引用本文： 杨超, 郑勇斌, 宋丹, 肖旷, 童仕伦. 构建 KrasLSL-G12D/- 和 Smad4loxp/loxp 双转基因 散发性结直肠癌小鼠模型 . 中国普外基础与临床杂志, 2018, 25(8): 917-922. doi: 10.7507/1007-9424.201801070 复制
结直肠癌发生是多步骤的过程，Kras 基因可以通过多种信号通路影响细胞不可控制的增殖和生长，参与结直肠癌发生的初始阶段，在约 50% 的原发性结直肠癌患者中可以检测到突变型 Kras[1]。Smad4 基因是细胞内信号传递介质家族成员，参与细胞生长和转录调控，扮演着肿瘤抑制因子的角色[2]；Smad4 表达缺失将导致结直肠上皮细胞增生活跃，导致腺瘤高发并呈现出癌变趋势，还通过包括上皮间质转化在内的机制表现出侵袭、转移倾向[3-4]。基因工程小鼠模型作为一种近年来发展迅速的动物模型，可以特异性地修饰感兴趣的目的基因，模拟与临床类似的肿瘤，为精确研究基因与疾病的关系提供了可能[5]。本课题组构建了同时表达 KrasLSL-G12D/-和 Smad4loxp/loxp的双转基因散发性结直肠癌小鼠模型，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料
1.1.1 实验动物
从美国杰克逊实验室（The Jackson Laboratory）购买的 SPF 级 B6.129S4-Krastm4Tyj/J （008179）和 Stock Smad4tm2.1Cxd/J（017462）雌雄小鼠各 1 对，C57BL/6J 小鼠来自本课题组前期保种。B6.129S4-Krastm4Tyj/J 小鼠是在 Kras 基因上游插入了 Loxp-stop-Loxp（LSL）序列，Stock Smad4tm2.1Cxd/J 小鼠是在 Smad4 基因上下游分别插入了 Loxp 序列。Cre 重组酶可特异性识别 LSL 序列，利用慢病毒载体将 Cre 基因转染入双转基因模型小鼠结直肠隐窝上皮细胞内，Cre 重组酶将对小鼠肠上皮细胞中 Kras 基因上游的终止序列以及 Smad4 基因序列进行特异性识别并切除，导致原癌基因 Kras 激活表达，诱导肠上皮细胞瘤变进而成癌。其基因重组模式见图 1。
图1
示 Cre 重组酶介导的基因重组模式图
1.1.2 主要材料
小鼠结肠镜系统，由 PENTAX FB-8V 改装，日本；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪，ABI 公司，美国；凝胶成像系统，VILBER，法国；琼脂糖凝胶电泳仪，六一生物公司，北京；鼠尾 DNA 提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司，北京；氯化钙（CaCl2）转染试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司，上海；IVIS 系统，PE 公司，美国；D-Luciferin，上海前尘生物科技有限公司，上海；引物，上海生工生物工程有限公司，上海。
1.2 动物饲养环境
实验小鼠饲养于武汉大学动物实验中心独立通气笼具系统（苏州市苏杭科技器材有限公司，苏州），室温 22～25 °C，相对湿度 60%～70%；小鼠饲养盒、垫料及饮用水均经过高温高压灭菌处理；小鼠繁殖饲料（北京华阜康生物科技股份有限公司，北京）经辐照灭菌。
1.3 双转基因模型小鼠的构建
1.3.1 双转基因模型小鼠的培育与筛选
