引用本文： 吉九威, 赵海平, 胡文秀. 雷帕霉素对重症急性胰腺炎胰腺损害的保护性作用. 中国普外基础与临床杂志, 2019, 26(4): 405-411. doi: 10.7507/1007-9424.201812024 复制
重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是临床中较为危重的急腹症之一，以发病急、进展快和病死率高为特点，死亡率高达 10%～25%[1]。SAP 的病理改变主要表现为胰腺组织广泛性出血坏死[2]，大多数 SAP 是由急性水肿性胰腺炎发展而来[3]，治疗方面主要是积极治疗原发病、禁食水、抑制胰酶、抗感染、补液、纠正水电解质紊乱、防治并发症及止痛对症支持治疗，充分让胰腺休息[4-5]；当胰腺大面积坏死继发感染时，需要外科手术治疗[6-8]。相关研究已经证实，在 SAP 中多种信号通路被激活，如 p38 分裂原激活的蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK）、核因子 kB（nuclear factor kB，NF-kB）等信号通路，但关于雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路与 SAP 关系的报道并不多见。mTOR 信号通路在维持蛋白合成、细胞存活、生长、凋亡、调节炎症反应等方面发挥重要作用[9]。mTOR 是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是多种信号通路的枢纽，通过对信号的整合从而对细胞的生长、周期及营养代谢进行调节。在哺乳动物中，mTOR 以 mTORC1-mTORC2 复合物的形式存在，激活的 mTORC1-mTORC2 复合物可使信号通路下游的核糖体 S6 激酶（S6K1）磷酸化，进而发挥其生理作用。相关研究[10]已经证实，mTORC1 具有雷帕霉素敏感性的特点，可被雷帕霉素抑制。此外，mTOR 抑制剂可以调节炎症反应，缓解系统性红斑狼疮症状，对骨性关节炎也具有保护作用[11-12]。SAP 以无菌性炎症为主要病理改变，随着疾病的进展和加重，可以继发细菌感染，严重者可以并发全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），最终可发展为多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），预后极差。mTOR 信号通路作为调节炎症反应的重要信号通路之一，是否参与了 SAP 的发生发展、其抑制剂雷帕霉素是否对 SAP 患者的胰腺损害具有保护作用等，目前还不清楚。本实验通过动物实验，研究雷帕霉素对 SAP 胰腺损害的保护性作用，并进一步阐述其保护机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物、材料和设备
清洁级雄性 SD 大鼠 90 只，雄性，280～320 g，7～8 周龄（购自辽宁长生生物技术股份有限公司）。动物手术器械和动物手术操作台系上海玉研科学仪器有限公司产品，TDL-5 台式大容量低速离心机系上海安亭科学仪器厂产品，显微止血夹购自宁波医用缝针有限公司，可吸收性外科缝线购自上海浦东金环医疗用品股份有限公司，pH 试纸购自上海馨晟试化工科技有限公司，采血管、载玻片、盖玻片及 1/5 mL 注射器均系山东威高集团医用高分子制品股份有限公司产品。5% 牛磺胆酸钠购自北京索莱宝科技有限公司；水合氯醛、亚甲蓝注射液和 0.9% 生理盐水均系四川科伦药业有限责任公司产品；雷帕霉素，HE 染色及 Western blot 相关试剂，IL-1β、IL-6 及 TNF-α ELISA 检测试剂盒等均购自美国 Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组
90 只 SD 大鼠购回后适应性喂养 1 周，随后按照拆信封法随机分配成 3 组：假手术组（SO 组）、SAP 组和雷帕霉素组（RAPA 组），每组 30 只大鼠；每组大鼠再按照随机数字表随机分为 24、36 和 48 h 亚组，每个亚组 10 只大鼠。
1.2.2 SD 大鼠 SAP 模型的制备
参照相关 SAP 大鼠模型制备法建模[13-16]，具体步骤如下（图 1）。手术器械消毒，操作过程严格无菌，实验大鼠术前 12 h 禁食、不禁水。采用 10% 水合氯醛腹腔注射麻醉（3.3 mL/kg），待麻醉满意后将大鼠固定于手术台，腹部术区备皮，75% 乙醇消毒，铺无菌洞巾，取上腹正中切口长约 3 cm 入腹；显露十二指肠，将十二指肠顺时针翻转，暴露胰腺背侧，手术灯光照向胰腺背侧，从胰腺腹侧辨认胆管系统及十二指肠乳头，显微止血夹暂时阻闭肝门部胆管；用棉签钝性分离胰头，暴露胰胆管-十二指肠肠汇合部，于乳头开口处十二指肠对系膜缘肠壁无血管区作为穿刺点，用直径 0.3 mm 穿刺针头与肠管壁成 10° 角刺入十二指肠壁内，调整穿刺针方向平行于胰胆管，经乳头部插入胰胆管内约 5 mm（此处一般无主胰管）；以显微止血夹封闭胰胆管十二指肠开口端，穿刺针连接 1 mL 注射器，由专人以 0.3 mL/min 的速度匀速向胰胆管内注射 5% 牛磺胆酸钠（2 mL/kg）与亚甲蓝的（0.1 mL）混合液，注射完毕后 5 min，去除肝门部胆管及乳头处显微止血夹，以 8-0 可吸线“8”字缝合肠壁穿刺口；用 5 mL 注射器抽取温盐水冲洗穿刺口及乳头部位，5 min 后用 pH 试纸蘸取穿刺口周围肠壁及乳头部组织液，与标准卡比色，判断是否出现肠瘘或胆汁漏（比色后呈现碱性，则认为出现肠瘘或胆汁漏）；用干纱布擦净腹腔内冲洗液及渗液，查无活动性出血后逐层关腹，术毕背部皮下注射 5 mL 生理盐水补液。大鼠苏醒后禁食，可饮水，分组饲养。以上所有操作均由同一名术者完成。
