引用本文： 邱建国, 史政荣, 李明. 长链非编码 RNA GAS5 在肝细胞性肝癌中的表达及其临床意义. 中国普外基础与临床杂志, 2019, 26(3): 301-306. doi: 10.7507/1007-9424.201807021 复制
肝癌常常起病隐匿、进展迅速，绝大部分患者确诊时已处于中、晚期，丧失了手术时机，即使手术根治性切除，术后复发和转移仍然是制约患者长期生存的重要因素[1-2]。因此，为了早期发现肝癌以改善肝癌患者的预后，人们一直在致力于研究导致肝癌侵袭及转移的细胞及分子生物学机制。近年来，基因测序技术的发展使大量非编码 RNA（non-coding RNA，ncRNA），特别是长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在肿瘤的发生、侵袭和转移中的作用越来越受到人们的关注[3-5]。研究发现，lncRNA 中的生长停滞敏感基因 5（growth arrest-specific 5，GAS5）是一种肿瘤抑制因子[6]，通常由血清不足、细胞间接触抑制等应激诱导产生[7]；它可诱导细胞凋亡并调控细胞周期[8-9]。在肾癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱移行细胞癌等肿瘤组织和细胞株中，GAS5 mRNA 的表达水平显著低于正常组织/细胞，可能因此而导致了肿瘤细胞逃避凋亡和细胞周期失调[6-11]。然而，有关肝癌中 GAS5 的研究报道还相对较少[12-13]。景伟等[13]比较了肝癌患者治疗前后 GAS5 mRNA 的表达水平的变化，以用于治疗效果的预估。但 GAS5 mRNA 在肝细胞性肝癌中的表达情况及其临床意义尤其是其与患者远期预后的相关性还有待进一步研究及证实。因此，本研究旨在通过检测 GAS5 mRNA 在肝细胞性肝癌组织中的表达情况，并结合临床资料探讨其与患者临床病理学特征之间的相关性，明确 GAS5 mRNA 作为肝细胞性肝癌生物标志物或药物靶标的潜在应用价值，并提供实验理论依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
纳入标准：2013 年 9 月至 2016 年 7 月期间于重庆医科大学附属第一医院行根治性切除手术、术后病理学检查证实为原发性肝细胞性肝癌的患者，患者术前未接受任何静脉化疗或经皮肝动脉介入化疗栓塞术（TACE）等其他治疗。排除标准：① 病理学检查证实为非原发性肝细胞性肝癌；② 患者临床资料不完整；③ 术前接受针对肿瘤特异性治疗（化疗、放疗或其他）。按照预先设定的纳入和排除标准，回顾性收集病例 120 例，其中男 66 例（55.0%），女 54 例（45.0%）；年龄 30～72 岁，中位年龄为 56 岁。肿瘤直径 2～14 cm，中位数为 5.8 cm，其中<5 cm 者 74 例（61.7%）；肿瘤病灶<3 个者 87 例（72.5%）；术前甲胎蛋白（AFP）20～1 200 μg/L，中位数为 420 μg/L，其中<400 μg/L 者 54 例（45.0%）；术前谷丙转氨酶 28～234 U/L，中位数为 61 U/L，其中小于 40 U/L 者 65 例（54.2%）；手术时间<300 min 者 74 例（61.7%），肝脏阻断时间<60 min 者 78 例（65%），术中出血量<1 000 mL 者 81 例（67.5%），输血 35 例（29.2%）；发生微血管侵犯 55 例（45.8%），发生门静脉癌栓 18 例（15.0%），发生腹水 20 例（16.7%），合并肝硬变 85 例（70.8%），乙肝表面抗原阳性 82 例（68.3%）。按照 2009 年美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）标准[14]进行 TNM 分期：Ⅰ 期 7 例（5.8%），Ⅱ 期 87 例（72.5%），Ⅲ 期 24 例（20.0%），Ⅳ 期 2 例（1.7%）。按照 WHO 肿瘤病理学分级标准[15]：高分化 31 例（25.8%），中分化 16 例（13.4%），低分化 73 例（60.8%）。有淋巴结转移者 34 例（28.3%），无淋巴结转移者 86 例（71.7%）。