些不足。首先，由于复发 HCC 能够达到再次切除者较少，因此纳入研究的样本量过小。其次，本研究为单中心回顾性研究，端粒以及干细胞性标志物对预后的作用需要进行多方面的验证。第三，由于本研究为配对研究，能够纳入的病例较少，因此无法进一步研究 HCC 早期复发和晚期复发类型对干细胞性标志物表达的影响。第四，部分 HCC 具有多个肿瘤，本研究只选取了具有代表性的肿瘤进行干细胞性标志物和端粒的检测。因此，本研究的结论需要扩大样本量和多中心研究进行验证。
综上，本研究发现，与 HCC 复发前相比，复发 HCC 具有相似的干细胞性标志物表达，但端粒更长；EpCAM 表达水平与端粒长度均反映了 HCC 的恶性特点，但两者并没有相关性。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：王海清，课题设计和论文撰写；冯燮林，课题设计和论文修改；李磊，标本收集、临床数据收集和统计分析；郝景程和龚辰，病理标本的免疫组织化学和原位荧光杂交检测。
伦理声明：本研究已通过四川省肿瘤医院的伦理审核批准［批文编号：SCCHEC-02-2020-017］。
近年来，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）“干细胞理论”的提出，使学者们对 HCC 发生、发展、复发和转移机制有了新的认识，并为肝癌的治疗及预后提供了新的思路[1-2]。干细胞性标志物指的是部分肝癌细胞表面表达的一类分子标志物，常见的干细胞性标志物包括表皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、CD133、CD90、CD117 等。这些标志物的表达代表了肿瘤细胞具有更强的侵袭性行为和更差的预后，是肝癌根治性治疗后复发和转移的关键因素[3]。Kim 等[4]的一项研究进一步证实，这些干细胞性标志物不但影响肝癌患者根治性切除术后的预后，还是维持端粒长度和染色体稳定性的关键机制。该研究[4]通过 HCC 切除后的标本发现，HCC 细胞中端粒的长度缩短，但在 K19、EpCAM、CD133 和 CD117 阳性表达的亚组细胞中，端粒酶活性增加、端粒长度反而增加。因此认为，干细胞性标志物的表达维持了端粒的长度，因而也导致了更差的预后。HCC 根治性切除后的 5 年复发率仍高达 70%[4-5]，复发性肝癌的治疗也逐渐成为临床关注的焦点。而肿瘤在演进过程中因获得性遗传不稳定性，常出现多个不同生物学特征的细胞亚群。因此，肝癌复发后的肿瘤特性也可能发生改变[6]。对于复发肝癌所表达的干细胞性标志物以及端粒的长度是否会有所改变，目前鲜见相关研究，因此对复发肝癌干细胞性标志物和端粒长度的研究对预测复发肝癌的预后以及采取进一步辅助治疗具有一定的临床意义。本研究拟通过比较肝癌复发前后的病理标本，探讨干细胞性标志物表达及端粒长度的改变情况，及其对临床的意义。
1 资料和方法
1.1 临床资料
纳入标准：① 同时于四川省肿瘤医院行首次切除和复发后再次切除的 HCC 患者；② 首次、复发肝癌患者行病理检查均证实为 HCC；③ 首次治疗的 HCC 为巴塞罗那（BCLC） 0～C 期；④ 两次治疗均采用手术切除，且达到根治性切除标准（根治性切除判断标准：肝癌患者无远处转移，无门静脉主干、肝静脉以及其他大血管侵犯；完全切除肿瘤；病理证实切缘无 HCC 细胞残留）。排除标准：① 排除胆管细胞癌和肝细胞-胆管细胞混合型肝癌；② 排除远处转移、淋巴结转移以及侵犯大血管（门静脉主干、肝静脉以及其他大血管）的患者；③ 排除行射频消融和无水乙醇治疗的患者；④ 排除失访和无法提供足够 HCC 组织进行检测的患者；⑤ 排除复发前针对肿瘤进行过化疗、放疗、介入等治疗的患者；⑥ 排除合并其他恶性肿瘤的患者。
本研究回顾性纳入 2010 年 1 月至 2018 年 10 月期间于四川省肿瘤医院行肝癌根治性切除术后复发、再次行手术治疗的患者。收集该患者的临床资料，并配对收集复发前后的病理标本；检测病理标本中干细胞性标志物（EpCAM、CD133、CD90 和 CD177）的表达和端粒长度。本研究通过四川省肿瘤医院医学伦理委员会审批，患者及家属均签署知情同意书。最终纳入 25 例患者，男 22 例（88.0%），女 3 例（12.0%）；年龄 20～74 岁，中位年龄 51 岁 ［（46，63）岁］；合并乙肝（hetatitis B virus，HBV）感染 20 例（80.0%）；所有患者的肝功能 Child-Pugh 分级均为 A 级。所有患者均获得了根治性肝切除并进行了病理检查，并行 CD90、CD133、CD117 和 EpCAM 的免疫组织化学检测，以及端粒长度测量。
