引用本文： 鹿彬, 张鹏, 张延涛, 张启文. NF-κBp65 蛋白和自噬相关因子 Beclin1 及 p62 在甲状腺癌中的表达及临床意义. 中国普外基础与临床杂志, 2019, 26(11): 1304-1310. doi: 10.7507/1007-9424.201906051 复制
甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺癌的高发类型，约占甲状腺癌的 85%，发病机制目前尚未完全明确[1]。尽管近年来诊疗手段有了很大进展，但由于其容易发生淋巴结转移，预后依然较差[2]。自噬是细胞适应内外部环境变化的能动过程，细胞内部分胞浆、蛋白质和变性坏死的细胞器与自噬泡中的溶酶体融合形成自噬溶酶体，并降解产生氨基酸和核苷酸供细胞再利用的循环过程，也被称为Ⅱ型程序性死亡，属于细胞正常的功能，这一功能在进化过程中高度保守[3]。研究[4]表明，自噬在肿瘤细胞生长、发育、成熟及死亡过程发挥着不同的作用。据文献[5]报道，核因子 NF-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）与肿瘤细胞的发生、发展密切相关，在多种实体瘤中呈异常高表达。此外，NF-κBp65 通过调节多条信号转导通路参与了细胞的自噬过程[6]。目前，自噬与 NF-κBp65 是否相互作用共同促进 PTC 合并颈部淋巴结转移的发展尚不清楚。因此本研究拟分析 NF-κBp65 和自噬相关蛋白 Beclin1 和 p62 在 PTC 组织中的表达，并探讨其临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集 2013 年 3 月至 2015 年 2 月期间笔者所在医院收治的 160 例经病理学检查证实为 PTC 患者的肿瘤组织标本及其癌旁组织标本，同时收集上述患者中伴有颈部淋巴结转移组织标本 90 例。纳入标准：①经病理学检查确诊为 PTC 的患者；② 所有入选患者在术前均未进行放化疗和其他治疗；③ 3 年随访资料完整。排除标准：伴随有其他恶性肿瘤的患者。160 例 PTC 患者中男 56 例，女 104 例；年龄 40～79 岁，中位年龄 48.8 岁。按照国际抗癌联盟 TNM 分期标准 2009 版[7]：Ⅰ+Ⅱ期患者 78 例，Ⅲ+Ⅳ期患者 82 例；肿瘤直径<1 cm 患者 70 例，≥1 cm 患者 90 例；组织学分级：高分化患者 52 例，中分化患者 64 例，低分化患者 44 例。所有组织标本均用 10% 中性甲醛固定，然后常规石蜡包埋，用于后续免疫组化法检测。本组 PTC 患者均以电话、门诊等方式进行了随访，随访截止时间为 2018 年 3 月 20 日，总生存时间（total survival time，OS）为从手术至随访结束或者死亡时间止。
1.2 主要抗体和试剂盒
兔抗人 NF-κBp65 多克隆抗体、兔抗人 Beclin1 单克隆抗体和 p62 单克隆抗体采购自北京奥维亚生物技术有限公司，链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptomyces anti-biotin protein-peroxidase，SP）试剂盒购自美国 Abcam 公司，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒采购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 免疫组织化学检测
取纳入研究的组织石蜡标本进行切片，片厚 4 μm，将切片放入水浴 40℃、4 min、进行展开，然后置于 60℃ 烘箱中进行烘片 30 min。采用二甲苯进行脱蜡 20 min，然后采用梯度乙醇进行水化，再加入 3% 双氧水，室温 10 min，从而阻断内源性过氧化物酶的活性；再对 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 蛋白进行高温高压组织修复，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）进行冲洗，加入 5% 羊血孵育 30 min，除去封闭液，加入一抗，置于 4℃ 冰箱过夜，PBS 代替一抗作为阴性对照，次日取出使用 PBS 冲洗，每张切片滴加二抗，室温下孵育 30 min，PBS 冲洗 5 次，每次 3 min，加入 DAB 显色水、使用 PBS 冲洗终止显色，使用水冲洗，盐酸乙醇分化，乙醇脱水干燥，于光学显微镜下进行观察。
1.4 NF-κBp65、Beclin1 和 p62 表达阳性判定标准