首先将 B6.129S4-Krastm4Tyj/J 小鼠与 C57BL/6J 小鼠杂交和反复回交，转换其遗传背景，以增强其存活和繁殖能力。利用普通 PCR 筛选出 C57BL/6J-KrasLSL-G12D/-/J 杂合子小鼠（由于该型纯合子小鼠在母体子宫内已死亡，故只能筛选出杂合子小鼠，简记为 KrasLSL-G12D/-）。同时将 Stock Smad4tm2.1Cxd/J 小鼠转化遗传背景后通过杂交和回交并利用普通 PCR 筛选出纯合子小鼠，简记为 Smad4loxp/loxp。最后将 KrasLSL-G12D/-和 Smad4loxp/loxp小鼠杂交形成双杂合子的 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/-小鼠，再将此种基因型的双杂合子小鼠自交，利用普通 PCR 和侧交最终筛选出 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp品系小鼠，该小鼠即为本研究所构建的双转基因模型小鼠。
1.3.2 小鼠组织 DNA 提取
为提取实验小鼠 DNA 进行基因型的鉴定与筛选，剪取 2 周龄实验小鼠尾尖组织 4～6 mm 长，剪碎后置于 1.5 mL EP 管中，使用鼠尾 DNA 提取试剂盒提取小鼠组织 DNA，于 4 °C 保存备检。
1.3.3 KrasLSL-G12D/- 的检测
正向引物为5′-TGTCTTTCCCCAGCACAGT-3′（针对野生型）、5′-GCAGGTCGAGGGACCTAATA-3′（针对突变型）；反向引物均为5′-CTGCATAGTACGCTATACCCTGT-3′。PCR 扩增条件为：94 °C 变性 2 min；94 °C 15 s，60 °C15 s，72 °C 10 s，28 个循环；72 °C 2 min，4 °C 冷却保温。PCR 产物 1.5% 琼脂糖凝胶电泳 20 min，凝胶荧光成像系统下观察，KrasLSL-G12D/-小鼠应扩增出 100 bp 和 250 bp 的片段，而野生型小鼠仅扩增出 250 bp 的片段。
1.3.4 Smad4loxp/loxp的检测
正向引物为5′-TAAGAGCCACAGGGTCAAGC-3′，反向引物为5′-TTCCAGGAAAAACAGGGCTA-3′。PCR 扩增条件为：94 °C 预变性 2 min；94 °C 变性 20 s，65 °C 复性 15 s（每个循环温度降低 0.5 °C），68 °C 延伸10 s，10 个循环；接着再 94 °C 变性 15 s，60 °C 复性 15 s，72 °C延伸 10 s，共 28 个循环；72 °C 延伸2 min，4 °C 保存。将PCR 产物 3% 琼脂糖凝胶电泳30 min，Smad4loxp/loxp小鼠只扩增出 500 bp 的片段，而野生型小鼠则扩增出 500 bp 和 436 bp 的片段。
1.4 双转基因模型小鼠验证
1.4.1 构建病毒载体
利用CaCl2转染法进行病毒载体构建，慢病毒质粒为课题组前期构建的pHIV-Ubi-Puromycin-IRES-Luciferase和pHIV-Ubi-Puromycin-Cre-IRES-Luciferase（Luciferase 即荧光素酶基因用来示踪单个细胞，以研究单个细胞的行为变化）；包装质粒PMD2G（addgene12259）和PSPAX2（addgene12260），按照转染试剂盒说明书进行操作，收取病毒后进行纯化并测定病毒滴度， 然后于 –80 ℃下保存。将病毒载体分别简记为 Lentivirus IRES-Luciferase和 LentivirusCre-IRES-Luciferase。
1.4.2 体外验证 Cre 酶活性
取处于对数生长期状态良好的小鼠结肠癌细胞 MCA38 用于慢病毒感染。在 12 孔板中接种 MCA38，在 37 °C、体积分数为 5% CO2 的培养箱中培养，待细胞密度达到60%~70%时用慢病毒颗粒感染细胞，在 IVIS 系统下观察病毒载体体外感染效果。
1.4.3 Cre 重组酶诱导小鼠结肠上皮细胞突变