图1
示 SAP 建模操作
a：顺时针翻转胰腺，充分暴露胆胰管（黑箭）；b：以显微止血夹暂时夹闭肝门部胆管（黑箭）；c：注射药液后胆胰管及分支胰管清晰可见（黑箭）
1.2.3 建模大鼠的选择
纳入标准：① 穿刺过程中无肉眼可见的胰胆管穿透性损伤；② 无胰腺及其被膜损伤；③ 无胰腺及穿刺部位的活动性出血；④ 穿刺口及十二指肠乳头周围无胆汁漏或肠瘘；⑤ 操作过程中无其他器官组织的副损伤；⑥ 大鼠在处死的各时间点仍然存活。对符合以上全部条件的大鼠纳入本研究。排除标准：① 穿刺过程中有肉眼可见的胰胆管穿透性损伤；② 穿刺十二指肠后针头脱出或反复穿刺；③ 有胰腺及其被膜损伤；④ 有胰腺及穿刺部位活动性出血且按压止血后仍有出血；⑤ 穿刺口及十二指肠乳头周围有胆汁漏或肠瘘；⑥ 操作过程中有其他器官组织的副损伤；⑦ 在处死的各时间点大鼠已经死亡。对符合以上任何 1 条的大鼠均不纳入研究范围。本实验 SAP 组和 RAPA 组大鼠均建模成功。
1.2.4 3 组大鼠的处理
SO 组 SD 大鼠（共 30 只，24、36 和 48 h 3 个亚组各 10 只）的操作方法均与 SAP 组相同，只是将注射的药物替换为 0.9% 生理盐水（2 mL/kg）与亚甲蓝的（0.1 mL）混合液；RAPA 组 SD 大鼠（共 30 只，24、36 和 48 h 3 个亚组各 10 只）的操作方法和注射药物均与 SAP 组相同，只是在手术麻醉前 30 min 经腹腔注射雷帕霉素（1 mg/kg）。
1.2.5 胰腺组织中磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）和磷酸化的核糖体 S6 蛋白激酶 1（p-S6K1）的表达量检测
SAP 组、SO 组及 RAPA 组中的各时段亚组大鼠分别于术后 24、36 及 48 h 腹腔注射 10% 的水合氯醛溶液（3.3 mL/kg），麻醉满意后开胸，直视下行右心房穿刺采血并放血处死相应亚组存活的全部大鼠。各组大鼠放血处死后立即完整切取相应胰腺组织，分为两部分，一部分用 10% 中性甲醛溶液固定 48 h 以上，待行组织染色；另一部分放置于–80 ℃ 超低温冰箱冷冻保存，采用 Western blot 法检测胰腺组织中 p-mTOR 和p-S6K1 的表达量（操作按试剂盒说明书进行）。
1.2.6 血清标本的采集及炎症因子的检测
按上述方法行右心房穿刺采血并放血处死大鼠后，血液标本离心（2 500 r/min，r=12 cm，15 min）后移液器抽取上层血清置于 EP 管中，采用 ELISA 方法检测血清 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的含量，操作根据试剂盒说明书进行。
1.2.7 胰腺组织的 HE 染色
将以 10% 中性甲醛溶液固定好的胰腺组织（胰头部）行 HE 染色，将组织块修整成统一大小，脱水透明，石蜡包埋，置于切片机上，以厚度 4 μm 的标准连续性切片，每个蜡块切片 5 张，取其中之一作常规 HE 染色。
1.2.8 胰腺组织光镜下病理评分
取各时间点存活大鼠的胰腺标本，行 HE 染色后，采用盲法由专科医师在光镜下阅片，每张切片随机选择 10 个高倍视野（200 倍），观察胰腺组织的病理变化，参照 Schmidt 等[17]的光镜下评分法进行评分（表 1）。
表1
胰腺病变光镜下评分标准
1.3 统计学方法
采用 SPSS 22.0 统计软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（
±s）表示。多个样本均数比较时，经方差齐性检验后，若满足方差齐性，使用方差分析，两两比较采用 LSD-t 检验；若方差不齐，则采用 t′ 检验；关系的分析采用线性相关性分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
SO 组各时间点亚组的大鼠均存活，总体存活率为 100%；SAP 组中，24 h 亚组大鼠存活 8 只，36 h 亚组大鼠存活 6 只，48 h 亚组大鼠存活 4 只，总体存活率为 60%；RAPA 组中，24 h 亚组大鼠存活 9 只，36 h 亚组大鼠存活 8 只，48 h 亚组大鼠存活 7 只，总体存活率为 80%。
2.1 胰腺组织中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达量
2.1.1 胰腺组织中 p-mTOR 的表达量
