引用本文： 张东阳, 陈小龙, 宋小海, 张世姣, 张维汉, 刘凯, 黄巧容, 孟文彤, 杨昆, 陈心足, 莫显明, 胡建昆. 胃癌患者外周血中CD45–CD44+CD54+细胞亚群含量及其临床意义. 中国普外基础与临床杂志, 2020, 27(4): 434-441. doi: 10.7507/1007-9424.201912012 复制
胃癌是我国高发病率和高死亡率的恶性肿瘤[1]。由于消化内镜的筛查程度较低，我国早期胃癌患者的比例仍较低，大部分患者诊断时已经处于进展期，其预后效果不佳。另外，胃癌患者在手术治疗或药物治疗后，常常通过影像学、消化内镜和肿瘤标志物联合判断肿瘤复发转移情况，但当前常规的诊疗技术还无法有效发现一些隐匿的转移灶，如淋巴结转移、腹膜转移、血行转移等。如何能准确判断胃癌患者是否存在微转移对有效制定治疗方案和准确判断胃癌患者预后具有重要意义。
循环肿瘤细胞与肿瘤的复发转移密切相关。有研究[2]报道，循环肿瘤细胞的数量可以预测肿瘤的转移、治疗反应、无病生存率和总体生存率。但目前研究[3-4]显示，循环肿瘤细胞的标志物在肿瘤中的应用价值仍待商榷，如针对上皮来源的肿瘤细胞的特征蛋白，运用最广泛的角蛋白（pan-CK）和上皮细胞黏附分子（EpCAM）的检测效果还需要更多的长期随访数据予以论证[5]。研究[6]发现大部分循环肿瘤细胞可能在外周血中死亡，只有极少一部分能够生存下来，可能形成复发转移。已有研究[7-8]证明，肿瘤干细胞具有抵抗上述各种压力的能力，是肿瘤发生发展、迁移侵袭和治疗抵抗的根源，而这数目极少的细胞群很可能就是循环肿瘤干细胞。在胃癌中，我们前期通过无血清培养已分离出胃癌肿瘤干细胞，并发现 CD44 和 CD54 是其特征性标志物，联合 CD44 和 CD54 这两种标志物可能用于表征胃癌循环肿瘤细胞[9]。因此，本研究旨在探究胃癌患者外周血中 CD45–CD44+CD54+细胞亚群的含量及其临床意义。
1 资料与方法
1.1 研究对象
本研究纳入 2016 年 12 月至 2017 年 9 月期间在四川大学华西医院胃肠外科住院的胃癌患者 38 例作为研究对象，其中行根治性切除（R0）28 例，姑息性切除 2 例，剖腹探查 3 例，未手术患者 5 例。术前采集其外周静脉血 3～5 mL 进行流式细胞术检测。其中，有术后病理学检测的患者采用病理分期；无术后病理学检测患者则采用术前临床分期或术中分期。本研究采用美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第 8 版 TNM 分期系统进行分期。胃癌患者血液采集已获得患者知情同意以及四川大学华西医院伦理委员会的审批。本研究中患者的随访方式通过电话和门诊随访，随访 31 例，随访率为 81.6%。
1.2 方法
1.2.1 流式细胞术检测
本研究涉及的抗 CD45、CD44 和 CD54 抗体购自 BD Bioscience 公司。于患者术前，用含 EDTA 抗凝的真空采血管采集胃癌患者外周静脉血 3～5 mL，1 h 内送至四川大学华西医院胃癌研究室处理。将全血按照体积比为 1∶4 加入红细胞裂解液中，裂解 15 min。以 300 g、15 min 离心后收集沉淀，观察裂红效果，如果不佳，则取裂红液 5 mL 继续裂红细胞沉淀 5 min，离心，收集细胞沉淀。裂红效果满意后，用磷酸盐缓冲液（PBS）200 μL 重悬细胞沉淀，根据抗体说明书加入荧光标记的抗体 4～10 μL，室温孵育 30 min，300 g、10 min 离心，PBS 洗涤沉淀，最后加入 0.8 mL PBS 重悬细胞沉淀，然后应用流式细胞仪（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）检测分析。按照公式计算得到 CD45–CD44+CD54+细胞数量（个/mL）=流式细胞仪计算所得 CD45–CD44+CD54+细胞数量/初始检测细胞数量×白细胞数量（个/mL）。
1.2.2 CD45–CD44+CD54+细胞亚群与胃癌临床病理学特征的关系分析
