引用本文： 钱昌林, 沈志勇, 张捷, 邱伟箐, 刘骅. 胆固醇结石差异lncRNA表达基因的分析及其功能研究. 中国普外基础与临床杂志, 2019, 26(6): 654-661. doi: 10.7507/1007-9424.201902072 复制
胆结石是普外科最常见的疾病之一，在西方国家成年人中发病率达 5%～25%[1]。在我国，随着经济的发展和生活方式的西式化，其发病率也有逐年上升的趋势。研究[2]显示，当前上海地区人群总体胆石病患病率为 7.02%，胆囊切除率为 2.48%。虽然胆结石患者中有 75% 为无症状者，但一旦出现症状或者并发症，就会严重影响居民的健康和生活质量，同时带来了沉重的经济和医疗卫生资源负担[3]。胆结石形成的危险因素有很多，包括年龄、女性、种族及致石基因因素，同时代谢综合征、饮食因素、胆囊功能的缺陷及药物的因素对其形成也起到了重要作用。有关胆结石的最终形成原因主要包含以下几个方面：致石相关基因，包括 LITH 基因等；肝脏胆固醇过多分泌；过饱和胆囊胆汁的形成；胆囊收缩功能的受损；小肠吸收功能的影响[4]。目前，关于长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）调控胆固醇结石的相关研究少见报道。本研究通过建立小鼠成石模型，给予或不给予熊脱氧胆酸药物治疗，分析小鼠肝脏组织中的差异表达 lncRNA 基因，并通过生物信息学方法初步探讨差异基因的生物学功能。
1 材料与方法
1.1 实验动物、主要材料和设备
实验动物：C57BL/6 雄性（购自北京维通利华实验动物公司）小鼠 24 只，饲养动物房为 SPF 级，体质量 20～22 g，10 周龄。主要材料：总胆固醇（T-CHO）测试盒、总胆红素（TBIL）检测试剂盒（化学氧化法）及总胆汁酸（TBA）测试盒均购于南京建成生物工程研究所，NEBNext® UltraRNA 文库制备试剂盒（New England Biolabs 公司），TRIzol® Plus RNA 纯化试剂盒、SuperScriptTM Ⅲ第一链合成 SuperMix、TRIzol 试剂盒以及 Qubit 2.0 Fluorometer（Invitrogen 公司），RNase-Free DNase Set 和 RNeasy Mini Kit（Qiagen 公司），Power SYBR® Green PCR Master Mix（美国应用生物系统公司），AxyPrep Mag PCR Clean-up（Axygen 公司），Ribo-ZeroTM rRNA removal Kit（Mouse）、TruSeq PE Cluster Kit V4 试剂盒及 TruSeq SBS Kit V4-HS 试剂盒（Illumina 公司）。主要设备：3K-15 高速冷冻离心机（Sigma 公司），DU-640 紫外分光光度计（Beckman 公司），TU-10 恒温金属浴（上海一恒公司），CFX384 多重实时荧光定量 PCR 仪（美国 Bio-Rad 公司），Agilent 2100 生物分析仪和 Agilent2100 系统（美国 Agilent 科技有限公司），Multiskan Sky 全波长酶标仪和 NanoDrop（赛默飞世尔科技公司）。
1.2 动物建模及分组
小鼠适应性饲养 1 周后，开始分组造模。采用随机数字表法将小鼠随机分组为 2 组：胆固醇结石组 16 只，饲喂致石饲料 [致石饲料配方：基础饲料+15.0%脂肪（猪油）+1.0%胆固醇+0.5%胆酸钠]，连续饲养时间为 5 周；空白对照组 8 只，饲喂常规饲料（胆固醇含量 0.02%）。致石饲料和常规饲料均购于江苏协同医药生物工程公司。16 只胆固醇结石小鼠采用随机数字表法随机分成 2 组：熊去氧胆酸组及模型对照组（每组 8 只）。熊去氧胆酸组小鼠予以熊去氧胆酸胶囊灌胃给药，浓度为10 mg/（kg·d），连续给药 2 周时间。模型对照组和空白对照组小鼠分别给予致石饮食及常规饲料饮食。熊去氧胆酸组给药结束后，采用颈椎脱臼法处死 3 组小鼠。见胆固醇结石小鼠胆囊比空白对照组偏大，胆汁浑浊，颜色较暗，肉眼可见结石形成。对 3 组小鼠的胆囊进行拍照，取全部肝脏组织及胆囊胆汁，–80 ℃ 保存。
1.3 胆汁脂质分析
胆囊胆汁的胆固醇含量采用 T-CHO 测试盒检测，直接胆红素（DBIL）及 TBIL 含量测定采用 TBIL 检测试剂盒（化学氧化法），胆囊中胆汁酸测定采用 TBA 测试盒。测定胆固醇含量时，先将胆汁离心 10 min（1 000 r/min，r=6 cm），取上清测定，在空白孔、校准孔及样本孔中分别置入蒸馏水 2.5 μL、校准品 2.5 μL 及样本 2.5 μL，再加入工作液 250 μL。混匀，37 ℃ 孵育 10 min，以酶标仪（波长 510 nm）测定各孔吸光度（A）值。T-CHO 含量（mmol/L）=（样本孔A值–空白孔A值）/（校准孔A值–空白孔A值）×5.17（mmol/L）。测定 TBA 含量时，在标准孔内加入校准品 3 μL、试剂一 200 μL 及试剂二 200 μL；测定孔内加入样品 3 μL、试剂一 200 μL 及试剂二 200 μL。混匀，37 ℃ 孵育 1.5 min 后，以酶标仪（波长 405 nm）测定各孔A值，读取 0、30、60、90 及 120 s 的A值，计算 ΔA/min [（A120 s–A0 s）/2]。TBA 含量（μmol/L）=ΔA测定孔/ΔA标准孔×40（μmol/L）。测定胆红素含量时，于空白孔内加入双蒸水 8 μL，试剂一 240 μL；测定孔内加入样品8 μL，试剂一 240 μL。分别混匀，37 ℃ 孵育 3～5 min，以酶标仪（波长 450 nm）测定 A 值（A0 值）。分别加入试剂二 60 μL，混匀，37 ℃ 孵育5 min 后，再以酶标仪（波长 450 nm）测定 A 值（A1值）。ΔA=A0–A1。TBIL 的计算公式为：TBIL 浓度（μmol/L）=887.211×（ΔA测定孔–ΔA空白孔）+0.549 2；DBIL 的计算公式为：DBIL（μmol/L）=922.12×（ΔA测定孔–ΔA空白孔）–0.839 5。