肝切除术式为左/右半肝切除 25 例（20.9%），联合肝段切除 40 例（33.3%），肝段切除 45 例（37.5%），左/右三叶切除 10 例（8.3%）。每例患者均取得肝细胞性肝癌原发灶以及距原发灶边缘 2 cm 以远的相应的癌旁组织，切除的手术标本一部分（1/2）直接置于液氮中冻藏，并转移至–80 ℃低温冰箱保存以用于后续实验提取组织总 RNA 与 DNA；另一部分（1/2）标本置于含 10% 甲醛溶液中固定，常规制作石蜡包埋切片并行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。HE 染色结果显示，所有肿瘤标本均为肝细胞性肝癌组织，癌旁组织均未见癌细胞累及。
1.2 主要试剂
Trizol 试剂和脂质体 Lipofectamine2000购自美国 Invitrogen 公司；RPMI-1640 培养基和胎牛血清购自美国 Gibco 公司；GAS5 引物以及干扰序列由上海百奥迈科生物股份有限公司合成。RNA 反转录试剂盒和实时荧光定量 PCR（RT-PCR）试剂盒购于日本 TaKaRa 公司。
1.3 RT-PCR 法检测肝细胞性肝癌组织及其癌旁组织中 GAS5 mRNA 的表达
首先按 TRIzol 试剂说明书提供的操作步骤提取肝细胞性肝癌原发灶和癌旁组织中的 RNA，并参照反转录试剂盒说明书步骤，对 GAS5 基因进行 PCR 扩增。GAS5 基因的正向序列为：5′-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3′，反向序列为：5′-AGGATCACTTGAGCCCAGAAG-3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的正向序列为：5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′；反向序列为：5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。PCR 反应条件：95 ℃ 预变性 10 min； 95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，共计 40 个循环。以 2–ΔΔCt法[16]计算 GAS5 mRNA 的相对表达水平。
1.4 随访
采用电话或门诊等方式进行随访，记录患者的生存情况，随访截止日期为 2018 年 9 月 30 日。总生存期为发病日期至最后随访日期或死亡日期，以月为单位。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 19.0 软件对结果数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（
±s）或中位数表示。采用配对 t 检验比较肝细胞性肝癌原发灶组织及其癌旁组织中 GAS5 mRNA 的表达水平，采用成组 χ2 检验分析肝细胞性肝癌组织中 GAS5 mRNA 的表达与患者临床病理学特征之间的关系；采用 log-rank 检验进行生存分析的单因素分析，采用 Cox 比例风险回归模型进行生存分析的多因素分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 肝细胞性肝癌组织及其癌旁组织中 GAS5 mRNA 的表达情况
采用 RT-PCR 法检测肝细胞性肝癌组织及其癌旁组织中 GAS5 mRNA 的表达水平，结果显示：与其对应的癌旁组织相比较，肝细胞性肝癌组织中 GAS5 mRNA 的表达水平较低，差异具有统计学意义（t=2.321，P<0.01），见图 1。
图1
示肝细胞性肝癌及其癌旁组织中 GAS5 mRNA的表达水平及 GAS5 mRNA的表达对患者生存的影响
a：肝细胞性肝癌及其癌旁组织中 GAS5 mRNA的表达水平；b：GAS5 mRNA 低表达和高表达肝细胞性肝癌患者的生存曲线
2.2 GAS5 mRNA 的表达水平与肝细胞性肝癌患者临床病理学特征之间的关系