光学显微镜下观察制备好的切片，阳性表达为细胞内出现棕黄色颗粒。由两名病理科医师独立进行评估，每张切片随机选取 5 个高倍镜视野（×400）在光镜下观察，通过染色的强度和阳性细胞数 2 个总分评分判定是否阳性。染色强度计分：无着色计 0 分，淡黄色计 1 分，棕黄或棕褐色计 2 分；阳性细胞数计分：无阳性细胞计 0 分，< 25% 计 1 分，25%～50% 计 2 分，51%～75% 计 3 分，>75% 计 4 分。两者结果相乘>3 即为阳性，≤3 则为阴性[8]。
1.5 统计学方法
采用 SPSS16.0 统计学软件进行统计学分析。分类资料用百分比表示，采用 χ2 检验或 Fisher 检验进行分析；等级变量之间的相关性采用 Spearman 相关分析；采用 Graphpad prism 5 软件绘制生存曲线，生存分析应用 Kaplan-Meier 方法，Cox 回归比例风险模型分析预后影响因素。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 NF-κBp65、Beclin1 和 p62 在不 同组织中表达的检测结果
NF-κBp65、Beclin1 和 p62 在不同组织中表达的免疫组织化学染色结果见图 1。PTC 组织和转移淋巴结组织中 NF-κBp65 及 p62 表达阳性率均明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05），但 PTC 组织和转移淋巴结组织中 NF-κBp65 及 p62 表达阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）。PTC 组织和转移淋巴结组织中 Beclin1 表达阳性率明显低于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05），而 PTC 组织和转移淋巴结组织中 Beclin1 表达阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）。具体见表 1。
图1
示免疫组织化学法检测 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 在不同组织中的表达（IHC ×200）
a：NF-κBp65 在癌旁组织中阴性表达；b：NF-κBp65 在转移淋巴结组织中阳性表达；c：NF-κBp65 在 PTC 组织中阳性表达；d：Beclin1 在癌旁组织中阴性表达；e：Beclin1 在转移淋巴结组织中阳性表达；f：Beclin1 在 PTC 组织中阳性表达；g：p62 在癌旁组织中阴性表达；h：p62 在转移淋巴结组织中阳性表达；i：p62 在 PTC 组织中阳性表达
表1
NF-κBp65、Beclin1 及 p62 在不同组织中的表达结果［例（%）］
2.2 PTC 组织中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 表达与其临床病理特征的关系
结果见表 2。由表 2 可见：PTC 组织中 NF-κBp65 的表达与其临床病理特征均无关（P>0.05）。PTC 组织中 Beclin1 及 p62 在不同性别、年龄及肿瘤直径 PTC 患者中的表达阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。p62 在不同分化程度 PTC 患者中的表达情况比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中，p62 表达阳性率随肿瘤分化程度升高而降低。Beclin1 在不同肿瘤分化程度 PTC 患者中的表达情况比较，差异无统计学意义（P>0.05）；在Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴结转移者中其 Beclin1 表达阳性率分别低于Ⅰ+Ⅱ期和无淋巴转移者（P<0.05），而 p62 的表达则与之相反。
表2
PTC 组织中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 的表达与其临床病理特征的关系［例（%）］
2.3 NF-κBp65、Beclin1 和 p62 表达的相关性分析结果
Spearman 相关分析显示，PTC 组织中，Beclin1 和 p62 的表达呈负相关关系（r=–0.656，P<0.01），PTC 组织中 NF-κBp65 与 Beclin1 和 p62 的表达无明显相关性（r=0.042，r=0.116，P>0.05）；在转移淋巴结组织中，Beclin1 和 p62 的表达也呈负相关关系（r=–0.562，P<0.01），NF-κBp65 与 Beclin1 和 p62 的表达无明显相关性（r=0.071，r=0.136，P>0.05）。
2.4 PTC 组织中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 的 表达对预后的影响