1.2 免疫组织化学染色方法
选取纳入患者复发前后的石蜡包埋标本，对肝癌组织进行 4 μm 连续切片；切片后进行 HE 染色及兔抗人 EpCAM 多克隆抗体、兔抗人 CD90 多克隆抗体、兔抗人 CD133 多克隆抗体和兔抗人 CD117 多克隆抗体免疫组织化学染色。免疫组织化学染色采用 EnVision 两步法，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。每例样本的每种标志物选取 3 张组织切片进行免疫组织化学染色，由两名病理医师采用双盲法分别进行评定和分析。阳性对照根据抗体官方说明书推荐组织进行染色，其中 EpCAM 使用人结肠癌组织，CD90 使用人扁桃体组织，CD133 使用人胰腺组织，CD117 使用人肺腺癌组织进行对照。阴性对照使用同型对照方式进行，上述四类染色在一抗孵化时均加做以非免疫 IgG 代替一抗的阴性对照。结果采用计算机软件（Image J，NIH）进行阳性细胞/每高倍镜视野（cells/HPF）计数，最终结果采用 2 位病理科医师的 3 张切片结果的平均值。
1.3 端粒长度原位荧光杂交检测
石蜡切片经脱蜡后进行热诱导抗原修复，随后与荧光素 Cy3 标记的端粒序列特异性探针 ［N-C 端：CCCTAACCCTAACCCTAA；N 端共价连接 Cy3 荧光素（韩国 Panagene 公司）］ 进行杂交培育。然后将切片以直接荧光法染色，采用 4x, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行对照染色。
1.4 随访
术后门诊定期复查，每 3～6 个月进行胸部 CT 平扫、腹部增强 CT 或彩超，以及 AFP 检查；采用门诊或电话方式进行术后随访，随访内容主要为了解患者生存情况。本组患者的随访截止时间为 2019 年 12 月 1 日。
1.5 统计学方法
应用 SPSS 17.0 统计软件进行分析。计量资料采用 K-S 检验正态性，服从正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，否则采用中位数（P25，P75）表示，组间比较采用配对 t 检验；偏态分布计量资料组间比较采用非参数检验（秩和检验 Mann-Whitney U）。计数资料组间比较采用配对 χ2 检验或者 Fisher 确切概率法。采用 Kaplan-Meier 法计算生存率并绘制生存曲线，采用 log-rank 检验或 Breslow 检验进行生存分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 随访情况
本研究共纳入 25 例 HCC 患者，所有患者均进行了 2 次 HCC 切除术（首次 HCC 切除和复发后 HCC 的切除）。25 例患者均获访，总随访时间为 8～94 个月（第 1 次术后的随访时间），中位随访时间为 31 个月。首次切除后肿瘤复发时间为 4～84 个月，中位复发时间为 14 个月。所有患者从第 1 次术后至随访截止时间的中位生存时间为 50.1 个月，1、3 和 5 年总生存率分别为 95.7%、78.2% 和 44.7%（图1a）。
图1
示 HCC 患者总体的生存曲线和复发前后的无瘤生存曲线
a：示 HCC 患者总体的生存曲线；b：示 HCC 患者首次切除和复发切除后的无瘤生存曲线
2.2 HCC 复发前后的临床、病理和生物学特征比较
HCC 复发前后的临床病理学特点总体趋于一致。患者复发前后的肝功能指标（总胆红素、白蛋白、AST 和 ALT）、国际标准化比值（INR）、AFP、卫星结节、BCLC 分期、分化程度、解剖性肝切除、肝硬化、输血情况以及干细胞标志物（EpCAM、CD90、CD133 和 CD117）的表达水平比较差异均没有统计学意义（P>0.05）。但 HCC 复发前的 PLT 计数和肿瘤直径均高于（大于）复发后，且肿瘤多发和微血管癌栓（MVI）占比较低，端粒长度较短（P<0.05）。复发肿瘤具有直径小和多发的特点，但肿瘤的其他生物学特性并无明显改变；尽管复发前后的肿瘤直径和数量具有差异，但由于经过严格的手术指征筛选，纳入患者复发前和复发后肿瘤的 BCLC 分期和分化程度差异不大。具体见表1。
表1
25 例 HCC 复发前后的临床病理特点