1.4 lncRNA 表达谱测定
对上述 3 组小鼠肝脏组织分别进行 RNA 提取、RNA 样品质量检测、文库构建、文库纯化、文库检测、文库定量、测序簇的生成以及上机测序，严格质控每一步实验过程，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求混样后进行 Illumina HiSeq 测序。RNA 质量检测采用 Agilent2100 系统，核糖体 RNA 去除采用 Ribo-ZeroTM rRNA removal Kit（Mouse）试剂盒，文库构建采用 NEBNext® UltraTM Directional RNA Library Prep Kit for Illumina®，文库纯化采用 AxyPrep Mag PCR Clean-up，文库检测采用 Agilent2100 系统，文库定量采用 Qubit 2.0 Fluorometer。Cbot 簇生成仪采用 TruSeq PE Cluster Kit V4 试剂盒，Hiseq（高通量测序）测序采用 TruSeq SBS Kit V4-HS 试剂盒。操作均按试剂盒说明书进行。对检测的结果按照差异显著性标准（差异基因表达变化 2 倍以上且P≤0.05）进行筛选，统计基因的差异表达情况，之后对 lncRNA 差异表达基因进行聚类分析。
1.5 生物信息学分析
对获取的差异 lncRNA 基因进行 Cis-/Trans-靶基因的基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）Pathway 分析。GO 分析首先把所有差异表达基因向 Gene Ontology 数据库的各个 term 映射，计算每个 term 的基因数目，然后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著富集的 GO 条目。KEGG Pathway 显著性富集分析以 KEGG Pathway 为单位，应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著性富集的 Pathway，以分析差异表达的 lncRNA 参与的细胞功能和信号通路，进一步推测 lncRNA 可能发挥的生物学作用。
1.6 统计学方法
统计学分析采用 GraphPad Prism 7.0 软件，聚类分析采用 DAVID 分析软件。计量资料以均数±标准差（
±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA），两两比较采用 Tukey’s 检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 3 组小鼠的胆囊胆汁外观及脂质分析结果
本组 16 只胆结石模型均制备成功。饲养 7 周后，空白对照组小鼠胆囊的胆汁透明，呈黄色；模型对照组小鼠给予 7 周致石饮食后，胆囊比空白对照组偏大，且胆汁浑浊，颜色较暗；熊去氧胆酸组小鼠经 2 周熊去氧胆酸给药处理后，胆囊有明显变化，大小与空白对照组接近，胆汁呈透明黄色，提示熊去氧胆酸对小鼠胆固醇结石起到治疗效果。
胆囊胆汁脂质分析结果提示，模型对照组、熊脱氧胆酸组及空白对照组胆囊胆汁的 T-CHO 含量的差异有统计学意义（P<0.05），模型对照组较空白对照组和熊脱氧胆酸组明显升高（P<0.05），但熊脱氧胆酸组与空白对照组比较差异无统计学意义（P=0.59），提示熊脱氧胆酸治疗后效果明显；而3 组的胆囊胆汁 TBA、TBIL 及 DBIL 含量比较差异均无统计学意义（P>0.05），具体见图 1a–1e。胆囊胆汁脂质分析结果提示，T-CHO 含量变化在胆结石形成中起重要作用。
图1
示 3 组小鼠的胆囊胆汁外观及胆汁脂质分析结果
a：3 组小鼠的胆囊胆汁外观；b：3 组小鼠的 T-CHO 含量结果；c：3 组小鼠的 TBA 含量结果；d：3 组小鼠的 TBIL 含量结果；e：3 组小鼠的 DBIL 含量结果；与空白对照组比较，*
2.2 3 组小鼠肝脏组织的 lncRNA 差异表达谱
相比空白对照组，模型对照组的肝脏组织中有 76 种 lncRNA 表达上调，88 种 lncRNA 表达下调。与空白对照组相比，熊脱氧胆酸组肝脏组织中有 261 种 lncRNA 表达上调，315 种 lncRNA 表达下调。同时对 lncRNA 差异表达基因进行聚类分析，以 log10（FPKM+1）值进行聚类，FPKM 为每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片。聚类分析是对数据进行相似度计算，并根据相似度将数据进行分类，从而将具有相同功能或密切联系的基因聚集成类，识别未知基因的功能或已知基因的未知功能，推断是否共同参与同一代谢过程或细胞通路，其中红色表示高表达基因，蓝色表示低表达基因，聚类分析结果见图 2a。颜色从蓝到红，表示基因表达量越高。另外，本研究对模型对照组及熊脱氧胆酸组的差异 lncRNA 基因构建维恩图，见图 2b。结果提示，有 49 种共同差异 lncRNA 表达基因，其具体名称见表 1。
图2
示差异 lncRNA 表达基因的聚类分析结果、差异 lncRNA 表达基因的维恩图、GO 富集柱状图及 KEGG 富集散点图