160 例患者随访 3 年，死亡 44 例，3 年生存率为 72.50%（116/160）。PTC 组织中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 表达阳性及阴性者的生存曲线见图 2。PTC 组织中 p62 表达阳性者 3 年生存率为 65.52%（76/116），低于表达阴性者的 90.91%（40/44），差异有统计学意义（χ2=34.351，P=0.000）；NF-κBp65 及 Beclin1 表达阳性患者的 3 年生存率分别为 67.69%（88/130）和 94.12%（32/34），与 NF-κBp65 及 Beclin1 表达阴性患者的 93.33%（28/30）、66.67%（84/126）比较，明显降低或增高，差异均具有统计学意义（χ2=8.038、χ2=10.120，P<0.05）。
图2
示 NF-κBp65（a）、Beclin1（b）及 p62（c）表达阳性/阴性患者的生存曲线
2.5 PTC 患者预后影 响因素的 COX 比例风险模型分析结果
单因素分析结果（表 3）显示 TNM 分期、淋巴结转移是 PTC 预后的影响因素。以患者预后的生存情况为因变量，采用 COX 比例风险回归模型分析 PTC 患者 TNM 分期、淋巴结转移、NF-κBp65、Beclin1 及 p62 的表达对其预后的影响，结果显示：TNM 分期、淋巴结转移、NF-κBp65 及 Beclin1 为 PTC 预后的独立危险因素，Beclin1 为保护因素（表 4）。
表3
PTC 患者预后影响因素的单因素分析
表4
PTC 患者预后影响因素的 Cox 比例风险模型分析结果
3 讨论
PTC 是甲状腺恶性肿瘤中最为常见的类型，多发于中青年女性，且容易较早发生淋巴结转移，对患者生命安全造成严重威胁。研究[9]表明，有多个癌基因及抑癌基因参与了 PTC 的发生发展，深入探讨相关蛋白的表达有利于进一步明确肿瘤的发病机制，同时可提高临床分子诊断的准确性，有助于改善患者预后[10]。
细胞死亡根据形态学表型不同分为Ⅰ、Ⅱ 和 Ⅲ 3 种类型，分别指凋亡、自噬性细胞死亡和细胞坏死[11]。自噬广泛存在于细胞的生理活动中，正常细胞通过自噬可以清除胞内废物，维持细胞内环境及基因组的稳定，同时也是一种细胞对抗营养缺乏、电离辐射等不良环境的防御机制，在抑制炎症或肿瘤的生长过程中也起到重要的作用[12]。然而有研究[13]表明，自噬活性受到损伤后对于细胞病变和肿瘤的进展起到促进作用。微环境决定了自噬在肿瘤发展中的作用，在肿瘤细胞中自噬相关蛋白会出现异常表达，自噬相关蛋白的表达成为研究肿瘤发生及抑制肿瘤发展的热点。
Beclin1 称之为 BECN1 基因，位于人类染色体 17q21，定位于高尔基体，能够参与自噬体和 PI3K 复合物的形成。文献[14]报道称 Beclin1 参与多种肿瘤的发生和发展，其中在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌组织中因 Beclin1 基因突变而蛋白表达量降低。本研究发现，PTC 组织及转移的淋巴结组织中 Beclin1 的表达阳性率低于癌旁组织，提示 Beclin1 可能参与 PTC 的发生、发展。TNM 分期和淋巴结转移是评估 PTC 恶性程度的重要指标，本研究结果显示，Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴结转移者中其 Beclin1 表达阳性率分别低于Ⅰ+Ⅱ期和无淋巴转移者（P<0.05），提示 Beclin1 低表达和 PTC 的生物学行为存在关系。通过进一步生存分析显示：Beclin1 表达阳性和阴性患者其 3 年生存率也存在明显差异，COX 比例风险模型结果显示 Beclin1 是 PTC 患者预后的保护因素，提示 Beclin1 的表达和 PTC 患者预后存在一定关系，但只检测 Beclin1 不能很好地反映预后情况。
p62 是一种自噬底物连接蛋白，具有多个结构域，可结合泛素化修饰的待降解蛋白，并将其运输到自噬泡中降解[15]。细胞质中的 p62 在正常细胞自噬过程中不断被降解，而自噬功能出现缺陷或失活后，会导致 p62 蛋白在细胞质中累积，所以 p62 可以作为反映细胞自噬活性的标志性蛋白[16]。有研究[17]表明，p62 浓度增加会促进活性氧的累积，进而导致细胞内质网发生应激反应和 DNA 损伤。此外，NF-κB 信号通路及下游基因的表达也会受到 p62 积累的影响而导致促肿瘤炎症反应上调。自噬通过降低细胞内 p62 的水平是抑制肿瘤形成的机制之一[18]。Beclin1 是在哺乳动物中第一个被发现的调节自噬抑癌基因，而 p62 可使 Beclin1 和 Bcl-2 分离，释放出 Beclin1 而促进自噬活性[19]。本研究发现，PTC 组织及转移的淋巴结组织中 p62 的表达阳性率高于癌旁组织，提示 p62 可能参与了 PTC 的发生和发展；进一步分析显示，PTC 组织中 p62 的表达阳性率随着 TNM 分期和分化程度的降低而增加，有淋巴结转移患者 p62 表达阳性率亦增加明显，提示 p62 高表达能够间接反映 PTC 恶性生物学行为。相关性分析结果显示，PTC 组织及转移淋巴结组织中 p62 的表达与 Beclin1 表达呈负相关关系，随访结果显示 p62 表达阳性患者的 3 年生存率明显低于表达阴性患者，COX 分析结果显示 p62 高表达可作为评估 PTC 预后的独立危险因素。