在肿瘤复发方面，Kaplan-Meier 分析结果表明，复发前患者的 1 年和 3 年无瘤生存率分别为 52.1% 和 12.4%；复发再次手术后患者的 1 年和3 年无瘤生存率分别为 49.7% 和 23.2%；复发前后患者的无瘤生存率比较差异无统计学意义（χ2=1.948，P=0.163），见图1b。
2.3 干细胞性标志物、端粒长度与肿瘤病理特征的关系
本研究对 25 例患者复发前后的 50 例肿瘤标本进行病理特征和干细胞性标志物分析，探讨干细胞性标志物与肿瘤病理特征的关系。相关分析发现，端粒长度与 EpCAM（r=–0.092，P=0.513）、CD90（r=–0.235，P=0.100）、CD133（r=0.024，P=0.867）和 CD117（r=–0.277，P=0.052）的表达水平均没有相关性；但 EpCAM 与 CD133 呈正相关（r=0.358，P=0.011）。
分析临床病理特征与干细胞性标志物表达水平和端粒长度之间的相关性发现，肿瘤直径、肿瘤数量、BCLC 分期、卫星结节以及分化程度均不影响 CD90、CD133、CD117 和 EpCAM 的表达水平（P>0.05）；但对于 MVI 阳性的肿瘤，其 EpCAM 表达水平（P=0.016）和端粒长度（P=0.001）均高于 MVI 阴性的患者（表2）；同时直径<5 cm 的肿瘤（P=0.038）和低分化（P=0.046）的肿瘤其端粒长度也更长。该结果提示，MVI 与 EpCAM 表达和端粒延长相关，端粒的长度还与肿瘤直径和分化程度相关。
表2
干细胞性标志物表达水平及端粒长度与 HCC 临床病理特征的关系［M（P25，P75） ］
2.4 影响 HCC 无瘤生存的因素
本研究对 HCC 复发前后无瘤生存的影响因素分别进行了单因素分析。对于复发前，单因素分析发现，BCLC 分期（P=0.040）和分化程度（P=0.003）是影响 HCC 患者首次切除后无瘤生存的影响因素，见表3。对复发后 HCC，单因素分析发现，BCLC 分期（P=0.017）和肿瘤直径（P=0.035）是影响无瘤生存的影响因素，见表3。因此，本研究结果提示，干细胞性标志物表达水平和端粒长度并不是 HCC 复发的影响因素。
表3
HCC 复发前后无瘤生存的影响因素分析
3 讨论
本研究通过对 25 例 HCC 患者的病理标本的研究发现，复发 HCC 患者具有肿瘤多发、直径小和端粒长度增加的特点；干细胞性标志物在 HCC 复发前后的表达水平并没有明显差异。但进一步的研究发现，MVI 阳性的 HCC 其 EpCAM 表达水平较 MVI 阴性的 HCC 增加，其端粒也进一步延长。端粒的长度还与肿瘤直径和分化程度相关。对于复发前，BCLC 分期和分化程度是 HCC 患者首次切除后无瘤生存的影响因素；对于复发后 HCC，BCLC 分期和肿瘤直径是无瘤生存的影响因素，但干细胞性标志物和端粒长度并不是影响 HCC 复发的影响因素。因此，干细胞性标志物的表达在同一患者不同时期的 HCC 中总体趋于一致，其表达体现了 HCC 的分子生物学特点，但本研究有限的样本发现其并不影响 HCC 的预后。
端粒是染色体末端的 TTAGGG 重复序列，起到保护染色体末端衰退的作用[7]。对多种实体肿瘤的研究均表明，端粒酶活性以及端粒长度与肿瘤的形成密切相关[8-11]。肝癌干细胞性相关标志物是指角蛋白 19（（keratin 19，K19）、EpCAM、CD133、CD117 等标志物。研究[12]已证明，表达干细胞性标志物的肿瘤细胞凋亡减少、分化能力增强，比传统的肝癌恶性程度更高，也与肝癌的预后密切相关。总的来说，表达干细胞性标志物的肝癌常无包膜，更易呈现出浸润性生长、血管侵犯、肿瘤更大、分化程度更差、纤维基质成分更常见等特征[5, 13-16]。这些侵袭性的特征能够促进 HCC 复发和转移。Durnez 等[17]对 HCC 肝移植术后的研究发现，K19 阳性表达 HCC 患者肝移植后的 5 年复发率高达 50%，而阴性患者只有 25%。Kim 等[11]的研究进一步证实，干细胞性标志物可能是维持端粒长度和染色体稳定性的关键机制，该研究通过 HCC 切除后的标本发现，HCC 细胞中端粒的长度比癌旁组织和正常肝组织都短，但在 K19、EpCAM、CD133 和 CD117 表达的亚组细胞中，端粒酶逆转录酶表达上调、端粒酶活性增加、端粒的长度增加，尤其是在 K19 和 EpCAM 阳性的 HCC 细胞中更明显；而在常规肝癌细胞中，端粒仍具有较短的长度，进一步分析发现端粒的长度增加导致了更差的预后。因此，该研究认为，干细胞性标志物可能是维持端粒长度和染色体稳定性的关键机制。