a：差异 lncRNA 表达基因的聚类分析结果；b：模型对照组及熊脱氧胆酸组差异 lncRNA 表达基因的维恩图；c：空白对照组与模型对照组 lncRNA 的 GO 富集柱状图；d：空白对照组与熊去氧胆酸组 lncRNA 的 GO 富集柱状图；e：空白对照组与模型对照组 lncRNA 的 KEGG 富集散点图；f：空白对照组与熊去氧胆酸组 lncRNA 的 KEGG 富集散点图；UDCA 代表熊去氧胆酸，NC 表示空白对照，Model 表示模型对照
表1
模型对照组及熊脱氧胆酸组共同的差异 lncRNA 表达基因
2.3 差异表达 lncRNA 靶基因的 GO 富集柱状图
构建差异表达 lncRNA 靶基因的 GO 富集柱状图，以反映在生物过程（biological process）、细胞组分（cellular component）和分子功能（molecular function）富集 GO term 上的差异基因分布，结果见图 2c 和图 2d，图中选择了富集最显著的 GO term 进行展示。其中纵坐标为富集的 GO term，横坐标为该 term 中的差异基因个数。不同颜色用来区分生物过程、细胞组分和分子功能。将差异基因进行 GO 分析后发现，模型对照组与空白对照组的差异基因富集得到 88 个 GO term，其中分子功能富集差异基因最多的 term 有结合（binding）、催化活性（catalytic activity）和酶调节活性（enzyme regulator activity）。细胞组分富集差异基因最多的 term 有细胞组分（cell part）、细胞器（organelle）和膜（membrane）。生物过程富集差异基因最多的 term 有生物调节（biological regulation）、单一生物过程（single-organism process）和细胞过程（cellular process）。熊去氧胆酸组与空白对照组的差异基因富集得到 205 个 GO term，其中分子功能富集差异基因最多的 term 有结合、催化活性和分子传感器活动（molecular transducer activity）。细胞组分富集差异基因最多的 term 有细胞组分、细胞器和膜。生物过程富集差异基因最多的 term 有生物调节、细胞过程和单一生物过程。
空白对照组与模型对照组相比，GO term 富集最显著的有低密度脂蛋白、乳糜微粒、极低密度脂蛋白颗粒、富含甘油三酯的脂蛋白颗粒、血浆脂蛋白颗粒、蛋白质脂肪酰化、脂蛋白运输等。空白对照组与熊去氧胆酸组相比，GO term 富集最显著的有磷脂酰肌醇结合、蛋白激酶活化剂活性、激酶活化剂活性、皮质肌动蛋白细胞骨架组织、蛋白磷酸酶 4 复合物等。
2.4 差异表达 lncRNA 靶基因的 KEGG 富集散点图
构建差异表达 lncRNA 靶基因的 KEGG 富集散点图，KEGG 富集程度通过 rich factor、Q值和富集到此通路上的基因个数来衡量。rich factor 越大，提示富集的程度越大。Q值越接近于零，提示富集越显著。图 2e 和图 2f 显示了富集最显著的 pathway条目，其中纵轴表示 pathway 名称，横轴表示 rich factor，点的大小表示此 pathway 中差异表达基因的个数多少，而点的颜色对应于不同的Q值。将差异基因进行 KEGG pathway 分析后发现，模型对照组与空白对照组的差异基因富集得到 18 条 pathway，熊去氧胆酸组与空白对照组的差异基因富集得到 20 条 pathway。通过 KEGG 分析发现，结石相关较密切的通路包括蛋白质输出、甘油脂类代谢、甘油磷脂代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、糖尿病、胆汁分泌、初级胆汁酸生物合成、视黄醇代谢等通路。
空白对照组与模型对照组相比差异基因 KEGG pathway 分析显示的富集程度最显著的生物学通路包括蛋白质输出、甘油脂类代谢、甘油磷脂代谢、减数分裂-酵母、肾素-血管紧张素系统、赖氨酸降解、不饱和脂肪酸的生物合成、药物代谢-其他酶、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、范可尼贫血途径、昼夜节律、青少年发病的成年型糖尿病、RNA 降解、甲状腺癌、硫辛酸代谢、胆汁分泌、初级胆汁酸生物合成及过氧物酶体。空白对照组与模型对照组相比，差异基因 KEGG pathway 分析显示的富集程度最显著的生物学通路包括肌醇磷酸代谢、卵母细胞减数分裂、黑素瘤、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路、肥厚型心肌病（HCM）、RNA 降解、自噬调节、紧密连接、青少年发病的成年型糖尿病、内质网中的蛋白质加工、p53 信号通路、侧索硬化（ALS）、扩张型心肌病、卵巢类固醇生成、长期抑郁症、视黄醇代谢、胶质瘤、半乳糖代谢、醛固酮调节的钠重吸收及赖氨酸降解。
3 讨论
目前认为，胆囊过饱和胆汁的形成是胆囊结石发生发展的先决条件，胆汁脂质代谢异常致胆汁中胆固醇溶解度的理化性质失衡，形成过饱和的胆囊胆汁[5-6]，胆固醇从过饱和胆汁中析出并形成胆固醇单水结晶，进而形成胆囊胆固醇结石[7]。胆汁胆固醇的溶解形式主要是“微胶团”和“胆汁泡”，两者在胆汁中处于一个动态平衡的状态，微胶粒中的胆固醇不直接以结晶析出，而是将胆固醇转移到胆汁泡中再结晶析出胆固醇。胆汁脂质代谢异常影响到胆固醇、磷脂及胆汁酸的比例，致使过饱和胆汁的形成。陈敏等[8]探讨了血浆 Apo B 基因 rs676210 和 rs2854725 位点多态性与胆囊结石之间的关系，结果提示，rs676210 和 rs2854725 位点的基因多态性与胆囊结石无关；但无胆囊结石即健康对照者 rs2854725 位点的基因多态性在维吾尔族和汉族间可能存在差异，可能与结石形成相关。