本研究纳入标准包括：① 经内镜活检证实的胃癌患者；② 临床病理资料完善；③ 签署研究知情同意书。本研究的排除标准为：拒绝加入本研究。纳入的临床病理学特征包括患者性别、年龄、肿瘤纵向部位、肿瘤横向部位、大体分型、分化程度、肿瘤大小、T 分期、N 分期、M 分期、TNM 分期、肿瘤标志物、生存时间和生存状态。
1.2.3 随访策略
患者出院后每年 2 次规律电话随访加定期门诊复查随访，记录其生存状态、并发症、复发转移情况等。本研究中患者的随访截止时间为 2019 年 10 月 31 日，结局指标为死亡。
1.3 统计学方法
本研究采用 GraphPad prism 8 软件进行统计分析。连续变量采用t检验、秩和检验或方差检验，分类变量采用卡方检验或秩和检验，生存分析采用 Kaplan-Meier 曲线分析，双侧检验，检验水准α=0.05。采用受试者操作曲线（ROC 曲线）和约登指数筛选连续变量的最佳截断值，根据 ROC 曲线下面积的大小比较判断其对肿瘤进展情况预测的准确性。
2 结果
2.1 外周血 CD45–CD44+CD54+细胞数检测结果
本研究共纳入 38 例患者，其外周血 CD45–CD44+CD54+细胞流式细胞仪检测结果见图 1：纳入本研究的 38 例胃癌患者外周血中的 CD45–CD44+CD54+细胞中位数为 541.9 个/mL（71.7～8 057.0 个/mL），R0 组患者的 CD45–CD44+CD54+细胞中位数为 555.9 个/mL（71.7～8 057.0 个/mL）。
图1
示外周血 CD45–CD44+CD54+细胞流式细胞仪检测结果
a：CD45–CD44+CD54+细胞流式图；b：总病例和 R0 组患者的CD45–CD44+CD54+细胞数
2.2 胃癌患者外周血 CD45–CD44+CD54+细胞数与其临床病理学特征的关系
结果见表 1。由表 1 可见：CD45–CD44+CD54+细胞数量在 N0 期较 N+期高（P=0.003），在 TNM Ⅰ–Ⅱ期中较 TNM Ⅲ–Ⅳ期高（P=0.016），除此之外，CD45–CD44+CD54+细胞数量在其他临床病理学特征中的差异均无统计学意义（P>0.05）。
表1
胃癌患者外周血 CD45–CD44+CD54+细胞数与其临床病理学特征的关系
2.3 胃癌患者外周血 CD45–CD44+CD54+细胞不同数值与其临床病理学特征的关系
根据 CD45–CD44+CD54+细胞数对胃癌 TNM 分期判断的 ROC 曲线（图 2）及约登指数[10]，本研究以 CD45–CD44+CD54+细胞数 300 个/mL 和 700 个/mL 为分界，将纳入本研究的患者分为 3 组，即 CD45–CD44+CD54+细胞数<300 个/mL 组（低细胞量组，n=9）、300～700 个/mL 组（中细胞量组，n=16）和≥700 个/mL 组（高细胞量组，n=13）。比较 3 组患者的临床病理学特征发现：CD45–CD44+CD54+高细胞量组中 T3–4 期（P=0.025）、N+期（P=0.009）和 TNM Ⅲ–Ⅳ期（P=0.012）胃癌患者所占的比例明显降低；分析其与肿瘤标志物的关系发现：相比于低细胞量组和高细胞量组，中细胞量组的 CA72-4 浓度最低（P=0.012）；但 3 组间其他临床病理学特征分析结果显示其差异均无统计学意义（P>0.05）。具体见表 1。
图2
示 CD45–CD44+CD54+细胞数对胃癌 TNM 分期判断的 ROC 曲线
2.4 CD45–CD44+CD54+细胞数联合肿瘤直径对胃癌 TNM 分期和 N 分期的判断效果