在 24、36 及 48 h 时点，SO 组、SAP 组和 RAPA 组大鼠胰腺组织中的 p-mTOR 表达量顺序均为：SO 组<RAPA 组<SAP 组，3 组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。SO 组内的 3 个时间点亚组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）；在 SAP 组和 RAPA 组，均是 24 h<36 h<48 h，同组内的 3 个时间点间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。具体见图 2a和图 2b。
图2
示胰腺组织中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达
a：胰腺组织中 p-mTOR 表达的电泳图片；b：3 组胰腺组织中 p-mTOR 的表达水平；c：胰腺组织中 p-S6K1 表达的电泳图片；d：3 组胰腺组织中 p-S6K1 的表达水平；同时点与 SO 组比较，*
2.1.2 胰腺组织中 p-S6K1 的表达量
在 24、36 及 48 h 时点，SO 组、SAP 组和 RAPA 组大鼠胰腺组织中的 p-S6K1 表达量顺序均为：SO 组<RAPA 组<SAP 组，3 组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。SO 组内的 3 个时间点亚组比较差异无统计学意义（P>0.05）；在 SAP 组和 RAPA 组，均是 24 h<36 h<48 h，同组内的 3 个时间点间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。具体见图 2c和图 2d。
2.2 血清炎症因子含量
2.2.1 血清 IL-1β 含量
SO 组中，随着时间的延长，血清 IL-1β 含量总体呈下降趋势；SAP 组中，随着时间的延长，血清 IL-1β 含量总体呈上升趋势；RAPA 组中，随着时间的延长，血清 IL-1β 含量大致呈下降趋势。在 24 h 亚组中，SO 组、RAPA 组及 SAP 组大鼠的血清 IL-1β 含量比较差异无统计学意义（P>0.05）；在 36 h 亚组中，3 组大鼠的血清 IL-1β 含量顺序为：RAPA 组<SAP 组<SO 组，3 组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；在 48 h 亚组中，3 组大鼠的血清 IL-1β 含量顺序为：SO 组<RAPA 组<SAP 组，3 组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。具体见图 3a。
图3
示 3 组大鼠各时点的血清 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 含量、胰腺组织的病理学检查结果以及胰腺组织中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达水平与胰腺组织病理评分的关系的散点图
a：3 组大鼠各时点血清 IL-1β 含量；b：3 组大鼠各时点血清 IL-6 含量；c：3 组大鼠各时点血清 TNF-α 含量；同时点与 SO 组比较，*
2.2.2 血清 IL-6 含量
SO 组中，随着时间的延长，血清 IL-6 含量总体呈下降趋势；SAP 组中，随着时间的延长，血清 IL-6 含量总体呈上升趋势；RAPA 组中，随着时间的延长，血清 IL-6 含量总体呈下降趋势。在 24 h 亚组中，3 组的血清 IL-6 含量顺序依次为：SO 组/SAP 组<RAPA 组，RAPA 组与另 2 组比较差异均有统计学意义（P<0.05），而 SO 组与 SAP 组比较差异无统计学意义（P>0.05）；在 36 h 和 48 h 亚组中，3 组的血清 IL-6 含量顺序依次为：SO 组<RAPA 组<SAP 组，3 组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05），具体见图 3b。
2.2.3 血清 TNF-α 含量
SO 组中，随着时间的延长，血清 TNF-α 含量总体呈下降趋势；SAP 组中，随着时间的延长，血清 TNF-α 含量总体呈上升趋势；RAPA 组中，随着时间的延长，血清 TNF-α 含量总体呈下降趋势。在 24 h 亚组中， SO 组、SAP 组及 RAPA 组的血清 TNF-α 含量比较差异无统计学意义（P>0.05）；在 36 h 亚组中，3 组的血清 TNF-α 含量顺序依次为：SO 组<RAPA 组<SAP 组，3 组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；在 48 h 亚组中，血清 TNF-α 含量为 SO/RAPA 组<SAP 组，SAP 组与其余 2 组比较差异均有统计学意义（P<0.05），而 SO 组与 RAPA 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。具体见图 3c。
2.3 胰腺组织的病理学改变及其病理评分