有研究[9]提示，成纤维细胞生长因子受体 4（FGFR4）可通过调控胆固醇 7α-羟化酶（CYP7A1）影响胆汁酸的代谢平衡，同时 FGFR4 基因 Gly388Arg（G-388R）的多态性可抑制胆汁酸的合成，可能是胆结石形成的基因影响因素。另有研究[10]表明，miRNA-122a 和 miRNA-422a 直接抑制 CYP7A1 基因，参与胆汁酸的调控。多配体 B 类清道夫受体 CD36 可促进游离脂肪酸的摄取，也可调节肝脏和小肠胆固醇的代谢[11]。研究[12]显示，CD36 基因敲除可降低胆汁胆固醇的分泌和改变胆汁酸池的亲水性倾向，增加胆囊的收缩功能，从而达到修饰小鼠结石易感性的目的，可预防胆结石的形成。Asai 等[13]的研究表明，在脂肪肝小鼠中，低氧条件下诱导缺氧诱导因子 1a（HIF1A）的上调可降低水通道蛋白 8（AQP8）的表达水平，并增加了胆汁脂质的集聚，增加了胆结石的形成。Yang 等[14]研究了胆结石人群的 miRNA 及 mRNA 表达，鉴定出了 17 种 miRNAs 及 525 种 mRNA 差异基因，同时在人胆囊上皮细胞中发现，miRNA-210 可下调三磷酸腺苷酶 11A（ATP11A）的表达。
lncRNA 是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA，lncRNA 可通过与 DNA/RNA 结合或与蛋白结合而行使其功能。一些 lncRNA 实际上是某些调控 RNA（如 miRNA 或 piwi RNA）的前体。与 miRNA 不同的是，lncRNA 没有一种普遍的作用模式，它以许多不同的方式来调控基因表达和蛋白合成[15]。目前研究[16-20]显示，lncRNA 对脂质代谢及其他疾病都有重要的调控作用，但其与胆固醇结石的相关性研究仍较少。研究[21]显示，Lnc-HC 可以在转录后水平通过结合 hnRNPA2B1，而调控 CYP7A1 和 Abca11 基因的表达。在高血脂及动脉粥样硬化患者中鉴定出的 lncRNA CHROME 可以调节细胞内及循环系统的胆固醇代谢，在肝细胞中敲除 CHROME 基因后发现，miR-27b、miR-33a、miR-33b 和 miR-128 的表达均上调[22]。
在本实验中，笔者成功建立了 C57BL/6 小鼠胆固醇结石模型及熊去氧胆酸给药模型，并分析了各组小数胆囊胆汁中的脂质含量，结果显示：空白对照组小鼠胆囊的胆汁透明，呈黄色，而模型对照组组小鼠的胆囊比空白对照组偏大，且胆汁浑浊，颜色较暗。熊去氧胆酸组小鼠经 2 周熊去氧胆酸给药处理后，胆囊有明显变化，大小恢复正常表现且胆汁呈透明黄色，提示熊去氧胆酸对胆固醇结石小鼠起到较明显的治疗效果。模型对照组、熊脱氧胆酸组及空白对照组胆囊胆汁的 T-CHO 含量比较差异有统计学意义（P<0.05），模型对照组较空白对照组和熊去氧胆酸组高，而熊去氧胆酸组与空白对照组无明显差异，提示熊去氧胆酸治疗后效果明显；3 组小鼠的胆囊胆汁 TBA、TBIL 及 DBIL 含量比较差异均无统计学意义。这些结果提示，胆固醇含量变化在胆结石形成中起重要作用。
此外，本研究分析了 3 组小鼠肝脏组织的差异表达 lncRNA，并进行了生物学信息分析，包括 GO 分析和 KEGG pathway 分析。结果表明，空白对照组与模型对照组相比，GO term 富集最显著的有低密度脂蛋白、乳糜微粒、极低密度脂蛋白颗粒、富含甘油三酯的脂蛋白颗粒、血浆脂蛋白颗粒、蛋白质脂肪酰化、脂蛋白运输等，差异基因 KEGG pathway 分析显示的富集程度最显著的生物学通路包括蛋白质输出、甘油脂类代谢、甘油磷脂代谢、减数分裂-酵母、肾素-血管紧张素系统、赖氨酸降解、不饱和脂肪酸的生物合成、药物代谢-其他酶、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、范可尼贫血途径、昼夜节律、青少年发病的成年型糖尿病、RNA 降解、甲状腺癌、硫辛酸代谢、胆汁分泌、初级胆汁酸生物合成及过氧物酶体。空白对照组与熊去氧胆酸组相比，GO term 富集最显著的有磷脂酰肌醇结合、蛋白激酶活化剂活性、激酶活化剂活性、皮质肌动蛋白细胞骨架组织、蛋白磷酸酶 4 复合物等，差异基因 KEGG pathway 分析显示的富集程度最显著的生物学通路包括肌醇磷酸代谢、卵母细胞减数分裂、黑素瘤、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路、肥厚型心肌病（HCM）、RNA 降解、自噬调节、紧密连接、青少年发病的成年型糖尿病、内质网中的蛋白质加工、p53 信号通路、侧索硬化（ALS）、扩张型心肌病、卵巢类固醇生成、长期抑郁症、视黄醇代谢、胶质瘤、半乳糖代谢、醛固酮调节的钠重吸收及赖氨酸降解。通过 KEGG pathway 分析，结合既往研究及文献检索，笔者总结，结石相关较密切的通路包括甘油代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、糖尿病、胆汁分泌、初级胆汁酸生物合成、视黄醇代谢等通路[23-26]，但差异 lncRNA 通过上述通路参与调节结石形成的具体机制有待于进一步探讨及验证。
本实验成功构建了小鼠成石及熊去氧胆酸治疗模型，筛选出了 lncRNA 调控的差异表达基因及通路，对胆固醇结石发生及其机制研究有重要作用，熊脱氧胆酸组的 lncRNA 差异表达基因为其在预防结石形中的分子机制研究提供了理论依据，但其具体机制有待于进一步深入研究。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：钱昌林（第一作者）直接参与设计实验、实施研究、采集数据、分析数据、文章撰写等；沈志勇、张捷及邱伟箐参与实验设计、数据采集等；刘骅（通信作者）直接参与设计实验、实施研究、分析数据、对文章内容作批评性审阅等。