前述结果提示 CD45–CD44+CD54+细胞数与胃癌的 N 分期和 TNM 分期相关，本研究对此开展了进一步分析。除 CD45–CD44+CD54+细胞量与肿瘤 N 分期和 TNM 分期密切相关外，对其余临床病理学特征的曲线下面积相对较小，故未纳入进一步分析。对 TNM 分期的判断而言，在总病例中，CD45–CD44+CD54+细胞数 ROC 曲线下面积（AUC）为 0.762 ［95%CI 为（0.608，0.915）］，见图 3a，在 R0 组中AUC为 0.842 ［95%CI为（0.700，0.988）］，见图 3b。对 N 分期而言，在总病例中，CD45–CD44+CD54+细胞数AUC为 0.768 ［95% CI为（0.608，0.928）］，见图 3c，在 R0 组中AUC为 0.804 ［95% CI为（0.634，0.973）］，见图 3d。对 TNM 分期的判断而言，在总病例中，肿瘤直径（<5 cm 和≥5 cm）的AUC为 0.790 ［95% CI为（0.638，0.941）］，见图 3e，在 R0 组中AUC为 0.784 ［95% CI为（0.591，0.976）］，见图 3f。对 N 分期的判断而言，在总病例中，肿瘤直径的 AUC为 0.726 ［95% CI为（0.557，0.895）］，见图 3g，在 R0 组中AUC为 0.679 ［95% CI为（0.475，0.882）］，见图 3h。
图3
示 CD45–CD44+CD54+细胞数量和肿瘤直径以及二者的综合评分对胃癌 TNM 分期和 N 分期的 ROC 曲线
a：在总病例中 CD45–CD44+CD54+细胞数对 TNM 分期的 ROC 曲线；b：在 R0 组中 CD45–CD44+CD54+细胞数对 TNM 分期的 ROC 曲线；c：在总病例中 CD45–CD44+CD54+细胞数对 N 分期的 ROC 曲线；d：在 R0 组中 CD45–CD44+CD54+细胞数对 N 分期的 ROC 曲线；e：在总病例中肿瘤直径对 TNM 分期的 ROC 曲线；f：在 R0 组中肿瘤直径对 TNM 分期的 ROC 曲线；g：在总病例中肿瘤直径对 N 分期的 ROC 曲线；h：在 R0 组中肿瘤直径对 N 分期的 ROC 曲线；i：在总病例中综合得分对 TNM 分期的 ROC 曲线；j：在 R0 组中综合得分对 TNM 分期的 ROC 曲线；k：在总病例中综合得分对 N 分期的 ROC 曲线；l：在 R0 组中综合得分对 N 分期的 ROC 曲线
进一步将 CD45–CD44+CD54+细胞的不同数量（低细胞量=2 分、中细胞量=1 分、高细胞量=0 分）和不同肿瘤直径（<5 cm=0 分、≥5 cm=1 分）的分值相加形成综合评分（0～3 分），利用 ROC 曲线分析此综合评分对胃癌 TNM 分期和 N 分期的判断效能。对胃癌 TNM 分期而言，在总病例中，综合评分的AUC为 0.895 ［95% CI 为（0.795，0.995）］，见图 3i；在 R0 组中，AUC为 0.930 ［95% CI 为（0.828，1.000）］，见图 3j。对胃癌 N 分期而言，在总病例中，综合评分的AUC为 0.857 ［95% CI 为（0.738，0.977）］，见图 3k；在 R0 组中，AUC为 0.837 ［95% CI 为（0.685，0.988）］，见图 3l。综合评分的AUC均高于单独的 CD45–CD44+CD54+细胞数和单独的肿瘤直径。
2.5 CD45–CD44+CD54+细胞数与胃癌患者短期预后的关系
本次研究的随访截止时间为 2019 年 10 月 31 日，结局指标为死亡，获随访 31 例，随访率为 81.6%，中位随访时间为 26.2 个月（5.0～30 个月），随访结果为死亡。通过 Kaplan-Meier 曲线分析发现，CD45–CD44+CD54+低、中、高细胞量组患者间的 2 年生存率差异无统计学意义（P=0.819），见图 4a；在 R0 组中，CD45–CD44+CD54+低、中、高细胞量组患者间的 2 年生存率差异也无统计学意义（P =0.942），见图 4b。
图4
示 CD45–CD44+CD54+细胞不同数量组的生存曲线
a：总病例 CD45–CD44+CD54+低、中、高细胞量组患者的生存曲线；b：R0 组 CD45–CD44+CD54+低、中、高细胞量组患者的生存曲线
3 讨论