以肝细胞性肝癌组织中 GAS5 mRNA 表达水平的均数（0.9）为界，将其分为 GAS5 mRNA 高表达组和低表达组，并分析 GAS5 mRNA 表达与肝细胞性肝癌患者临床病理学特征的关系，结果表明，GAS5 mRNA 的表达与肿瘤直径、肿瘤数量、术前 AFP 水平、淋巴结转移、TNM 分期和肿瘤分化程度均相关（P<0.05），而与患者的年龄、性别和乙肝表面抗原情况均无关（P>0.05），具体见表 1。
表1
GAS5 mRNA 的表达水平与肝细胞性肝癌患者临床病理学特征之间的关系
2.3 GAS5 mRNA 低表达预示肝细胞性肝癌患者的预后不良
本组 109 例患者（90.8%）获访，随访时间为 24～60 个月，中位随访时间为 39 个月。随访期间因肿瘤复发或转移死亡 71 例，全组术后总的 1、3 及 5 年生存率分别为 73.5%、51.2% 和 37.5%。
2.3.1 单因素分析
log-rank 检验结果表明，肝细胞性肝癌患者的预后与年龄、性别、术前谷丙转氨酶水平、腹水、肝脏阻断时间及输血均无关（P>0.05）；而与肿瘤直径、肿瘤数量、术前 AFP 水平、微血管侵犯、门静脉癌栓、淋巴结转移、合并肝硬变、手术时间、术中出血量、TNM 分期及 GAS5 mRNA 的表达均有关（P<0.05），具体见表 2。
表2
生存分析的单因素分析
2.3.2 多因素分析
将单因素分析中有统计学意义的 10 项因素（也符合专业认知）引入 Cox 比例风险回归模型，结果表明，术前 AFP 水平和肝硬变均与预后无关（P>0.05）；微血管侵犯、门静脉癌栓、肿瘤直径、肿瘤数量、术中出血量、淋巴结转移、TNM 分期及 GAS5 mRNA 的表达（图 1b）均与预后有关（P<0.05）。具体见表 3。
表3
Cox 比例风险回归模型结果
3 讨论
肝癌是严重危害人类健康的疾病之一，表观遗传修饰在肝癌的发生和发展中起重要作用。表观遗传机制主要涉及 DNA 甲基化、多种形式的组蛋白修饰、染色质重构和 RNA 干扰[24-25]。随着高通量基因测序技术的应用，lncRNAs 在肿瘤发生和发展中的作用越来越引起研究者的关注。lncRNAs 是一类在基因组转录中不参与编码蛋白、长度超过 200 个核苷酸的转录产物，具备染色质修饰、转录、翻译、剪接、表观遗传学调控等多种生物学功能，并在各种生物进程中发挥重要作用。
目前与肝癌发生、侵袭和转移相关性较强的 lncRNAs 主要有以下几种：H19、肺腺癌转移相关转录子 1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）、HOX 转录反义 RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）、肝癌高表达基因（highly up-regulated in liver cancer，HULC）、TUC388、母系印记基因 3（maternal expressed gene 3，MEG3）等。H19 是第一个被发现的 lncRNA，由位于染色体 11p15.5 上的 H19 基因转录，在正常肝细胞中含量极低，肝癌发生时表达明显上调[26]，因此有研究[26]报道，H19 的表达水平与 AFP 联合检测可提高肝癌的早期确诊率。MALAT1 系由位于染色体 11q13 上的 MALAT1 基因转录，MALAT1 可通过与多聚嘧啶序列结合蛋白（polypyrimidine tract binding protein，PTB）相关剪接因子（PTB-associated splicing factor，PSF）结合，抑制 PSF 蛋白与原癌基因转录调节区结合，导致原癌基因大量转录而诱发肿瘤的发生[27]。HOTAIR 系由位于染色体 12q13.13 上的 HOXC 基因转录，通过外源性基因沉默的方式调控基因表达，进而促进肝癌细胞的增殖[3, 28]。HULC 系由位于染色体 6p24.3 上的 HULC 基因转录，HULC 与 microRNA-372 结合后，直接抑制其活性，从而在转录水平调节基因表达，进而影响肝癌的进展。TUC388 是多聚胞嘧啶结合蛋白 2 基因转录片段 uc.338 克隆形成的转录产物，uc.338 在人肝癌组织和细胞株中的表达显著上调[29]。MEG3 由人类染色体 14q32.3 的 MEG3 基因转录，其通过抑制抑癌基因 p53 而发挥影响肝癌细胞增殖的作用[30]。