伦理审批声明：本研究通过了上海交通大学医学院附属仁济医院的伦理审批 ［审批文号：仁济科伦审（2015）W029 号］；实验动物使用许可证 ［SYXX（沪）2015-0011］。
胆结石是普外科最常见的疾病之一，在西方国家成年人中发病率达 5%～25%[1]。在我国，随着经济的发展和生活方式的西式化，其发病率也有逐年上升的趋势。研究[2]显示，当前上海地区人群总体胆石病患病率为 7.02%，胆囊切除率为 2.48%。虽然胆结石患者中有 75% 为无症状者，但一旦出现症状或者并发症，就会严重影响居民的健康和生活质量，同时带来了沉重的经济和医疗卫生资源负担[3]。胆结石形成的危险因素有很多，包括年龄、女性、种族及致石基因因素，同时代谢综合征、饮食因素、胆囊功能的缺陷及药物的因素对其形成也起到了重要作用。有关胆结石的最终形成原因主要包含以下几个方面：致石相关基因，包括 LITH 基因等；肝脏胆固醇过多分泌；过饱和胆囊胆汁的形成；胆囊收缩功能的受损；小肠吸收功能的影响[4]。目前，关于长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）调控胆固醇结石的相关研究少见报道。本研究通过建立小鼠成石模型，给予或不给予熊脱氧胆酸药物治疗，分析小鼠肝脏组织中的差异表达 lncRNA 基因，并通过生物信息学方法初步探讨差异基因的生物学功能。
1 材料与方法
1.1 实验动物、主要材料和设备
实验动物：C57BL/6 雄性（购自北京维通利华实验动物公司）小鼠 24 只，饲养动物房为 SPF 级，体质量 20～22 g，10 周龄。主要材料：总胆固醇（T-CHO）测试盒、总胆红素（TBIL）检测试剂盒（化学氧化法）及总胆汁酸（TBA）测试盒均购于南京建成生物工程研究所，NEBNext® UltraRNA 文库制备试剂盒（New England Biolabs 公司），TRIzol® Plus RNA 纯化试剂盒、SuperScriptTM Ⅲ第一链合成 SuperMix、TRIzol 试剂盒以及 Qubit 2.0 Fluorometer（Invitrogen 公司），RNase-Free DNase Set 和 RNeasy Mini Kit（Qiagen 公司），Power SYBR® Green PCR Master Mix（美国应用生物系统公司），AxyPrep Mag PCR Clean-up（Axygen 公司），Ribo-ZeroTM rRNA removal Kit（Mouse）、TruSeq PE Cluster Kit V4 试剂盒及 TruSeq SBS Kit V4-HS 试剂盒（Illumina 公司）。主要设备：3K-15 高速冷冻离心机（Sigma 公司），DU-640 紫外分光光度计（Beckman 公司），TU-10 恒温金属浴（上海一恒公司），CFX384 多重实时荧光定量 PCR 仪（美国 Bio-Rad 公司），Agilent 2100 生物分析仪和 Agilent2100 系统（美国 Agilent 科技有限公司），Multiskan Sky 全波长酶标仪和 NanoDrop（赛默飞世尔科技公司）。
1.2 动物建模及分组
小鼠适应性饲养 1 周后，开始分组造模。采用随机数字表法将小鼠随机分组为 2 组：胆固醇结石组 16 只，饲喂致石饲料 [致石饲料配方：基础饲料+15.0%脂肪（猪油）+1.0%胆固醇+0.5%胆酸钠]，连续饲养时间为 5 周；空白对照组 8 只，饲喂常规饲料（胆固醇含量 0.02%）。致石饲料和常规饲料均购于江苏协同医药生物工程公司。16 只胆固醇结石小鼠采用随机数字表法随机分成 2 组：熊去氧胆酸组及模型对照组（每组 8 只）。熊去氧胆酸组小鼠予以熊去氧胆酸胶囊灌胃给药，浓度为10 mg/（kg·d），连续给药 2 周时间。模型对照组和空白对照组小鼠分别给予致石饮食及常规饲料饮食。熊去氧胆酸组给药结束后，采用颈椎脱臼法处死 3 组小鼠。见胆固醇结石小鼠胆囊比空白对照组偏大，胆汁浑浊，颜色较暗，肉眼可见结石形成。对 3 组小鼠的胆囊进行拍照，取全部肝脏组织及胆囊胆汁，–80 ℃ 保存。
1.3 胆汁脂质分析
胆囊胆汁的胆固醇含量采用 T-CHO 测试盒检测，直接胆红素（DBIL）及 TBIL 含量测定采用 TBIL 检测试剂盒（化学氧化法），胆囊中胆汁酸测定采用 TBA 测试盒。测定胆固醇含量时，先将胆汁离心 10 min（1 000 r/min，r=6 cm），取上清测定，在空白孔、校准孔及样本孔中分别置入蒸馏水 2.5 μL、校准品 2.5 μL 及样本 2.5 μL，再加入工作液 250 μL。混匀，37 ℃ 孵育 10 min，以酶标仪（波长 510 nm）测定各孔吸光度（A）值。T-CHO 含量（mmol/L）=（样本孔A值–空白孔A值）/（校准孔A值–空白孔A值）×5.17（mmol/L）。测定 TBA 含量时，在标准孔内加入校准品 3 μL、试剂一 200 μL 及试剂二 200 μL；测定孔内加入样品 3 μL、试剂一 200 μL 及试剂二 200 μL。混匀，37 ℃ 孵育 1.5 min 后，以酶标仪（波长 405 nm）测定各孔A值，读取 0、30、60、90 及 120 s 的A值，计算 ΔA/min [（A120 s–A0 s）/2]。TBA 含量（μmol/L）=ΔA测定孔/ΔA标准孔×40（μmol/L）。测定胆红素含量时，于空白孔内加入双蒸水 8 μL，试剂一 240 μL；测定孔内加入样品8 μL，试剂一 240 μL。分别混匀，37 ℃ 孵育 3～5 min，以酶标仪（波长 450 nm）测定 A 值（A0 值）。分别加入试剂二 60 μL，混匀，37 ℃ 孵育5 min 后，再以酶标仪（波长 450 nm）测定 A 值（A1值）。ΔA=A0–A1。TBIL 的计算公式为：TBIL 浓度（μmol/L）=887.211×（ΔA测定孔–ΔA空白孔）+0.549 2；DBIL 的计算公式为：DBIL（μmol/L）=922.12×（ΔA测定孔–ΔA空白孔）–0.839 5。