循环肿瘤细胞被认为在肿瘤转移中发挥了重要作用，检测循环肿瘤细胞的目的主要是判断是否存在肿瘤转移，是否能预测患者预后，是否能判断肿瘤的治疗效果。多数研究[2,11-18]发现循环肿瘤细胞的有无或多少与胃癌进展关系密切，存在或高含量的循环肿瘤细胞常常与胃癌淋巴结转移、远处转移、肿瘤复发、神经浸润、弥漫型肿瘤、更晚分期和不良预后相关。但也有研究[18-20]发现，循环肿瘤细胞与其临床病理学特征包括与 TNM 分期无明显相关性；还有学者[11]发现循环肿瘤细胞阴性的患者中 TNM Ⅲ–Ⅳ期比例更大，但差异并无统计学意义；有研究[19]报道，虽然循环肿瘤细胞阳性胃癌患者预后较阴性组差，但并未达到统计学差异。本研究通过生存分析发现：CD45–CD44+CD54+细胞亚群含量亚组之间的生存差异无统计学意义，可能系样本量较少且随访时间较短所致。
循环肿瘤细胞的标志物主要以上皮源性分子为特征性识别靶点，包括 pan-CK、EpCAM 等，并以循环系统特异性标志物 CD45、CD68 等作为剔除标志，通过这些标志物富集外周血中得到的上皮源性细胞，即认定为循环肿瘤细胞[13,16-18,20-24]。但有研究者[25-26]认为，外周血中的循环肿瘤细胞可能在从肿瘤实体到外周血的过程中，发生上皮间质转化（EMT）现象，导致通过只检测上皮源性的分子来识别循环肿瘤细胞是不严谨和不足够的。因此，有研究[16,24]把间质源性标志物如 Vimentin 和 Twist 也作为识别分子，联合上皮源性分子共同识别循环肿瘤细胞。还有学者[27-29]认为，外周血中的循环肿瘤细胞可能大部分被血流剪切力破坏或免疫细胞杀伤而死亡，只有极少部分具有肿瘤干细胞特性的循环肿瘤细胞存活，即循环肿瘤干细胞，而这些循环肿瘤干细胞可能表达肿瘤干细胞的特征性分子。因此，在胃癌循环肿瘤细胞的研究中，也有研究者[11,30-31]把肿瘤干细胞相关标志物 CD44 也作为循环肿瘤细胞的特征性识别靶点。综上，当前人们对循环肿瘤细胞的鉴定标准一直无法达成共识，其准确检测技术也面临较大的困难。笔者所在团队前期通过无血清培养和连续移植成瘤的技术，成功分选和鉴定出了胃癌肿瘤干细胞，并发现其特征性表达 CD44 和 CD54[9]，因此，我们思考胃癌患者外周血中的循环肿瘤细胞是否也可能表达 CD44 和 CD54。目前尚无专门针对 CD44 和 CD54 识别的试剂盒和仪器设备[12-18,21-24,31]。所以本研究采用流式细胞术的方式，通过负选血液系统特征性标志物 CD45，正选胃癌肿瘤干细胞标志物 CD44 和 CD54，检测胃癌患者外周血中 CD45–CD44+CD54+细胞亚群的含量。其结果显示：CD45–CD44+CD54+细胞亚群的含量较高，平均约 1 000 个/mL，较高于既往文献报道的平均水平。分析原因，可能是本研究并未通过广泛报道的上皮源性标志物和间质源性标志物来筛选细胞亚群。除此之外本研究还发现 CD45–CD44+CD54+细胞亚群数量与胃癌 N 分期和 TNM 分期之间存在相关性，即 N 分期和 TNM 分期晚者其 CD45–CD44+CD54+的细胞数量则少，差异具有统计学意义。由于本研究是单纯通过标志物筛选 CD45–CD44+CD54+细胞亚群，尚未经过功能学实验验证。因此，该亚群细胞尚不能代表是循环肿瘤干细胞，这可能导致本研究出现与既往研究[2,11-18]不同的结果。另外，该细胞亚群可能存在某种机制促进胃癌的进展，还有待进一步研究。
另外，本研究发现结合 CD45–CD44+CD54+细胞数量与肿瘤大小形成的综合评分对判断胃癌 TNM 分期和 N 分期的效果较好，可能作为预测肿瘤 N 分期和 TNM 分期的指标。
本研究的不足之处在于样本量较少，随访时间较短，失访患者稍多，一定程度上影响了统计学检验效能。另外，本研究还纳入了非手术的患者，可能对肿瘤的准确分期有一定影响。
4 结论
CD45–CD44+CD54+细胞亚群的数量与肿瘤进展有相关性，可能用于判断胃癌的 TNM 分期和 N 分期。但由于本研究纳入患者数较少，仍需扩大样本进一步论证 CD45–CD44+CD54+细胞亚群在胃癌患者中的临床意义。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：张东阳、陈小龙、胡建昆、莫显明设计研究思路；张维汉、刘凯、张世姣收集临床资料与随访；宋小海、黄巧容、孟文彤完成流式细胞实验；张东阳、陈小龙完成数据的整理及论文撰写；陈心足、杨昆给予论文统计学分析；胡建昆、莫显明审校论文。