同时点与 SO 组比较，SAP 组和 RAPA 组的胰腺组织的病理学损伤较重，RAPA 组损伤较 SAP 组轻；同组内随时间延长，SO 组的病理学改变不大，但 SAP 组和 RAPA 组有加重趋势，具体见 3d–3j。SO 组、SAP 组及 RAPA 组内 3 个时间点的病理学评分依次为：SO 组，48 h 组<36 h 组<24 h 组，3 个时点间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；SAP 组：24 h 组<36 h 组<48 h 组，3 个时点间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；RAPA 组，24 h 组<36 h 组<48 h 组，3 个时点间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。24 h、36 h 及 48 h 时，同时点下 3 组胰腺组织的病理学评分依次为：SO组<RAPA 组<SAP 组，3 组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。具体见表 2。
表2
3 组大鼠胰腺组织的病理学评分（分，
）
2.4 胰腺组织中 p-mTOR、p-S6K1 的表达水平与胰腺组织病理评分的相关性
胰腺组织中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达水平与胰腺组织的病理学评分均呈正相关（r=0.97，P<0.01；r=0.89，P<0.01），见图 3k 和图 3l（根据3 组大鼠 3 个时点结果的均值绘制）。
3 讨论
SAP 是临床常见的急腹症之一，该病发病快，呈恶性发展趋势，治疗极为复杂，晚期阶段同时合并 SIRS，引起广泛的器官组织损伤，最终发展为多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[18-20]。约有 25% 的急性胰腺炎可发展为 SAP[21]。mTOR 是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸激酶，存在于 2 个不同的复合体中，第 1 个为 mTORC1，由 mTOR、Raptor、GβL 和 DEPTOR 构成，它是一主要的生长调节分子，可感受并结合不同的营养因素和环境因素，包括生长因子、能量水平、细胞应激及氨基酸，可被雷帕霉素抑制，而激活的 mTOR 可使下游 S6K1 磷酸化而发挥其生理作用[22-24]。第 2 种复合体是 mTORC2，由 mTOR、Rictor、GβL、Sin1、PRR5/Protor-1 和 DEPTOR 构成。有研究[25-29]证实，mTOR 信号转导异常见于多种疾病如癌症、心血管疾病和糖尿病。
本研究结果显示，各时点 3 组胰腺组织中的 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达水平顺序均为 SO 组<RAPA 组<SAP 组，且在 SAP 组和 RAPA 组中，随时间延长，胰腺组织中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达水平升高。而 mTOR 和 S6K1 作为 mTOR 信号通路中下游的关键蛋白分子，其磷酸化水平反映了该通路的激活情况，这提示在 SAP 时，mTOR 信号通路被广泛激活。本实验结果显示，SAP 组血清 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 含量随时间延长总体升高，而 RAPA 组随时间延长呈下降趋势，36 和 48 h 时，RAPA 组和 SAP 组的上述 3 项指标总体高于 SO 组，且 RAPA 组的 3 项指标均低于 SAP 组，该结果一方面提示在 SAP 时，炎症因子 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 大量释放入血，参与 SAP 的发生；另一方面提示雷帕霉素可能通过抑制 mTOR 信号通路减少炎症因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的合成及释放。此外，24、36 和 48 h 时，SAP 组胰腺组织的病理评分都显著高于 SO 组相应时点，而 RAPA 组胰腺组织的病理评分却介于 SO 组和 SAP 组相应亚组之间。经相关性分析，胰腺组织中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达水平与胰腺组织的损害程度呈线性正相关关系，且二者的相关系数r均大于 0.8，故可以认为，在 SAP 时，胰腺组织中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达水平与胰腺组织损害程度具有较高的相关性。
综上所述，在 SAP 中，炎症因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 被大量释放入血，参与 SAP 的发病过程；mTOR 信号通路被广泛激活，且胰腺组织中p-mTOR 和 p-S6K1 的表达水平与胰腺组织的损害程度呈线性正相关关系；雷帕霉素可减轻 SAP 中胰腺组织损害程度，其机制可能为下调胰腺组织中p-mTOR 和 p-S6K1 的表达，或者减少炎症介质IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的合成及释放，进而减轻胰腺损伤。