由于肿瘤异质性的存在，不同 HCC 患者的癌组织中干细胞性标志物或端粒长度可能本身就存在差异，这不利于讨论和比较复发肝癌的生物学特性以及端粒长度是否存在变化。因此，本研究采用了同一患者前后两次 HCC 的病理组织进行比较，消除了不同患者间肿瘤的异质性。本研究通过对 25 例 HCC 复发前后切除标本的分析发现，复发前后 HCC 组织中干细胞性标志物的表达水平没有差异，而复发后端粒长度明显增加；但是相关分析发现，端粒的长度与干细胞性标志物的表达也没有关联。因此，同一 HCC 患者即使是肿瘤复发，其生物学特性也基本维持一致。本研究结果提示，暂不能认为干细胞性标志物是维持端粒长度和染色体稳定性的关键机制。
但是，本研究也有一些发现：首先发现了 MVI 阳性的患者，其 EpCAM 表达水平明显增高。端粒的长度与肿瘤直径、MVI 和分化程度相关。EpCAM 属于黏附分子家族，其作为上皮细胞间黏附分子，在上皮细胞癌变过程中发挥着重要作用，主要通过调节细胞增殖、免疫逃逸等机制促成肿瘤的发生，并与肿瘤的迁移和侵袭性密切相关[18-23]。同时这部分患者的端粒长度明显增加，因此也证实了表达干细胞性标志物的肿瘤具有侵袭性的特征，端粒长度也反映了肿瘤的恶性特征。但是针对端粒长度与干细胞性标志物表达的相关分析却发现并没有相关性，因此干细胞性标志物和端粒很可能是通过不同机制影响肝癌细胞的生物学特性。这与 Kim 的实验结果不同，其可能原因在于 Kim 的研究是针对 EpCAM 阳性肝癌细胞进行单个细胞的端粒长度测量[11]，而本研究测量了整个 HCC 组织中的端粒长度和 EpCAM 的表达水平。另外一个发现是，复发 HCC 患者具有更低的 PLT 计数、肿瘤直径小和多发的特点。首先，本研究对临床病理特征进行分析后发现，复发 HCC 患者具有更低的 PLT 计数（P=0.022）。这很可能是因为复发 HCC 患者由于手术切除导致了更少的残留肝组织，而肝体积减小会导肝门静脉压力增高和脾功能亢进[24]，因此 PLT 计数更低。其次，复发 HCC 患者的肿瘤直径更小（P=0.004），但肿瘤数量更多（P=0.005）。复发 HCC 患者面临更严格的术前筛查，因此诊断复发的时候 HCC 具有肿瘤直径小的特点，同时由于根据 BCLC 分期进行手术适应证的筛选，更多的多发肿瘤患者被筛查进来，因此导致初发和复发患者在 HCC 的 BCLC 分期方面没有差异。第三，HCC 患者复发前后 HCC 组织中 CD90、CD133、CD117 和 EpCAM 的表达水平没有差异，但复发 HCC 患者其端粒较长（P=0.003），这可能是由于 HCC 在复发过程中需要更长的端粒进行癌细胞的增殖和侵袭。在 25 例 HCC 中，19 例 HCC 在复发后端粒长度增加，而 6 例 HCC 患者复发后端粒长度反而缩小。因此也代表了端粒长度增加这一部分 HCC 患者可能具有侵袭性的肿瘤生物学特性。但是本研究的生存分析发现，HCC 复发前后的无瘤生存率并没有差异，生存分析也发现端粒长度以及干细胞性标志物的表达水平并不是影响无瘤生存的危险因素。但是由于本研究仅纳入了 25 例 HCC 患者，样本量也限制了对生存危险因素的鉴别力度。
本研究仍存在一些不足。首先，由于复发 HCC 能够达到再次切除者较少，因此纳入研究的样本量过小。其次，本研究为单中心回顾性研究，端粒以及干细胞性标志物对预后的作用需要进行多方面的验证。第三，由于本研究为配对研究，能够纳入的病例较少，因此无法进一步研究 HCC 早期复发和晚期复发类型对干细胞性标志物表达的影响。第四，部分 HCC 具有多个肿瘤，本研究只选取了具有代表性的肿瘤进行干细胞性标志物和端粒的检测。因此，本研究的结论需要扩大样本量和多中心研究进行验证。
综上，本研究发现，与 HCC 复发前相比，复发 HCC 具有相似的干细胞性标志物表达，但端粒更长；EpCAM 表达水平与端粒长度均反映了 HCC 的恶性特点，但两者并没有相关性。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：王海清，课题设计和论文撰写；冯燮林，课题设计和论文修改；李磊，标本收集、临床数据收集和统计分析；郝景程和龚辰，病理标本的免疫组织化学和原位荧光杂交检测。
伦理声明：本研究已通过四川省肿瘤医院的伦理审核批准［批文编号：SCCHEC-02-2020-017］。