NF-κBp65 是由原癌基因表达，其能够使 Beclin1 磷酸化而抑制自噬活性，NF-κBp65 还可根据其具有的激酶非依赖活性促进细胞存活[8,20-21]。研究[22-24]表明，NF-κBp65 在多种实体瘤中均呈高表达状态。本研究结果与之类似，在 PTC 组织和转移淋巴结组织中 NF-κBp65 表达阳性率高于癌旁组织，提示 NF-κBp65 与 PTC 的发生发展关系密切；进一步结果显示 NF-κBp65 表达与 PTC 患者临床病理特征均不存在相关性，但 NF-κBp65 表达阳性者的 3 年生存率低于表达阴性者，其差异具有统计学意义，这可能与纳入的临床样本量较少有关。本研究发现，NF-κBp65 表达与自噬相关蛋白 Beclin1 和 p62 的表达无相关性，可能是由于自噬的调节与 NF-κBp65 磷酸化水平有关，而总 NF-κBp65 蛋白表达水平不能反映磷酸化程度，因而呈现与自噬相关性不显著。但本研究发现 NF-κBp65 也可作为 PTC 患者预后的独立预测因素。
综上所述，NF-κBp65 和 p62 蛋白在 PTC 组织及其淋巴结转移组织中呈高表达，而 Beclin1 呈低表达，三者可作为 PTC 患者预后的独立预测因素；此外，Beclin1 及 p62 与 PTC 生物学行为有关，可能成为 PTC 诊断的潜在指标。
重要声明
利益冲突声明：无任何利益冲突。
作者贡献声明：鹿彬和张鹏：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；张启文：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；张延涛：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改。
伦理声明：本研究通过了济南市人民医院伦理委员会的审批。
甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺癌的高发类型，约占甲状腺癌的 85%，发病机制目前尚未完全明确[1]。尽管近年来诊疗手段有了很大进展，但由于其容易发生淋巴结转移，预后依然较差[2]。自噬是细胞适应内外部环境变化的能动过程，细胞内部分胞浆、蛋白质和变性坏死的细胞器与自噬泡中的溶酶体融合形成自噬溶酶体，并降解产生氨基酸和核苷酸供细胞再利用的循环过程，也被称为Ⅱ型程序性死亡，属于细胞正常的功能，这一功能在进化过程中高度保守[3]。研究[4]表明，自噬在肿瘤细胞生长、发育、成熟及死亡过程发挥着不同的作用。据文献[5]报道，核因子 NF-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）与肿瘤细胞的发生、发展密切相关，在多种实体瘤中呈异常高表达。此外，NF-κBp65 通过调节多条信号转导通路参与了细胞的自噬过程[6]。目前，自噬与 NF-κBp65 是否相互作用共同促进 PTC 合并颈部淋巴结转移的发展尚不清楚。因此本研究拟分析 NF-κBp65 和自噬相关蛋白 Beclin1 和 p62 在 PTC 组织中的表达，并探讨其临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集 2013 年 3 月至 2015 年 2 月期间笔者所在医院收治的 160 例经病理学检查证实为 PTC 患者的肿瘤组织标本及其癌旁组织标本，同时收集上述患者中伴有颈部淋巴结转移组织标本 90 例。纳入标准：①经病理学检查确诊为 PTC 的患者；② 所有入选患者在术前均未进行放化疗和其他治疗；③ 3 年随访资料完整。排除标准：伴随有其他恶性肿瘤的患者。160 例 PTC 患者中男 56 例，女 104 例；年龄 40～79 岁，中位年龄 48.8 岁。按照国际抗癌联盟 TNM 分期标准 2009 版[7]：Ⅰ+Ⅱ期患者 78 例，Ⅲ+Ⅳ期患者 82 例；肿瘤直径<1 cm 患者 70 例，≥1 cm 患者 90 例；组织学分级：高分化患者 52 例，中分化患者 64 例，低分化患者 44 例。所有组织标本均用 10% 中性甲醛固定，然后常规石蜡包埋，用于后续免疫组化法检测。本组 PTC 患者均以电话、门诊等方式进行了随访，随访截止时间为 2018 年 3 月 20 日，总生存时间（total survival time，OS）为从手术至随访结束或者死亡时间止。