1.4 lncRNA 表达谱测定
对上述 3 组小鼠肝脏组织分别进行 RNA 提取、RNA 样品质量检测、文库构建、文库纯化、文库检测、文库定量、测序簇的生成以及上机测序，严格质控每一步实验过程，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求混样后进行 Illumina HiSeq 测序。RNA 质量检测采用 Agilent2100 系统，核糖体 RNA 去除采用 Ribo-ZeroTM rRNA removal Kit（Mouse）试剂盒，文库构建采用 NEBNext® UltraTM Directional RNA Library Prep Kit for Illumina®，文库纯化采用 AxyPrep Mag PCR Clean-up，文库检测采用 Agilent2100 系统，文库定量采用 Qubit 2.0 Fluorometer。Cbot 簇生成仪采用 TruSeq PE Cluster Kit V4 试剂盒，Hiseq（高通量测序）测序采用 TruSeq SBS Kit V4-HS 试剂盒。操作均按试剂盒说明书进行。对检测的结果按照差异显著性标准（差异基因表达变化 2 倍以上且P≤0.05）进行筛选，统计基因的差异表达情况，之后对 lncRNA 差异表达基因进行聚类分析。
1.5 生物信息学分析
对获取的差异 lncRNA 基因进行 Cis-/Trans-靶基因的基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）Pathway 分析。GO 分析首先把所有差异表达基因向 Gene Ontology 数据库的各个 term 映射，计算每个 term 的基因数目，然后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著富集的 GO 条目。KEGG Pathway 显著性富集分析以 KEGG Pathway 为单位，应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著性富集的 Pathway，以分析差异表达的 lncRNA 参与的细胞功能和信号通路，进一步推测 lncRNA 可能发挥的生物学作用。
1.6 统计学方法
统计学分析采用 GraphPad Prism 7.0 软件，聚类分析采用 DAVID 分析软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA），两两比较采用 Tukey’s 检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 3 组小鼠的胆囊胆汁外观及脂质分析结果
本组 16 只胆结石模型均制备成功。饲养 7 周后，空白对照组小鼠胆囊的胆汁透明，呈黄色；模型对照组小鼠给予 7 周致石饮食后，胆囊比空白对照组偏大，且胆汁浑浊，颜色较暗；熊去氧胆酸组小鼠经 2 周熊去氧胆酸给药处理后，胆囊有明显变化，大小与空白对照组接近，胆汁呈透明黄色，提示熊去氧胆酸对小鼠胆固醇结石起到治疗效果。
胆囊胆汁脂质分析结果提示，模型对照组、熊脱氧胆酸组及空白对照组胆囊胆汁的 T-CHO 含量的差异有统计学意义（P<0.05），模型对照组较空白对照组和熊脱氧胆酸组明显升高（P<0.05），但熊脱氧胆酸组与空白对照组比较差异无统计学意义（P=0.59），提示熊脱氧胆酸治疗后效果明显；而3 组的胆囊胆汁 TBA、TBIL 及 DBIL 含量比较差异均无统计学意义（P>0.05），具体见图 1a–1e。胆囊胆汁脂质分析结果提示，T-CHO 含量变化在胆结石形成中起重要作用。
图1
示 3 组小鼠的胆囊胆汁外观及胆汁脂质分析结果
a：3 组小鼠的胆囊胆汁外观；b：3 组小鼠的 T-CHO 含量结果；c：3 组小鼠的 TBA 含量结果；d：3 组小鼠的 TBIL 含量结果；e：3 组小鼠的 DBIL 含量结果；与空白对照组比较，*
2.2 3 组小鼠肝脏组织的 lncRNA 差异表达谱
相比空白对照组，模型对照组的肝脏组织中有 76 种 lncRNA 表达上调，88 种 lncRNA 表达下调。与空白对照组相比，熊脱氧胆酸组肝脏组织中有 261 种 lncRNA 表达上调，315 种 lncRNA 表达下调。同时对 lncRNA 差异表达基因进行聚类分析，以 log10（FPKM+1）值进行聚类，FPKM 为每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片。聚类分析是对数据进行相似度计算，并根据相似度将数据进行分类，从而将具有相同功能或密切联系的基因聚集成类，识别未知基因的功能或已知基因的未知功能，推断是否共同参与同一代谢过程或细胞通路，其中红色表示高表达基因，蓝色表示低表达基因，聚类分析结果见图 2a。颜色从蓝到红，表示基因表达量越高。另外，本研究对模型对照组及熊脱氧胆酸组的差异 lncRNA 基因构建维恩图，见图 2b。结果提示，有 49 种共同差异 lncRNA 表达基因，其具体名称见表 1。
图2
示差异 lncRNA 表达基因的聚类分析结果、差异 lncRNA 表达基因的维恩图、GO 富集柱状图及 KEGG 富集散点图
a：差异 lncRNA 表达基因的聚类分析结果；b：模型对照组及熊脱氧胆酸组差异 lncRNA 表达基因的维恩图；c：空白对照组与模型对照组 lncRNA 的 GO 富集柱状图；d：空白对照组与熊去氧胆酸组 lncRNA 的 GO 富集柱状图；e：空白对照组与模型对照组 lncRNA 的 KEGG 富集散点图；f：空白对照组与熊去氧胆酸组 lncRNA 的 KEGG 富集散点图；UDCA 代表熊去氧胆酸，NC 表示空白对照，Model 表示模型对照