既往的研究[31]已发现，GAS5 位于人类染色体 1q25.1，长度为 4 983 bp，含有多个内含子和外显子；内含子编码核小 RNA，外显子包含开放阅读框架却不编码功能性蛋白质，最初是作为生长停滞细胞中高表达的基因被发现的。实验[11-13]结果显示，GAS5 mRNA 在胰腺癌组织中的表达水平与正常组织相比是明显降低的，而过表达 GAS5 mRNA 可以抑制胰腺细胞的增殖，但 GAS5 mRNA 在肝细胞性肝癌组织中的表达及其功能研究和报道相对较少。本研究发现，GAS5 mRNA 在肝细胞性肝癌组织中的表达水平低于癌旁组织。而 GAS5 mRNA 是一种已知的肿瘤抑制因子，它可诱导细胞凋亡和调控细胞周期，因此本研究结果提示，GAS5 mRNA 的表达抑制可能参与肝细胞性肝癌的发生。本研究进一步分析了 GAS5 mRNA 表达与患者临床病理学特征的关系，发现肝细胞性肝癌组织中 GAS5 mRNA 的低表达与肿瘤直径、肿瘤数量、淋巴结转移、肿瘤 TNM 分期及肿瘤分化程度相关。
目前，利用各种治疗手段对肝癌患者进行多学科（multidisciplinary team，MDT）诊治是肝癌治疗的趋势。临床上如能确立一些准确预测预后的指标，将有助于鉴别高复发倾向人群并提供防治复发依据，进而及早预防复发。本研究通过对 120 例肝细胞性肝癌患者的临床病理学特征、治疗措施等 16 项指标进行分析，发现影响患者术后预后的因素包括肿瘤直径、肿瘤数目、微血管侵犯、门静脉癌栓、肿瘤 TNM 分期以及 GAS5 mRNA 的表达情况，且单因素和多因素生存分析结果均表明，GAS5 mRNA 表达是影响肝细胞性肝癌患者预后的影响因素。临床上对 GAS5 mRNA 表达水平的检测有可能为我们对肝癌患者预后的判断提供依据。
本研究仅初步探讨了 GAS5 mRNA 在肝细胞性肝癌组织中的表达及其临床意义，但关于 GAS5 mRNA 在肝细胞性肝癌侵袭转移过程中的生物学功能及其具体作用机制尚需进一步研究。随着研究的深入，GAS5 mRNA 作为肝细胞性肝癌的生物学标志物或药物靶标的潜在应用价值将可能逐步显现，这亦为后续的转化医学研究奠定了理论基础。
肝癌常常起病隐匿、进展迅速，绝大部分患者确诊时已处于中、晚期，丧失了手术时机，即使手术根治性切除，术后复发和转移仍然是制约患者长期生存的重要因素[1-2]。因此，为了早期发现肝癌以改善肝癌患者的预后，人们一直在致力于研究导致肝癌侵袭及转移的细胞及分子生物学机制。近年来，基因测序技术的发展使大量非编码 RNA（non-coding RNA，ncRNA），特别是长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在肿瘤的发生、侵袭和转移中的作用越来越受到人们的关注[3-5]。研究发现，lncRNA 中的生长停滞敏感基因 5（growth arrest-specific 5，GAS5）是一种肿瘤抑制因子[6]，通常由血清不足、细胞间接触抑制等应激诱导产生[7]；它可诱导细胞凋亡并调控细胞周期[8-9]。在肾癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱移行细胞癌等肿瘤组织和细胞株中，GAS5 mRNA 的表达水平显著低于正常组织/细胞，可能因此而导致了肿瘤细胞逃避凋亡和细胞周期失调[6-11]。然而，有关肝癌中 GAS5 的研究报道还相对较少[12-13]。景伟等[13]比较了肝癌患者治疗前后 GAS5 mRNA 的表达水平的变化，以用于治疗效果的预估。但 GAS5 mRNA 在肝细胞性肝癌中的表达情况及其临床意义尤其是其与患者远期预后的相关性还有待进一步研究及证实。因此，本研究旨在通过检测 GAS5 mRNA 在肝细胞性肝癌组织中的表达情况，并结合临床资料探讨其与患者临床病理学特征之间的相关性，明确 GAS5 mRNA 作为肝细胞性肝癌生物标志物或药物靶标的潜在应用价值，并提供实验理论依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