伦理声明：本研究通过了四川大学华西医院临床试验与生物伦理专委会审查［审批文号2014 年审（82）号］。
胃癌是我国高发病率和高死亡率的恶性肿瘤[1]。由于消化内镜的筛查程度较低，我国早期胃癌患者的比例仍较低，大部分患者诊断时已经处于进展期，其预后效果不佳。另外，胃癌患者在手术治疗或药物治疗后，常常通过影像学、消化内镜和肿瘤标志物联合判断肿瘤复发转移情况，但当前常规的诊疗技术还无法有效发现一些隐匿的转移灶，如淋巴结转移、腹膜转移、血行转移等。如何能准确判断胃癌患者是否存在微转移对有效制定治疗方案和准确判断胃癌患者预后具有重要意义。
循环肿瘤细胞与肿瘤的复发转移密切相关。有研究[2]报道，循环肿瘤细胞的数量可以预测肿瘤的转移、治疗反应、无病生存率和总体生存率。但目前研究[3-4]显示，循环肿瘤细胞的标志物在肿瘤中的应用价值仍待商榷，如针对上皮来源的肿瘤细胞的特征蛋白，运用最广泛的角蛋白（pan-CK）和上皮细胞黏附分子（EpCAM）的检测效果还需要更多的长期随访数据予以论证[5]。研究[6]发现大部分循环肿瘤细胞可能在外周血中死亡，只有极少一部分能够生存下来，可能形成复发转移。已有研究[7-8]证明，肿瘤干细胞具有抵抗上述各种压力的能力，是肿瘤发生发展、迁移侵袭和治疗抵抗的根源，而这数目极少的细胞群很可能就是循环肿瘤干细胞。在胃癌中，我们前期通过无血清培养已分离出胃癌肿瘤干细胞，并发现 CD44 和 CD54 是其特征性标志物，联合 CD44 和 CD54 这两种标志物可能用于表征胃癌循环肿瘤细胞[9]。因此，本研究旨在探究胃癌患者外周血中 CD45–CD44+CD54+细胞亚群的含量及其临床意义。
1 资料与方法
1.1 研究对象
本研究纳入 2016 年 12 月至 2017 年 9 月期间在四川大学华西医院胃肠外科住院的胃癌患者 38 例作为研究对象，其中行根治性切除（R0）28 例，姑息性切除 2 例，剖腹探查 3 例，未手术患者 5 例。术前采集其外周静脉血 3～5 mL 进行流式细胞术检测。其中，有术后病理学检测的患者采用病理分期；无术后病理学检测患者则采用术前临床分期或术中分期。本研究采用美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第 8 版 TNM 分期系统进行分期。胃癌患者血液采集已获得患者知情同意以及四川大学华西医院伦理委员会的审批。本研究中患者的随访方式通过电话和门诊随访，随访 31 例，随访率为 81.6%。
1.2 方法
1.2.1 流式细胞术检测
本研究涉及的抗 CD45、CD44 和 CD54 抗体购自 BD Bioscience 公司。于患者术前，用含 EDTA 抗凝的真空采血管采集胃癌患者外周静脉血 3～5 mL，1 h 内送至四川大学华西医院胃癌研究室处理。将全血按照体积比为 1∶4 加入红细胞裂解液中，裂解 15 min。以 300 g、15 min 离心后收集沉淀，观察裂红效果，如果不佳，则取裂红液 5 mL 继续裂红细胞沉淀 5 min，离心，收集细胞沉淀。裂红效果满意后，用磷酸盐缓冲液（PBS）200 μL 重悬细胞沉淀，根据抗体说明书加入荧光标记的抗体 4～10 μL，室温孵育 30 min，300 g、10 min 离心，PBS 洗涤沉淀，最后加入 0.8 mL PBS 重悬细胞沉淀，然后应用流式细胞仪（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）检测分析。按照公式计算得到 CD45–CD44+CD54+细胞数量（个/mL）=流式细胞仪计算所得 CD45–CD44+CD54+细胞数量/初始检测细胞数量×白细胞数量（个/mL）。
1.2.2 CD45–CD44+CD54+细胞亚群与胃癌临床病理学特征的关系分析
本研究纳入标准包括：① 经内镜活检证实的胃癌患者；② 临床病理资料完善；③ 签署研究知情同意书。本研究的排除标准为：拒绝加入本研究。纳入的临床病理学特征包括患者性别、年龄、肿瘤纵向部位、肿瘤横向部位、大体分型、分化程度、肿瘤大小、T 分期、N 分期、M 分期、TNM 分期、肿瘤标志物、生存时间和生存状态。