1.2 主要抗体和试剂盒
兔抗人 NF-κBp65 多克隆抗体、兔抗人 Beclin1 单克隆抗体和 p62 单克隆抗体采购自北京奥维亚生物技术有限公司，链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptomyces anti-biotin protein-peroxidase，SP）试剂盒购自美国 Abcam 公司，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒采购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 免疫组织化学检测
取纳入研究的组织石蜡标本进行切片，片厚 4 μm，将切片放入水浴 40℃、4 min、进行展开，然后置于 60℃ 烘箱中进行烘片 30 min。采用二甲苯进行脱蜡 20 min，然后采用梯度乙醇进行水化，再加入 3% 双氧水，室温 10 min，从而阻断内源性过氧化物酶的活性；再对 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 蛋白进行高温高压组织修复，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）进行冲洗，加入 5% 羊血孵育 30 min，除去封闭液，加入一抗，置于 4℃ 冰箱过夜，PBS 代替一抗作为阴性对照，次日取出使用 PBS 冲洗，每张切片滴加二抗，室温下孵育 30 min，PBS 冲洗 5 次，每次 3 min，加入 DAB 显色水、使用 PBS 冲洗终止显色，使用水冲洗，盐酸乙醇分化，乙醇脱水干燥，于光学显微镜下进行观察。
1.4 NF-κBp65、Beclin1 和 p62 表达阳性判定标准
光学显微镜下观察制备好的切片，阳性表达为细胞内出现棕黄色颗粒。由两名病理科医师独立进行评估，每张切片随机选取 5 个高倍镜视野（×400）在光镜下观察，通过染色的强度和阳性细胞数 2 个总分评分判定是否阳性。染色强度计分：无着色计 0 分，淡黄色计 1 分，棕黄或棕褐色计 2 分；阳性细胞数计分：无阳性细胞计 0 分，< 25% 计 1 分，25%～50% 计 2 分，51%～75% 计 3 分，>75% 计 4 分。两者结果相乘>3 即为阳性，≤3 则为阴性[8]。
1.5 统计学方法
采用 SPSS16.0 统计学软件进行统计学分析。分类资料用百分比表示，采用 χ2 检验或 Fisher 检验进行分析；等级变量之间的相关性采用 Spearman 相关分析；采用 Graphpad prism 5 软件绘制生存曲线，生存分析应用 Kaplan-Meier 方法，Cox 回归比例风险模型分析预后影响因素。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 NF-κBp65、Beclin1 和 p62 在不 同组织中表达的检测结果
NF-κBp65、Beclin1 和 p62 在不同组织中表达的免疫组织化学染色结果见图 1。PTC 组织和转移淋巴结组织中 NF-κBp65 及 p62 表达阳性率均明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05），但 PTC 组织和转移淋巴结组织中 NF-κBp65 及 p62 表达阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）。PTC 组织和转移淋巴结组织中 Beclin1 表达阳性率明显低于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05），而 PTC 组织和转移淋巴结组织中 Beclin1 表达阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）。具体见表 1。
图1
示免疫组织化学法检测 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 在不同组织中的表达（IHC ×200）
a：NF-κBp65 在癌旁组织中阴性表达；b：NF-κBp65 在转移淋巴结组织中阳性表达；c：NF-κBp65 在 PTC 组织中阳性表达；d：Beclin1 在癌旁组织中阴性表达；e：Beclin1 在转移淋巴结组织中阳性表达；f：Beclin1 在 PTC 组织中阳性表达；g：p62 在癌旁组织中阴性表达；h：p62 在转移淋巴结组织中阳性表达；i：p62 在 PTC 组织中阳性表达