纳入标准：2013 年 9 月至 2016 年 7 月期间于重庆医科大学附属第一医院行根治性切除手术、术后病理学检查证实为原发性肝细胞性肝癌的患者，患者术前未接受任何静脉化疗或经皮肝动脉介入化疗栓塞术（TACE）等其他治疗。排除标准：① 病理学检查证实为非原发性肝细胞性肝癌；② 患者临床资料不完整；③ 术前接受针对肿瘤特异性治疗（化疗、放疗或其他）。按照预先设定的纳入和排除标准，回顾性收集病例 120 例，其中男 66 例（55.0%），女 54 例（45.0%）；年龄 30～72 岁，中位年龄为 56 岁。肿瘤直径 2～14 cm，中位数为 5.8 cm，其中<5 cm 者 74 例（61.7%）；肿瘤病灶<3 个者 87 例（72.5%）；术前甲胎蛋白（AFP）20～1 200 μg/L，中位数为 420 μg/L，其中<400 μg/L 者 54 例（45.0%）；术前谷丙转氨酶 28～234 U/L，中位数为 61 U/L，其中小于 40 U/L 者 65 例（54.2%）；手术时间<300 min 者 74 例（61.7%），肝脏阻断时间<60 min 者 78 例（65%），术中出血量<1 000 mL 者 81 例（67.5%），输血 35 例（29.2%）；发生微血管侵犯 55 例（45.8%），发生门静脉癌栓 18 例（15.0%），发生腹水 20 例（16.7%），合并肝硬变 85 例（70.8%），乙肝表面抗原阳性 82 例（68.3%）。按照 2009 年美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）标准[14]进行 TNM 分期：Ⅰ 期 7 例（5.8%），Ⅱ 期 87 例（72.5%），Ⅲ 期 24 例（20.0%），Ⅳ 期 2 例（1.7%）。按照 WHO 肿瘤病理学分级标准[15]：高分化 31 例（25.8%），中分化 16 例（13.4%），低分化 73 例（60.8%）。有淋巴结转移者 34 例（28.3%），无淋巴结转移者 86 例（71.7%）。肝切除术式为左/右半肝切除 25 例（20.9%），联合肝段切除 40 例（33.3%），肝段切除 45 例（37.5%），左/右三叶切除 10 例（8.3%）。每例患者均取得肝细胞性肝癌原发灶以及距原发灶边缘 2 cm 以远的相应的癌旁组织，切除的手术标本一部分（1/2）直接置于液氮中冻藏，并转移至–80 ℃低温冰箱保存以用于后续实验提取组织总 RNA 与 DNA；另一部分（1/2）标本置于含 10% 甲醛溶液中固定，常规制作石蜡包埋切片并行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。HE 染色结果显示，所有肿瘤标本均为肝细胞性肝癌组织，癌旁组织均未见癌细胞累及。
1.2 主要试剂
Trizol 试剂和脂质体 Lipofectamine2000购自美国 Invitrogen 公司；RPMI-1640 培养基和胎牛血清购自美国 Gibco 公司；GAS5 引物以及干扰序列由上海百奥迈科生物股份有限公司合成。RNA 反转录试剂盒和实时荧光定量 PCR（RT-PCR）试剂盒购于日本 TaKaRa 公司。
1.3 RT-PCR 法检测肝细胞性肝癌组织及其癌旁组织中 GAS5 mRNA 的表达
首先按 TRIzol 试剂说明书提供的操作步骤提取肝细胞性肝癌原发灶和癌旁组织中的 RNA，并参照反转录试剂盒说明书步骤，对 GAS5 基因进行 PCR 扩增。GAS5 基因的正向序列为：5′-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3′，反向序列为：5′-AGGATCACTTGAGCCCAGAAG-3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的正向序列为：5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′；反向序列为：5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。PCR 反应条件：95 ℃ 预变性 10 min； 95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，共计 40 个循环。以 2–ΔΔCt法[16]计算 GAS5 mRNA 的相对表达水平。