1.2.3 随访策略
患者出院后每年 2 次规律电话随访加定期门诊复查随访，记录其生存状态、并发症、复发转移情况等。本研究中患者的随访截止时间为 2019 年 10 月 31 日，结局指标为死亡。
1.3 统计学方法
本研究采用 GraphPad prism 8 软件进行统计分析。连续变量采用t检验、秩和检验或方差检验，分类变量采用卡方检验或秩和检验，生存分析采用 Kaplan-Meier 曲线分析，双侧检验，检验水准α=0.05。采用受试者操作曲线（ROC 曲线）和约登指数筛选连续变量的最佳截断值，根据 ROC 曲线下面积的大小比较判断其对肿瘤进展情况预测的准确性。
2 结果
2.1 外周血 CD45–CD44+CD54+细胞数检测结果
本研究共纳入 38 例患者，其外周血 CD45–CD44+CD54+细胞流式细胞仪检测结果见图 1：纳入本研究的 38 例胃癌患者外周血中的 CD45–CD44+CD54+细胞中位数为 541.9 个/mL（71.7～8 057.0 个/mL），R0 组患者的 CD45–CD44+CD54+细胞中位数为 555.9 个/mL（71.7～8 057.0 个/mL）。
图1
示外周血 CD45–CD44+CD54+细胞流式细胞仪检测结果
a：CD45–CD44+CD54+细胞流式图；b：总病例和 R0 组患者的CD45–CD44+CD54+细胞数
2.2 胃癌患者外周血 CD45–CD44+CD54+细胞数与其临床病理学特征的关系
结果见表 1。由表 1 可见：CD45–CD44+CD54+细胞数量在 N0 期较 N+期高（P=0.003），在 TNM Ⅰ–Ⅱ期中较 TNM Ⅲ–Ⅳ期高（P=0.016），除此之外，CD45–CD44+CD54+细胞数量在其他临床病理学特征中的差异均无统计学意义（P>0.05）。
表1
胃癌患者外周血 CD45–CD44+CD54+细胞数与其临床病理学特征的关系
2.3 胃癌患者外周血 CD45–CD44+CD54+细胞不同数值与其临床病理学特征的关系
根据 CD45–CD44+CD54+细胞数对胃癌 TNM 分期判断的 ROC 曲线（图 2）及约登指数[10]，本研究以 CD45–CD44+CD54+细胞数 300 个/mL 和 700 个/mL 为分界，将纳入本研究的患者分为 3 组，即 CD45–CD44+CD54+细胞数<300 个/mL 组（低细胞量组，n=9）、300～700 个/mL 组（中细胞量组，n=16）和≥700 个/mL 组（高细胞量组，n=13）。比较 3 组患者的临床病理学特征发现：CD45–CD44+CD54+高细胞量组中 T3–4 期（P=0.025）、N+期（P=0.009）和 TNM Ⅲ–Ⅳ期（P=0.012）胃癌患者所占的比例明显降低；分析其与肿瘤标志物的关系发现：相比于低细胞量组和高细胞量组，中细胞量组的 CA72-4 浓度最低（P=0.012）；但 3 组间其他临床病理学特征分析结果显示其差异均无统计学意义（P>0.05）。具体见表 1。
图2
示 CD45–CD44+CD54+细胞数对胃癌 TNM 分期判断的 ROC 曲线
2.4 CD45–CD44+CD54+细胞数联合肿瘤直径对胃癌 TNM 分期和 N 分期的判断效果
前述结果提示 CD45–CD44+CD54+细胞数与胃癌的 N 分期和 TNM 分期相关，本研究对此开展了进一步分析。除 CD45–CD44+CD54+细胞量与肿瘤 N 分期和 TNM 分期密切相关外，对其余临床病理学特征的曲线下面积相对较小，故未纳入进一步分析。对 TNM 分期的判断而言，在总病例中，CD45–CD44+CD54+细胞数 ROC 曲线下面积（AUC）为 0.762 ［95%CI 为（0.608，0.915）］，见图 3a，在 R0 组中AUC为 0.842 ［95%CI为（0.700，0.988）］，见图 3b。对 N 分期而言，在总病例中，CD45–CD44+CD54+细胞数AUC为 0.768 ［95% CI为（0.608，0.928）］，见图 3c，在 R0 组中AUC为 0.804 ［95% CI为（0.634，0.973）］，见图 3d。