重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是临床中较为危重的急腹症之一，以发病急、进展快和病死率高为特点，死亡率高达 10%～25%[1]。SAP 的病理改变主要表现为胰腺组织广泛性出血坏死[2]，大多数 SAP 是由急性水肿性胰腺炎发展而来[3]，治疗方面主要是积极治疗原发病、禁食水、抑制胰酶、抗感染、补液、纠正水电解质紊乱、防治并发症及止痛对症支持治疗，充分让胰腺休息[4-5]；当胰腺大面积坏死继发感染时，需要外科手术治疗[6-8]。相关研究已经证实，在 SAP 中多种信号通路被激活，如 p38 分裂原激活的蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK）、核因子 kB（nuclear factor kB，NF-kB）等信号通路，但关于雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路与 SAP 关系的报道并不多见。mTOR 信号通路在维持蛋白合成、细胞存活、生长、凋亡、调节炎症反应等方面发挥重要作用[9]。mTOR 是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是多种信号通路的枢纽，通过对信号的整合从而对细胞的生长、周期及营养代谢进行调节。在哺乳动物中，mTOR 以 mTORC1-mTORC2 复合物的形式存在，激活的 mTORC1-mTORC2 复合物可使信号通路下游的核糖体 S6 激酶（S6K1）磷酸化，进而发挥其生理作用。相关研究[10]已经证实，mTORC1 具有雷帕霉素敏感性的特点，可被雷帕霉素抑制。此外，mTOR 抑制剂可以调节炎症反应，缓解系统性红斑狼疮症状，对骨性关节炎也具有保护作用[11-12]。SAP 以无菌性炎症为主要病理改变，随着疾病的进展和加重，可以继发细菌感染，严重者可以并发全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），最终可发展为多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），预后极差。mTOR 信号通路作为调节炎症反应的重要信号通路之一，是否参与了 SAP 的发生发展、其抑制剂雷帕霉素是否对 SAP 患者的胰腺损害具有保护作用等，目前还不清楚。本实验通过动物实验，研究雷帕霉素对 SAP 胰腺损害的保护性作用，并进一步阐述其保护机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物、材料和设备
清洁级雄性 SD 大鼠 90 只，雄性，280～320 g，7～8 周龄（购自辽宁长生生物技术股份有限公司）。动物手术器械和动物手术操作台系上海玉研科学仪器有限公司产品，TDL-5 台式大容量低速离心机系上海安亭科学仪器厂产品，显微止血夹购自宁波医用缝针有限公司，可吸收性外科缝线购自上海浦东金环医疗用品股份有限公司，pH 试纸购自上海馨晟试化工科技有限公司，采血管、载玻片、盖玻片及 1/5 mL 注射器均系山东威高集团医用高分子制品股份有限公司产品。5% 牛磺胆酸钠购自北京索莱宝科技有限公司；水合氯醛、亚甲蓝注射液和 0.9% 生理盐水均系四川科伦药业有限责任公司产品；雷帕霉素，HE 染色及 Western blot 相关试剂，IL-1β、IL-6 及 TNF-α ELISA 检测试剂盒等均购自美国 Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组
90 只 SD 大鼠购回后适应性喂养 1 周，随后按照拆信封法随机分配成 3 组：假手术组（SO 组）、SAP 组和雷帕霉素组（RAPA 组），每组 30 只大鼠；每组大鼠再按照随机数字表随机分为 24、36 和 48 h 亚组，每个亚组 10 只大鼠。
1.2.2 SD 大鼠 SAP 模型的制备
参照相关 SAP 大鼠模型制备法建模[13-16]，具体步骤如下（图 1）。手术器械消毒，操作过程严格无菌，实验大鼠术前 12 h 禁食、不禁水。采用 10% 水合氯醛腹腔注射麻醉（3.3 mL/kg），待麻醉满意后将大鼠固定于手术台，腹部术区备皮，75% 乙醇消毒，铺无菌洞巾，取上腹正中切口长约 3 cm 入腹；显露十二指肠，将十二指肠顺时针翻转，暴露胰腺背侧，手术灯光照向胰腺背侧，从胰腺腹侧辨认胆管系统及十二指肠乳头，显微止血夹暂时阻闭肝门部胆管；用棉签钝性分离胰头，暴露胰胆管-十二指肠肠汇合部，于乳头开口处十二指肠对系膜缘肠壁无血管区作为穿刺点，用直径 0.3 mm 穿刺针头与肠管壁成 10° 角刺入十二指肠壁内，调整穿刺针方向平行于胰胆管，经乳头部插入胰胆管内约 5 mm（此处一般无主胰管）；以显微止血夹封闭胰胆管十二指肠开口端，穿刺针连接 1 mL 注射器，由专人以 0.3 mL/min 的速度匀速向胰胆管内注射 5% 牛磺胆酸钠（2 mL/kg）与亚甲蓝的（0.1 mL）混合液，注射完毕后 5 min，去除肝门部胆管及乳头处显微止血夹，以 8-0 可吸线“8”字缝合肠壁穿刺口；用 5 mL 注射器抽取温盐水冲洗穿刺口及乳头部位，5 min 后用 pH 试纸蘸取穿刺口周围肠壁及乳头部组织液，与标准卡比色，判断是否出现肠瘘或胆汁漏（比色后呈现碱性，则认为出现肠瘘或胆汁漏）；用干纱布擦净腹腔内冲洗液及渗液，查无活动性出血后逐层关腹，术毕背部皮下注射 5 mL 生理盐水补液。大鼠苏醒后禁食，可饮水，分组饲养。以上所有操作均由同一名术者完成。