表1
模型对照组及熊脱氧胆酸组共同的差异 lncRNA 表达基因
2.3 差异表达 lncRNA 靶基因的 GO 富集柱状图
构建差异表达 lncRNA 靶基因的 GO 富集柱状图，以反映在生物过程（biological process）、细胞组分（cellular component）和分子功能（molecular function）富集 GO term 上的差异基因分布，结果见图 2c 和图 2d，图中选择了富集最显著的 GO term 进行展示。其中纵坐标为富集的 GO term，横坐标为该 term 中的差异基因个数。不同颜色用来区分生物过程、细胞组分和分子功能。将差异基因进行 GO 分析后发现，模型对照组与空白对照组的差异基因富集得到 88 个 GO term，其中分子功能富集差异基因最多的 term 有结合（binding）、催化活性（catalytic activity）和酶调节活性（enzyme regulator activity）。细胞组分富集差异基因最多的 term 有细胞组分（cell part）、细胞器（organelle）和膜（membrane）。生物过程富集差异基因最多的 term 有生物调节（biological regulation）、单一生物过程（single-organism process）和细胞过程（cellular process）。熊去氧胆酸组与空白对照组的差异基因富集得到 205 个 GO term，其中分子功能富集差异基因最多的 term 有结合、催化活性和分子传感器活动（molecular transducer activity）。细胞组分富集差异基因最多的 term 有细胞组分、细胞器和膜。生物过程富集差异基因最多的 term 有生物调节、细胞过程和单一生物过程。
空白对照组与模型对照组相比，GO term 富集最显著的有低密度脂蛋白、乳糜微粒、极低密度脂蛋白颗粒、富含甘油三酯的脂蛋白颗粒、血浆脂蛋白颗粒、蛋白质脂肪酰化、脂蛋白运输等。空白对照组与熊去氧胆酸组相比，GO term 富集最显著的有磷脂酰肌醇结合、蛋白激酶活化剂活性、激酶活化剂活性、皮质肌动蛋白细胞骨架组织、蛋白磷酸酶 4 复合物等。
2.4 差异表达 lncRNA 靶基因的 KEGG 富集散点图
构建差异表达 lncRNA 靶基因的 KEGG 富集散点图，KEGG 富集程度通过 rich factor、Q值和富集到此通路上的基因个数来衡量。rich factor 越大，提示富集的程度越大。Q值越接近于零，提示富集越显著。图 2e 和图 2f 显示了富集最显著的 pathway条目，其中纵轴表示 pathway 名称，横轴表示 rich factor，点的大小表示此 pathway 中差异表达基因的个数多少，而点的颜色对应于不同的Q值。将差异基因进行 KEGG pathway 分析后发现，模型对照组与空白对照组的差异基因富集得到 18 条 pathway，熊去氧胆酸组与空白对照组的差异基因富集得到 20 条 pathway。通过 KEGG 分析发现，结石相关较密切的通路包括蛋白质输出、甘油脂类代谢、甘油磷脂代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、糖尿病、胆汁分泌、初级胆汁酸生物合成、视黄醇代谢等通路。
空白对照组与模型对照组相比差异基因 KEGG pathway 分析显示的富集程度最显著的生物学通路包括蛋白质输出、甘油脂类代谢、甘油磷脂代谢、减数分裂-酵母、肾素-血管紧张素系统、赖氨酸降解、不饱和脂肪酸的生物合成、药物代谢-其他酶、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、范可尼贫血途径、昼夜节律、青少年发病的成年型糖尿病、RNA 降解、甲状腺癌、硫辛酸代谢、胆汁分泌、初级胆汁酸生物合成及过氧物酶体。空白对照组与模型对照组相比，差异基因 KEGG pathway 分析显示的富集程度最显著的生物学通路包括肌醇磷酸代谢、卵母细胞减数分裂、黑素瘤、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路、肥厚型心肌病（HCM）、RNA 降解、自噬调节、紧密连接、青少年发病的成年型糖尿病、内质网中的蛋白质加工、p53 信号通路、侧索硬化（ALS）、扩张型心肌病、卵巢类固醇生成、长期抑郁症、视黄醇代谢、胶质瘤、半乳糖代谢、醛固酮调节的钠重吸收及赖氨酸降解。
3 讨论
目前认为，胆囊过饱和胆汁的形成是胆囊结石发生发展的先决条件，胆汁脂质代谢异常致胆汁中胆固醇溶解度的理化性质失衡，形成过饱和的胆囊胆汁[5-6]，胆固醇从过饱和胆汁中析出并形成胆固醇单水结晶，进而形成胆囊胆固醇结石[7]。胆汁胆固醇的溶解形式主要是“微胶团”和“胆汁泡”，两者在胆汁中处于一个动态平衡的状态，微胶粒中的胆固醇不直接以结晶析出，而是将胆固醇转移到胆汁泡中再结晶析出胆固醇。胆汁脂质代谢异常影响到胆固醇、磷脂及胆汁酸的比例，致使过饱和胆汁的形成。陈敏等[8]探讨了血浆 Apo B 基因 rs676210 和 rs2854725 位点多态性与胆囊结石之间的关系，结果提示，rs676210 和 rs2854725 位点的基因多态性与胆囊结石无关；但无胆囊结石即健康对照者 rs2854725 位点的基因多态性在维吾尔族和汉族间可能存在差异，可能与结石形成相关。有研究[9]提示，成纤维细胞生长因子受体 4（FGFR4）可通过调控胆固醇 7α-羟化酶（CYP7A1）影响胆汁酸的代谢平衡，同时 FGFR4 基因 Gly388Arg（G-388R）的多态性可抑制胆汁酸的合成，可能是胆结石形成的基因影响因素。