对 TNM 分期的判断而言，在总病例中，肿瘤直径（<5 cm 和≥5 cm）的AUC为 0.790 ［95% CI为（0.638，0.941）］，见图 3e，在 R0 组中AUC为 0.784 ［95% CI为（0.591，0.976）］，见图 3f。对 N 分期的判断而言，在总病例中，肿瘤直径的 AUC为 0.726 ［95% CI为（0.557，0.895）］，见图 3g，在 R0 组中AUC为 0.679 ［95% CI为（0.475，0.882）］，见图 3h。
图3
示 CD45–CD44+CD54+细胞数量和肿瘤直径以及二者的综合评分对胃癌 TNM 分期和 N 分期的 ROC 曲线
a：在总病例中 CD45–CD44+CD54+细胞数对 TNM 分期的 ROC 曲线；b：在 R0 组中 CD45–CD44+CD54+细胞数对 TNM 分期的 ROC 曲线；c：在总病例中 CD45–CD44+CD54+细胞数对 N 分期的 ROC 曲线；d：在 R0 组中 CD45–CD44+CD54+细胞数对 N 分期的 ROC 曲线；e：在总病例中肿瘤直径对 TNM 分期的 ROC 曲线；f：在 R0 组中肿瘤直径对 TNM 分期的 ROC 曲线；g：在总病例中肿瘤直径对 N 分期的 ROC 曲线；h：在 R0 组中肿瘤直径对 N 分期的 ROC 曲线；i：在总病例中综合得分对 TNM 分期的 ROC 曲线；j：在 R0 组中综合得分对 TNM 分期的 ROC 曲线；k：在总病例中综合得分对 N 分期的 ROC 曲线；l：在 R0 组中综合得分对 N 分期的 ROC 曲线
进一步将 CD45–CD44+CD54+细胞的不同数量（低细胞量=2 分、中细胞量=1 分、高细胞量=0 分）和不同肿瘤直径（<5 cm=0 分、≥5 cm=1 分）的分值相加形成综合评分（0～3 分），利用 ROC 曲线分析此综合评分对胃癌 TNM 分期和 N 分期的判断效能。对胃癌 TNM 分期而言，在总病例中，综合评分的AUC为 0.895 ［95% CI 为（0.795，0.995）］，见图 3i；在 R0 组中，AUC为 0.930 ［95% CI 为（0.828，1.000）］，见图 3j。对胃癌 N 分期而言，在总病例中，综合评分的AUC为 0.857 ［95% CI 为（0.738，0.977）］，见图 3k；在 R0 组中，AUC为 0.837 ［95% CI 为（0.685，0.988）］，见图 3l。综合评分的AUC均高于单独的 CD45–CD44+CD54+细胞数和单独的肿瘤直径。
2.5 CD45–CD44+CD54+细胞数与胃癌患者短期预后的关系
本次研究的随访截止时间为 2019 年 10 月 31 日，结局指标为死亡，获随访 31 例，随访率为 81.6%，中位随访时间为 26.2 个月（5.0～30 个月），随访结果为死亡。通过 Kaplan-Meier 曲线分析发现，CD45–CD44+CD54+低、中、高细胞量组患者间的 2 年生存率差异无统计学意义（P=0.819），见图 4a；在 R0 组中，CD45–CD44+CD54+低、中、高细胞量组患者间的 2 年生存率差异也无统计学意义（P =0.942），见图 4b。
图4
示 CD45–CD44+CD54+细胞不同数量组的生存曲线
a：总病例 CD45–CD44+CD54+低、中、高细胞量组患者的生存曲线；b：R0 组 CD45–CD44+CD54+低、中、高细胞量组患者的生存曲线
3 讨论
循环肿瘤细胞被认为在肿瘤转移中发挥了重要作用，检测循环肿瘤细胞的目的主要是判断是否存在肿瘤转移，是否能预测患者预后，是否能判断肿瘤的治疗效果。多数研究[2,11-18]发现循环肿瘤细胞的有无或多少与胃癌进展关系密切，存在或高含量的循环肿瘤细胞常常与胃癌淋巴结转移、远处转移、肿瘤复发、神经浸润、弥漫型肿瘤、更晚分期和不良预后相关。但也有研究[18-20]发现，循环肿瘤细胞与其临床病理学特征包括与 TNM 分期无明显相关性；还有学者[11]发现循环肿瘤细胞阴性的患者中 TNM Ⅲ–Ⅳ期比例更大，但差异并无统计学意义；有研究[19]报道，虽然循环肿瘤细胞阳性胃癌患者预后较阴性组差，但并未达到统计学差异。本研究通过生存分析发现：CD45–CD44+CD54+细胞亚群含量亚组之间的生存差异无统计学意义，可能系样本量较少且随访时间较短所致。