图1
示 SAP 建模操作
a：顺时针翻转胰腺，充分暴露胆胰管（黑箭）；b：以显微止血夹暂时夹闭肝门部胆管（黑箭）；c：注射药液后胆胰管及分支胰管清晰可见（黑箭）
1.2.3 建模大鼠的选择
纳入标准：① 穿刺过程中无肉眼可见的胰胆管穿透性损伤；② 无胰腺及其被膜损伤；③ 无胰腺及穿刺部位的活动性出血；④ 穿刺口及十二指肠乳头周围无胆汁漏或肠瘘；⑤ 操作过程中无其他器官组织的副损伤；⑥ 大鼠在处死的各时间点仍然存活。对符合以上全部条件的大鼠纳入本研究。排除标准：① 穿刺过程中有肉眼可见的胰胆管穿透性损伤；② 穿刺十二指肠后针头脱出或反复穿刺；③ 有胰腺及其被膜损伤；④ 有胰腺及穿刺部位活动性出血且按压止血后仍有出血；⑤ 穿刺口及十二指肠乳头周围有胆汁漏或肠瘘；⑥ 操作过程中有其他器官组织的副损伤；⑦ 在处死的各时间点大鼠已经死亡。对符合以上任何 1 条的大鼠均不纳入研究范围。本实验 SAP 组和 RAPA 组大鼠均建模成功。
1.2.4 3 组大鼠的处理
SO 组 SD 大鼠（共 30 只，24、36 和 48 h 3 个亚组各 10 只）的操作方法均与 SAP 组相同，只是将注射的药物替换为 0.9% 生理盐水（2 mL/kg）与亚甲蓝的（0.1 mL）混合液；RAPA 组 SD 大鼠（共 30 只，24、36 和 48 h 3 个亚组各 10 只）的操作方法和注射药物均与 SAP 组相同，只是在手术麻醉前 30 min 经腹腔注射雷帕霉素（1 mg/kg）。
1.2.5 胰腺组织中磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）和磷酸化的核糖体 S6 蛋白激酶 1（p-S6K1）的表达量检测
SAP 组、SO 组及 RAPA 组中的各时段亚组大鼠分别于术后 24、36 及 48 h 腹腔注射 10% 的水合氯醛溶液（3.3 mL/kg），麻醉满意后开胸，直视下行右心房穿刺采血并放血处死相应亚组存活的全部大鼠。各组大鼠放血处死后立即完整切取相应胰腺组织，分为两部分，一部分用 10% 中性甲醛溶液固定 48 h 以上，待行组织染色；另一部分放置于–80 ℃ 超低温冰箱冷冻保存，采用 Western blot 法检测胰腺组织中 p-mTOR 和p-S6K1 的表达量（操作按试剂盒说明书进行）。
1.2.6 血清标本的采集及炎症因子的检测
按上述方法行右心房穿刺采血并放血处死大鼠后，血液标本离心（2 500 r/min，r=12 cm，15 min）后移液器抽取上层血清置于 EP 管中，采用 ELISA 方法检测血清 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的含量，操作根据试剂盒说明书进行。
1.2.7 胰腺组织的 HE 染色
将以 10% 中性甲醛溶液固定好的胰腺组织（胰头部）行 HE 染色，将组织块修整成统一大小，脱水透明，石蜡包埋，置于切片机上，以厚度 4 μm 的标准连续性切片，每个蜡块切片 5 张，取其中之一作常规 HE 染色。
1.2.8 胰腺组织光镜下病理评分
取各时间点存活大鼠的胰腺标本，行 HE 染色后，采用盲法由专科医师在光镜下阅片，每张切片随机选择 10 个高倍视野（200 倍），观察胰腺组织的病理变化，参照 Schmidt 等[17]的光镜下评分法进行评分（表 1）。
表1
胰腺病变光镜下评分标准
1.3 统计学方法
采用 SPSS 22.0 统计软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示。多个样本均数比较时，经方差齐性检验后，若满足方差齐性，使用方差分析，两两比较采用 LSD-t 检验；若方差不齐，则采用 t′ 检验；关系的分析采用线性相关性分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
SO 组各时间点亚组的大鼠均存活，总体存活率为 100%；SAP 组中，24 h 亚组大鼠存活 8 只，36 h 亚组大鼠存活 6 只，48 h 亚组大鼠存活 4 只，总体存活率为 60%；RAPA 组中，24 h 亚组大鼠存活 9 只，36 h 亚组大鼠存活 8 只，48 h 亚组大鼠存活 7 只，总体存活率为 80%。
2.1 胰腺组织中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达量
2.1.1 胰腺组织中 p-mTOR 的表达量
在 24、36 及 48 h 时点，SO 组、SAP 组和 RAPA 组大鼠胰腺组织中的 p-mTOR 表达量顺序均为：SO 组<RAPA 组<SAP 组，3 组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。SO 组内的 3 个时间点亚组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）；在 SAP 组和 RAPA 组，均是 24 h<36 h<48 h，同组内的 3 个时间点间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。具体见图 2a和图 2b。