另有研究[10]表明，miRNA-122a 和 miRNA-422a 直接抑制 CYP7A1 基因，参与胆汁酸的调控。多配体 B 类清道夫受体 CD36 可促进游离脂肪酸的摄取，也可调节肝脏和小肠胆固醇的代谢[11]。研究[12]显示，CD36 基因敲除可降低胆汁胆固醇的分泌和改变胆汁酸池的亲水性倾向，增加胆囊的收缩功能，从而达到修饰小鼠结石易感性的目的，可预防胆结石的形成。Asai 等[13]的研究表明，在脂肪肝小鼠中，低氧条件下诱导缺氧诱导因子 1a（HIF1A）的上调可降低水通道蛋白 8（AQP8）的表达水平，并增加了胆汁脂质的集聚，增加了胆结石的形成。Yang 等[14]研究了胆结石人群的 miRNA 及 mRNA 表达，鉴定出了 17 种 miRNAs 及 525 种 mRNA 差异基因，同时在人胆囊上皮细胞中发现，miRNA-210 可下调三磷酸腺苷酶 11A（ATP11A）的表达。
lncRNA 是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA，lncRNA 可通过与 DNA/RNA 结合或与蛋白结合而行使其功能。一些 lncRNA 实际上是某些调控 RNA（如 miRNA 或 piwi RNA）的前体。与 miRNA 不同的是，lncRNA 没有一种普遍的作用模式，它以许多不同的方式来调控基因表达和蛋白合成[15]。目前研究[16-20]显示，lncRNA 对脂质代谢及其他疾病都有重要的调控作用，但其与胆固醇结石的相关性研究仍较少。研究[21]显示，Lnc-HC 可以在转录后水平通过结合 hnRNPA2B1，而调控 CYP7A1 和 Abca11 基因的表达。在高血脂及动脉粥样硬化患者中鉴定出的 lncRNA CHROME 可以调节细胞内及循环系统的胆固醇代谢，在肝细胞中敲除 CHROME 基因后发现，miR-27b、miR-33a、miR-33b 和 miR-128 的表达均上调[22]。
在本实验中，笔者成功建立了 C57BL/6 小鼠胆固醇结石模型及熊去氧胆酸给药模型，并分析了各组小数胆囊胆汁中的脂质含量，结果显示：空白对照组小鼠胆囊的胆汁透明，呈黄色，而模型对照组组小鼠的胆囊比空白对照组偏大，且胆汁浑浊，颜色较暗。熊去氧胆酸组小鼠经 2 周熊去氧胆酸给药处理后，胆囊有明显变化，大小恢复正常表现且胆汁呈透明黄色，提示熊去氧胆酸对胆固醇结石小鼠起到较明显的治疗效果。模型对照组、熊脱氧胆酸组及空白对照组胆囊胆汁的 T-CHO 含量比较差异有统计学意义（P<0.05），模型对照组较空白对照组和熊去氧胆酸组高，而熊去氧胆酸组与空白对照组无明显差异，提示熊去氧胆酸治疗后效果明显；3 组小鼠的胆囊胆汁 TBA、TBIL 及 DBIL 含量比较差异均无统计学意义。这些结果提示，胆固醇含量变化在胆结石形成中起重要作用。
此外，本研究分析了 3 组小鼠肝脏组织的差异表达 lncRNA，并进行了生物学信息分析，包括 GO 分析和 KEGG pathway 分析。结果表明，空白对照组与模型对照组相比，GO term 富集最显著的有低密度脂蛋白、乳糜微粒、极低密度脂蛋白颗粒、富含甘油三酯的脂蛋白颗粒、血浆脂蛋白颗粒、蛋白质脂肪酰化、脂蛋白运输等，差异基因 KEGG pathway 分析显示的富集程度最显著的生物学通路包括蛋白质输出、甘油脂类代谢、甘油磷脂代谢、减数分裂-酵母、肾素-血管紧张素系统、赖氨酸降解、不饱和脂肪酸的生物合成、药物代谢-其他酶、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、范可尼贫血途径、昼夜节律、青少年发病的成年型糖尿病、RNA 降解、甲状腺癌、硫辛酸代谢、胆汁分泌、初级胆汁酸生物合成及过氧物酶体。空白对照组与熊去氧胆酸组相比，GO term 富集最显著的有磷脂酰肌醇结合、蛋白激酶活化剂活性、激酶活化剂活性、皮质肌动蛋白细胞骨架组织、蛋白磷酸酶 4 复合物等，差异基因 KEGG pathway 分析显示的富集程度最显著的生物学通路包括肌醇磷酸代谢、卵母细胞减数分裂、黑素瘤、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路、肥厚型心肌病（HCM）、RNA 降解、自噬调节、紧密连接、青少年发病的成年型糖尿病、内质网中的蛋白质加工、p53 信号通路、侧索硬化（ALS）、扩张型心肌病、卵巢类固醇生成、长期抑郁症、视黄醇代谢、胶质瘤、半乳糖代谢、醛固酮调节的钠重吸收及赖氨酸降解。通过 KEGG pathway 分析，结合既往研究及文献检索，笔者总结，结石相关较密切的通路包括甘油代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、糖尿病、胆汁分泌、初级胆汁酸生物合成、视黄醇代谢等通路[23-26]，但差异 lncRNA 通过上述通路参与调节结石形成的具体机制有待于进一步探讨及验证。
本实验成功构建了小鼠成石及熊去氧胆酸治疗模型，筛选出了 lncRNA 调控的差异表达基因及通路，对胆固醇结石发生及其机制研究有重要作用，熊脱氧胆酸组的 lncRNA 差异表达基因为其在预防结石形中的分子机制研究提供了理论依据，但其具体机制有待于进一步深入研究。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：钱昌林（第一作者）直接参与设计实验、实施研究、采集数据、分析数据、文章撰写等；沈志勇、张捷及邱伟箐参与实验设计、数据采集等；刘骅（通信作者）直接参与设计实验、实施研究、分析数据、对文章内容作批评性审阅等。
伦理审批声明：本研究通过了上海交通大学医学院附属仁济医院的伦理审批 ［审批文号：仁济科伦审（2015）W029 号］；实验动物使用许可证 ［SYXX（沪）2015-0011］。