循环肿瘤细胞的标志物主要以上皮源性分子为特征性识别靶点，包括 pan-CK、EpCAM 等，并以循环系统特异性标志物 CD45、CD68 等作为剔除标志，通过这些标志物富集外周血中得到的上皮源性细胞，即认定为循环肿瘤细胞[13,16-18,20-24]。但有研究者[25-26]认为，外周血中的循环肿瘤细胞可能在从肿瘤实体到外周血的过程中，发生上皮间质转化（EMT）现象，导致通过只检测上皮源性的分子来识别循环肿瘤细胞是不严谨和不足够的。因此，有研究[16,24]把间质源性标志物如 Vimentin 和 Twist 也作为识别分子，联合上皮源性分子共同识别循环肿瘤细胞。还有学者[27-29]认为，外周血中的循环肿瘤细胞可能大部分被血流剪切力破坏或免疫细胞杀伤而死亡，只有极少部分具有肿瘤干细胞特性的循环肿瘤细胞存活，即循环肿瘤干细胞，而这些循环肿瘤干细胞可能表达肿瘤干细胞的特征性分子。因此，在胃癌循环肿瘤细胞的研究中，也有研究者[11,30-31]把肿瘤干细胞相关标志物 CD44 也作为循环肿瘤细胞的特征性识别靶点。综上，当前人们对循环肿瘤细胞的鉴定标准一直无法达成共识，其准确检测技术也面临较大的困难。笔者所在团队前期通过无血清培养和连续移植成瘤的技术，成功分选和鉴定出了胃癌肿瘤干细胞，并发现其特征性表达 CD44 和 CD54[9]，因此，我们思考胃癌患者外周血中的循环肿瘤细胞是否也可能表达 CD44 和 CD54。目前尚无专门针对 CD44 和 CD54 识别的试剂盒和仪器设备[12-18,21-24,31]。所以本研究采用流式细胞术的方式，通过负选血液系统特征性标志物 CD45，正选胃癌肿瘤干细胞标志物 CD44 和 CD54，检测胃癌患者外周血中 CD45–CD44+CD54+细胞亚群的含量。其结果显示：CD45–CD44+CD54+细胞亚群的含量较高，平均约 1 000 个/mL，较高于既往文献报道的平均水平。分析原因，可能是本研究并未通过广泛报道的上皮源性标志物和间质源性标志物来筛选细胞亚群。除此之外本研究还发现 CD45–CD44+CD54+细胞亚群数量与胃癌 N 分期和 TNM 分期之间存在相关性，即 N 分期和 TNM 分期晚者其 CD45–CD44+CD54+的细胞数量则少，差异具有统计学意义。由于本研究是单纯通过标志物筛选 CD45–CD44+CD54+细胞亚群，尚未经过功能学实验验证。因此，该亚群细胞尚不能代表是循环肿瘤干细胞，这可能导致本研究出现与既往研究[2,11-18]不同的结果。另外，该细胞亚群可能存在某种机制促进胃癌的进展，还有待进一步研究。
另外，本研究发现结合 CD45–CD44+CD54+细胞数量与肿瘤大小形成的综合评分对判断胃癌 TNM 分期和 N 分期的效果较好，可能作为预测肿瘤 N 分期和 TNM 分期的指标。
本研究的不足之处在于样本量较少，随访时间较短，失访患者稍多，一定程度上影响了统计学检验效能。另外，本研究还纳入了非手术的患者，可能对肿瘤的准确分期有一定影响。
4 结论
CD45–CD44+CD54+细胞亚群的数量与肿瘤进展有相关性，可能用于判断胃癌的 TNM 分期和 N 分期。但由于本研究纳入患者数较少，仍需扩大样本进一步论证 CD45–CD44+CD54+细胞亚群在胃癌患者中的临床意义。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：张东阳、陈小龙、胡建昆、莫显明设计研究思路；张维汉、刘凯、张世姣收集临床资料与随访；宋小海、黄巧容、孟文彤完成流式细胞实验；张东阳、陈小龙完成数据的整理及论文撰写；陈心足、杨昆给予论文统计学分析；胡建昆、莫显明审校论文。
伦理声明：本研究通过了四川大学华西医院临床试验与生物伦理专委会审查［审批文号2014 年审（82）号］。