图2
示胰腺组织中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达
a：胰腺组织中 p-mTOR 表达的电泳图片；b：3 组胰腺组织中 p-mTOR 的表达水平；c：胰腺组织中 p-S6K1 表达的电泳图片；d：3 组胰腺组织中 p-S6K1 的表达水平；同时点与 SO 组比较，*
2.1.2 胰腺组织中 p-S6K1 的表达量
在 24、36 及 48 h 时点，SO 组、SAP 组和 RAPA 组大鼠胰腺组织中的 p-S6K1 表达量顺序均为：SO 组<RAPA 组<SAP 组，3 组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。SO 组内的 3 个时间点亚组比较差异无统计学意义（P>0.05）；在 SAP 组和 RAPA 组，均是 24 h<36 h<48 h，同组内的 3 个时间点间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。具体见图 2c和图 2d。
2.2 血清炎症因子含量
2.2.1 血清 IL-1β 含量
SO 组中，随着时间的延长，血清 IL-1β 含量总体呈下降趋势；SAP 组中，随着时间的延长，血清 IL-1β 含量总体呈上升趋势；RAPA 组中，随着时间的延长，血清 IL-1β 含量大致呈下降趋势。在 24 h 亚组中，SO 组、RAPA 组及 SAP 组大鼠的血清 IL-1β 含量比较差异无统计学意义（P>0.05）；在 36 h 亚组中，3 组大鼠的血清 IL-1β 含量顺序为：RAPA 组<SAP 组<SO 组，3 组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；在 48 h 亚组中，3 组大鼠的血清 IL-1β 含量顺序为：SO 组<RAPA 组<SAP 组，3 组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。具体见图 3a。
图3
示 3 组大鼠各时点的血清 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 含量、胰腺组织的病理学检查结果以及胰腺组织中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达水平与胰腺组织病理评分的关系的散点图
a：3 组大鼠各时点血清 IL-1β 含量；b：3 组大鼠各时点血清 IL-6 含量；c：3 组大鼠各时点血清 TNF-α 含量；同时点与 SO 组比较，*
2.2.2 血清 IL-6 含量
SO 组中，随着时间的延长，血清 IL-6 含量总体呈下降趋势；SAP 组中，随着时间的延长，血清 IL-6 含量总体呈上升趋势；RAPA 组中，随着时间的延长，血清 IL-6 含量总体呈下降趋势。在 24 h 亚组中，3 组的血清 IL-6 含量顺序依次为：SO 组/SAP 组<RAPA 组，RAPA 组与另 2 组比较差异均有统计学意义（P<0.05），而 SO 组与 SAP 组比较差异无统计学意义（P>0.05）；在 36 h 和 48 h 亚组中，3 组的血清 IL-6 含量顺序依次为：SO 组<RAPA 组<SAP 组，3 组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05），具体见图 3b。
2.2.3 血清 TNF-α 含量
SO 组中，随着时间的延长，血清 TNF-α 含量总体呈下降趋势；SAP 组中，随着时间的延长，血清 TNF-α 含量总体呈上升趋势；RAPA 组中，随着时间的延长，血清 TNF-α 含量总体呈下降趋势。在 24 h 亚组中， SO 组、SAP 组及 RAPA 组的血清 TNF-α 含量比较差异无统计学意义（P>0.05）；在 36 h 亚组中，3 组的血清 TNF-α 含量顺序依次为：SO 组<RAPA 组<SAP 组，3 组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；在 48 h 亚组中，血清 TNF-α 含量为 SO/RAPA 组<SAP 组，SAP 组与其余 2 组比较差异均有统计学意义（P<0.05），而 SO 组与 RAPA 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。具体见图 3c。
2.3 胰腺组织的病理学改变及其病理评分