1.4 随访
采用电话或门诊等方式进行随访，记录患者的生存情况，随访截止日期为 2018 年 9 月 30 日。总生存期为发病日期至最后随访日期或死亡日期，以月为单位。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 19.0 软件对结果数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）或中位数表示。采用配对 t 检验比较肝细胞性肝癌原发灶组织及其癌旁组织中 GAS5 mRNA 的表达水平，采用成组 χ2 检验分析肝细胞性肝癌组织中 GAS5 mRNA 的表达与患者临床病理学特征之间的关系；采用 log-rank 检验进行生存分析的单因素分析，采用 Cox 比例风险回归模型进行生存分析的多因素分析。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 肝细胞性肝癌组织及其癌旁组织中 GAS5 mRNA 的表达情况
采用 RT-PCR 法检测肝细胞性肝癌组织及其癌旁组织中 GAS5 mRNA 的表达水平，结果显示：与其对应的癌旁组织相比较，肝细胞性肝癌组织中 GAS5 mRNA 的表达水平较低，差异具有统计学意义（t=2.321，P<0.01），见图 1。
图1
示肝细胞性肝癌及其癌旁组织中 GAS5 mRNA的表达水平及 GAS5 mRNA的表达对患者生存的影响
a：肝细胞性肝癌及其癌旁组织中 GAS5 mRNA的表达水平；b：GAS5 mRNA 低表达和高表达肝细胞性肝癌患者的生存曲线
2.2 GAS5 mRNA 的表达水平与肝细胞性肝癌患者临床病理学特征之间的关系
以肝细胞性肝癌组织中 GAS5 mRNA 表达水平的均数（0.9）为界，将其分为 GAS5 mRNA 高表达组和低表达组，并分析 GAS5 mRNA 表达与肝细胞性肝癌患者临床病理学特征的关系，结果表明，GAS5 mRNA 的表达与肿瘤直径、肿瘤数量、术前 AFP 水平、淋巴结转移、TNM 分期和肿瘤分化程度均相关（P<0.05），而与患者的年龄、性别和乙肝表面抗原情况均无关（P>0.05），具体见表 1。
表1
GAS5 mRNA 的表达水平与肝细胞性肝癌患者临床病理学特征之间的关系
2.3 GAS5 mRNA 低表达预示肝细胞性肝癌患者的预后不良
本组 109 例患者（90.8%）获访，随访时间为 24～60 个月，中位随访时间为 39 个月。随访期间因肿瘤复发或转移死亡 71 例，全组术后总的 1、3 及 5 年生存率分别为 73.5%、51.2% 和 37.5%。
2.3.1 单因素分析
log-rank 检验结果表明，肝细胞性肝癌患者的预后与年龄、性别、术前谷丙转氨酶水平、腹水、肝脏阻断时间及输血均无关（P>0.05）；而与肿瘤直径、肿瘤数量、术前 AFP 水平、微血管侵犯、门静脉癌栓、淋巴结转移、合并肝硬变、手术时间、术中出血量、TNM 分期及 GAS5 mRNA 的表达均有关（P<0.05），具体见表 2。
表2
生存分析的单因素分析
2.3.2 多因素分析
将单因素分析中有统计学意义的 10 项因素（也符合专业认知）引入 Cox 比例风险回归模型，结果表明，术前 AFP 水平和肝硬变均与预后无关（P>0.05）；微血管侵犯、门静脉癌栓、肿瘤直径、肿瘤数量、术中出血量、淋巴结转移、TNM 分期及 GAS5 mRNA 的表达（图 1b）均与预后有关（P<0.05）。具体见表 3。
表3
Cox 比例风险回归模型结果
3 讨论
肝癌是严重危害人类健康的疾病之一，表观遗传修饰在肝癌的发生和发展中起重要作用。表观遗传机制主要涉及 DNA 甲基化、多种形式的组蛋白修饰、染色质重构和 RNA 干扰[24-25]。随着高通量基因测序技术的应用，lncRNAs 在肿瘤发生和发展中的作用越来越引起研究者的关注。lncRNAs 是一类在基因组转录中不参与编码蛋白、长度超过 200 个核苷酸的转录产物，具备染色质修饰、转录、翻译、剪接、表观遗传学调控等多种生物学功能，并在各种生物进程中发挥重要作用。