表1
NF-κBp65、Beclin1 及 p62 在不同组织中的表达结果［例（%）］
2.2 PTC 组织中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 表达与其临床病理特征的关系
结果见表 2。由表 2 可见：PTC 组织中 NF-κBp65 的表达与其临床病理特征均无关（P>0.05）。PTC 组织中 Beclin1 及 p62 在不同性别、年龄及肿瘤直径 PTC 患者中的表达阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。p62 在不同分化程度 PTC 患者中的表达情况比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中，p62 表达阳性率随肿瘤分化程度升高而降低。Beclin1 在不同肿瘤分化程度 PTC 患者中的表达情况比较，差异无统计学意义（P>0.05）；在Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴结转移者中其 Beclin1 表达阳性率分别低于Ⅰ+Ⅱ期和无淋巴转移者（P<0.05），而 p62 的表达则与之相反。
表2
PTC 组织中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 的表达与其临床病理特征的关系［例（%）］
2.3 NF-κBp65、Beclin1 和 p62 表达的相关性分析结果
Spearman 相关分析显示，PTC 组织中，Beclin1 和 p62 的表达呈负相关关系（r=–0.656，P<0.01），PTC 组织中 NF-κBp65 与 Beclin1 和 p62 的表达无明显相关性（r=0.042，r=0.116，P>0.05）；在转移淋巴结组织中，Beclin1 和 p62 的表达也呈负相关关系（r=–0.562，P<0.01），NF-κBp65 与 Beclin1 和 p62 的表达无明显相关性（r=0.071，r=0.136，P>0.05）。
2.4 PTC 组织中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 的 表达对预后的影响
160 例患者随访 3 年，死亡 44 例，3 年生存率为 72.50%（116/160）。PTC 组织中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 表达阳性及阴性者的生存曲线见图 2。PTC 组织中 p62 表达阳性者 3 年生存率为 65.52%（76/116），低于表达阴性者的 90.91%（40/44），差异有统计学意义（χ2=34.351，P=0.000）；NF-κBp65 及 Beclin1 表达阳性患者的 3 年生存率分别为 67.69%（88/130）和 94.12%（32/34），与 NF-κBp65 及 Beclin1 表达阴性患者的 93.33%（28/30）、66.67%（84/126）比较，明显降低或增高，差异均具有统计学意义（χ2=8.038、χ2=10.120，P<0.05）。
图2
示 NF-κBp65（a）、Beclin1（b）及 p62（c）表达阳性/阴性患者的生存曲线
2.5 PTC 患者预后影 响因素的 COX 比例风险模型分析结果
单因素分析结果（表 3）显示 TNM 分期、淋巴结转移是 PTC 预后的影响因素。以患者预后的生存情况为因变量，采用 COX 比例风险回归模型分析 PTC 患者 TNM 分期、淋巴结转移、NF-κBp65、Beclin1 及 p62 的表达对其预后的影响，结果显示：TNM 分期、淋巴结转移、NF-κBp65 及 Beclin1 为 PTC 预后的独立危险因素，Beclin1 为保护因素（表 4）。
表3
PTC 患者预后影响因素的单因素分析
表4
PTC 患者预后影响因素的 Cox 比例风险模型分析结果
3 讨论
PTC 是甲状腺恶性肿瘤中最为常见的类型，多发于中青年女性，且容易较早发生淋巴结转移，对患者生命安全造成严重威胁。研究[9]表明，有多个癌基因及抑癌基因参与了 PTC 的发生发展，深入探讨相关蛋白的表达有利于进一步明确肿瘤的发病机制，同时可提高临床分子诊断的准确性，有助于改善患者预后[10]。
细胞死亡根据形态学表型不同分为Ⅰ、Ⅱ 和 Ⅲ 3 种类型，分别指凋亡、自噬性细胞死亡和细胞坏死[11]。自噬广泛存在于细胞的生理活动中，正常细胞通过自噬可以清除胞内废物，维持细胞内环境及基因组的稳定，同时也是一种细胞对抗营养缺乏、电离辐射等不良环境的防御机制，在抑制炎症或肿瘤的生长过程中也起到重要的作用[12]。然而有研究[13]表明，自噬活性受到损伤后对于细胞病变和肿瘤的进展起到促进作用。微环境决定了自噬在肿瘤发展中的作用，在肿瘤细胞中自噬相关蛋白会出现异常表达，自噬相关蛋白的表达成为研究肿瘤发生及抑制肿瘤发展的热点。