同时点与 SO 组比较，SAP 组和 RAPA 组的胰腺组织的病理学损伤较重，RAPA 组损伤较 SAP 组轻；同组内随时间延长，SO 组的病理学改变不大，但 SAP 组和 RAPA 组有加重趋势，具体见 3d–3j。SO 组、SAP 组及 RAPA 组内 3 个时间点的病理学评分依次为：SO 组，48 h 组<36 h 组<24 h 组，3 个时点间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；SAP 组：24 h 组<36 h 组<48 h 组，3 个时点间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；RAPA 组，24 h 组<36 h 组<48 h 组，3 个时点间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。24 h、36 h 及 48 h 时，同时点下 3 组胰腺组织的病理学评分依次为：SO组<RAPA 组<SAP 组，3 组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。具体见表 2。
表2
3 组大鼠胰腺组织的病理学评分（分，）
2.4 胰腺组织中 p-mTOR、p-S6K1 的表达水平与胰腺组织病理评分的相关性
胰腺组织中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达水平与胰腺组织的病理学评分均呈正相关（r=0.97，P<0.01；r=0.89，P<0.01），见图 3k 和图 3l（根据3 组大鼠 3 个时点结果的均值绘制）。
3 讨论
SAP 是临床常见的急腹症之一，该病发病快，呈恶性发展趋势，治疗极为复杂，晚期阶段同时合并 SIRS，引起广泛的器官组织损伤，最终发展为多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[18-20]。约有 25% 的急性胰腺炎可发展为 SAP[21]。mTOR 是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸激酶，存在于 2 个不同的复合体中，第 1 个为 mTORC1，由 mTOR、Raptor、GβL 和 DEPTOR 构成，它是一主要的生长调节分子，可感受并结合不同的营养因素和环境因素，包括生长因子、能量水平、细胞应激及氨基酸，可被雷帕霉素抑制，而激活的 mTOR 可使下游 S6K1 磷酸化而发挥其生理作用[22-24]。第 2 种复合体是 mTORC2，由 mTOR、Rictor、GβL、Sin1、PRR5/Protor-1 和 DEPTOR 构成。有研究[25-29]证实，mTOR 信号转导异常见于多种疾病如癌症、心血管疾病和糖尿病。
本研究结果显示，各时点 3 组胰腺组织中的 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达水平顺序均为 SO 组<RAPA 组<SAP 组，且在 SAP 组和 RAPA 组中，随时间延长，胰腺组织中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达水平升高。而 mTOR 和 S6K1 作为 mTOR 信号通路中下游的关键蛋白分子，其磷酸化水平反映了该通路的激活情况，这提示在 SAP 时，mTOR 信号通路被广泛激活。本实验结果显示，SAP 组血清 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 含量随时间延长总体升高，而 RAPA 组随时间延长呈下降趋势，36 和 48 h 时，RAPA 组和 SAP 组的上述 3 项指标总体高于 SO 组，且 RAPA 组的 3 项指标均低于 SAP 组，该结果一方面提示在 SAP 时，炎症因子 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 大量释放入血，参与 SAP 的发生；另一方面提示雷帕霉素可能通过抑制 mTOR 信号通路减少炎症因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的合成及释放。此外，24、36 和 48 h 时，SAP 组胰腺组织的病理评分都显著高于 SO 组相应时点，而 RAPA 组胰腺组织的病理评分却介于 SO 组和 SAP 组相应亚组之间。经相关性分析，胰腺组织中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达水平与胰腺组织的损害程度呈线性正相关关系，且二者的相关系数r均大于 0.8，故可以认为，在 SAP 时，胰腺组织中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表达水平与胰腺组织损害程度具有较高的相关性。
综上所述，在 SAP 中，炎症因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 被大量释放入血，参与 SAP 的发病过程；mTOR 信号通路被广泛激活，且胰腺组织中p-mTOR 和 p-S6K1 的表达水平与胰腺组织的损害程度呈线性正相关关系；雷帕霉素可减轻 SAP 中胰腺组织损害程度，其机制可能为下调胰腺组织中p-mTOR 和 p-S6K1 的表达，或者减少炎症介质IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的合成及释放，进而减轻胰腺损伤。