目前与肝癌发生、侵袭和转移相关性较强的 lncRNAs 主要有以下几种：H19、肺腺癌转移相关转录子 1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）、HOX 转录反义 RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）、肝癌高表达基因（highly up-regulated in liver cancer，HULC）、TUC388、母系印记基因 3（maternal expressed gene 3，MEG3）等。H19 是第一个被发现的 lncRNA，由位于染色体 11p15.5 上的 H19 基因转录，在正常肝细胞中含量极低，肝癌发生时表达明显上调[26]，因此有研究[26]报道，H19 的表达水平与 AFP 联合检测可提高肝癌的早期确诊率。MALAT1 系由位于染色体 11q13 上的 MALAT1 基因转录，MALAT1 可通过与多聚嘧啶序列结合蛋白（polypyrimidine tract binding protein，PTB）相关剪接因子（PTB-associated splicing factor，PSF）结合，抑制 PSF 蛋白与原癌基因转录调节区结合，导致原癌基因大量转录而诱发肿瘤的发生[27]。HOTAIR 系由位于染色体 12q13.13 上的 HOXC 基因转录，通过外源性基因沉默的方式调控基因表达，进而促进肝癌细胞的增殖[3, 28]。HULC 系由位于染色体 6p24.3 上的 HULC 基因转录，HULC 与 microRNA-372 结合后，直接抑制其活性，从而在转录水平调节基因表达，进而影响肝癌的进展。TUC388 是多聚胞嘧啶结合蛋白 2 基因转录片段 uc.338 克隆形成的转录产物，uc.338 在人肝癌组织和细胞株中的表达显著上调[29]。MEG3 由人类染色体 14q32.3 的 MEG3 基因转录，其通过抑制抑癌基因 p53 而发挥影响肝癌细胞增殖的作用[30]。
既往的研究[31]已发现，GAS5 位于人类染色体 1q25.1，长度为 4 983 bp，含有多个内含子和外显子；内含子编码核小 RNA，外显子包含开放阅读框架却不编码功能性蛋白质，最初是作为生长停滞细胞中高表达的基因被发现的。实验[11-13]结果显示，GAS5 mRNA 在胰腺癌组织中的表达水平与正常组织相比是明显降低的，而过表达 GAS5 mRNA 可以抑制胰腺细胞的增殖，但 GAS5 mRNA 在肝细胞性肝癌组织中的表达及其功能研究和报道相对较少。本研究发现，GAS5 mRNA 在肝细胞性肝癌组织中的表达水平低于癌旁组织。而 GAS5 mRNA 是一种已知的肿瘤抑制因子，它可诱导细胞凋亡和调控细胞周期，因此本研究结果提示，GAS5 mRNA 的表达抑制可能参与肝细胞性肝癌的发生。本研究进一步分析了 GAS5 mRNA 表达与患者临床病理学特征的关系，发现肝细胞性肝癌组织中 GAS5 mRNA 的低表达与肿瘤直径、肿瘤数量、淋巴结转移、肿瘤 TNM 分期及肿瘤分化程度相关。
目前，利用各种治疗手段对肝癌患者进行多学科（multidisciplinary team，MDT）诊治是肝癌治疗的趋势。临床上如能确立一些准确预测预后的指标，将有助于鉴别高复发倾向人群并提供防治复发依据，进而及早预防复发。本研究通过对 120 例肝细胞性肝癌患者的临床病理学特征、治疗措施等 16 项指标进行分析，发现影响患者术后预后的因素包括肿瘤直径、肿瘤数目、微血管侵犯、门静脉癌栓、肿瘤 TNM 分期以及 GAS5 mRNA 的表达情况，且单因素和多因素生存分析结果均表明，GAS5 mRNA 表达是影响肝细胞性肝癌患者预后的影响因素。临床上对 GAS5 mRNA 表达水平的检测有可能为我们对肝癌患者预后的判断提供依据。
本研究仅初步探讨了 GAS5 mRNA 在肝细胞性肝癌组织中的表达及其临床意义，但关于 GAS5 mRNA 在肝细胞性肝癌侵袭转移过程中的生物学功能及其具体作用机制尚需进一步研究。随着研究的深入，GAS5 mRNA 作为肝细胞性肝癌的生物学标志物或药物靶标的潜在应用价值将可能逐步显现，这亦为后续的转化医学研究奠定了理论基础。