Beclin1 称之为 BECN1 基因，位于人类染色体 17q21，定位于高尔基体，能够参与自噬体和 PI3K 复合物的形成。文献[14]报道称 Beclin1 参与多种肿瘤的发生和发展，其中在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌组织中因 Beclin1 基因突变而蛋白表达量降低。本研究发现，PTC 组织及转移的淋巴结组织中 Beclin1 的表达阳性率低于癌旁组织，提示 Beclin1 可能参与 PTC 的发生、发展。TNM 分期和淋巴结转移是评估 PTC 恶性程度的重要指标，本研究结果显示，Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴结转移者中其 Beclin1 表达阳性率分别低于Ⅰ+Ⅱ期和无淋巴转移者（P<0.05），提示 Beclin1 低表达和 PTC 的生物学行为存在关系。通过进一步生存分析显示：Beclin1 表达阳性和阴性患者其 3 年生存率也存在明显差异，COX 比例风险模型结果显示 Beclin1 是 PTC 患者预后的保护因素，提示 Beclin1 的表达和 PTC 患者预后存在一定关系，但只检测 Beclin1 不能很好地反映预后情况。
p62 是一种自噬底物连接蛋白，具有多个结构域，可结合泛素化修饰的待降解蛋白，并将其运输到自噬泡中降解[15]。细胞质中的 p62 在正常细胞自噬过程中不断被降解，而自噬功能出现缺陷或失活后，会导致 p62 蛋白在细胞质中累积，所以 p62 可以作为反映细胞自噬活性的标志性蛋白[16]。有研究[17]表明，p62 浓度增加会促进活性氧的累积，进而导致细胞内质网发生应激反应和 DNA 损伤。此外，NF-κB 信号通路及下游基因的表达也会受到 p62 积累的影响而导致促肿瘤炎症反应上调。自噬通过降低细胞内 p62 的水平是抑制肿瘤形成的机制之一[18]。Beclin1 是在哺乳动物中第一个被发现的调节自噬抑癌基因，而 p62 可使 Beclin1 和 Bcl-2 分离，释放出 Beclin1 而促进自噬活性[19]。本研究发现，PTC 组织及转移的淋巴结组织中 p62 的表达阳性率高于癌旁组织，提示 p62 可能参与了 PTC 的发生和发展；进一步分析显示，PTC 组织中 p62 的表达阳性率随着 TNM 分期和分化程度的降低而增加，有淋巴结转移患者 p62 表达阳性率亦增加明显，提示 p62 高表达能够间接反映 PTC 恶性生物学行为。相关性分析结果显示，PTC 组织及转移淋巴结组织中 p62 的表达与 Beclin1 表达呈负相关关系，随访结果显示 p62 表达阳性患者的 3 年生存率明显低于表达阴性患者，COX 分析结果显示 p62 高表达可作为评估 PTC 预后的独立危险因素。
NF-κBp65 是由原癌基因表达，其能够使 Beclin1 磷酸化而抑制自噬活性，NF-κBp65 还可根据其具有的激酶非依赖活性促进细胞存活[8,20-21]。研究[22-24]表明，NF-κBp65 在多种实体瘤中均呈高表达状态。本研究结果与之类似，在 PTC 组织和转移淋巴结组织中 NF-κBp65 表达阳性率高于癌旁组织，提示 NF-κBp65 与 PTC 的发生发展关系密切；进一步结果显示 NF-κBp65 表达与 PTC 患者临床病理特征均不存在相关性，但 NF-κBp65 表达阳性者的 3 年生存率低于表达阴性者，其差异具有统计学意义，这可能与纳入的临床样本量较少有关。本研究发现，NF-κBp65 表达与自噬相关蛋白 Beclin1 和 p62 的表达无相关性，可能是由于自噬的调节与 NF-κBp65 磷酸化水平有关，而总 NF-κBp65 蛋白表达水平不能反映磷酸化程度，因而呈现与自噬相关性不显著。但本研究发现 NF-κBp65 也可作为 PTC 患者预后的独立预测因素。
综上所述，NF-κBp65 和 p62 蛋白在 PTC 组织及其淋巴结转移组织中呈高表达，而 Beclin1 呈低表达，三者可作为 PTC 患者预后的独立预测因素；此外，Beclin1 及 p62 与 PTC 生物学行为有关，可能成为 PTC 诊断的潜在指标。
重要声明
利益冲突声明：无任何利益冲突。
作者贡献声明：鹿彬和张鹏：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；张启文：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；张延涛：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改。
伦理声明：本研究通过了济南市人民医院伦理委员会的审批。