采用生理盐水灌肠去除直肠及远端结肠内的肠内容物，戊巴比妥钠（10 mg/mL，50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，小鼠结肠镜检查肠道清洁情况，同时确定感染的部位，利用微量注射器向小鼠肠黏膜下注射 LentivirusCre-IRES-Luciferase（108 pfu），对照组注射 LentivirusIRES-Luciferase（108 pfu）。感染 1 周后，于小鼠腹腔内注射 D-Luciferin（150 μg/mL，10 μL/g），IVIS 系统下观察荧光，调整病毒滴度和感染频率以获得仅 1～2 处成瘤病灶的小鼠模型（病毒滴度一般为108 pfu，每只小鼠注射量30 μL，用微量注射器通过结肠镜下注射于结直肠肠黏膜下，可见黏膜隆起是注射深度正确的标志，一般注射1或2处）。然后每4周利用IVIS系统监测双转基因模型小鼠成瘤情况。
1.4.4 组织病理学检查
待双转基因模型小鼠肿瘤形成后，将小鼠麻醉，解剖取出结肠并用 PBS 冲洗，在新制备的甲醛中固定 24 h，石蜡包埋切片后行苏木精-伊红（ HE ）染色，显微镜下观察肿瘤组织病理学变化，记录结肠上皮细胞瘤变情况。
1.5 统计学方法
统计分析使用 GraphPad Prism 6 软件。小鼠的繁殖学指标用均数±标准差（
±s）表示，双转基因模型小鼠与 C57BL/6J 小鼠的差异比较用独立样本 t 检验。检验水准 α=0.050。
2 结果
2.1 双转基因模型小鼠 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp的检测
目前共繁育出48只C57BL/6J小鼠，69只双转基因模型小鼠。构建的双转基因模型小鼠与 C57BL/6J 小鼠相比外形无明显差别，见图 2a。与 C57BL/6J 小鼠比较，双转基因模型小鼠的窝产仔数更多（P=0.038）、胎间隔时间短（P<0.001），见表 1。双转基因模型小鼠的基因鉴定结果见图 2b，其中 1、2 和 3 号小鼠基因型为 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp，为本研究所构建的双转基因模型小鼠；4 号小鼠是培育过程中另一种常见的基因型，为 Kras-/-+Smad4loxp/loxp，该型小鼠在实验过程中需剔除。
图2
示双转基因构建结果及基因鉴定结果
a：为第 8 周时双转基因模型小鼠（右边）与 C57BL/6J 小鼠（左边）相比，其外观无明显差别；b：为双转基因模型小鼠的基因鉴定结果，从左往右的电泳图依次为加 Kras 突变型引物、加 Kras 野生型引物和加 Smad4 引物；1、2 和 3 号泳道为构建的双转基因模型小鼠；4 号泳道为 Kras-/- +Smad4loxp/loxp小鼠；M 为 Marker
表1
两种小鼠繁殖学指标比较结果（
）
2.2 LentivirusCre-IRES-Luciferase和 LentivirusIRES-Luciferase体外功能验证
体外验证病毒载体功能的 IVIS 下显像结果见图 3，LentivirusCre-IRES-Luciferase和 LentivirusIRES-Luciferase均能顺利导入小鼠结肠癌细胞中并表现出荧光，间接验证了 Cre 重组酶的功能。
图3
示体外验证慢病毒载体功能在 IVIS 系统下的显像情况
a：为用 LentivirusIRES-Luciferase感染 MCA38 细胞；b：为用 LentivirusCre-IRES-Luciferase感染 MCA38 细胞；c：为未用病毒载体感染的 MCA38 细胞作为阴性对照
2.3 构建 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp双转基因小鼠散发性结直肠癌模型情况
图4
示 LentivirusCre-IRES-Luciferase和 LentivirusIRES-Luciferase感染双转基因模型小鼠结肠上皮细胞后第 4、8 及12 周时 IVIS 系统下的荧光情况
a：为LentivirusCre-IRES-Luciferase感染；b：为LentivirusIRES-Luciferase感染
2.3.1 Cre 重组酶诱导小鼠结肠上皮细胞突变
用慢病毒感染双转基因模型小鼠结肠上皮细胞，在注射后第 4 周时 2 组小鼠荧光信号基本相同，在第 8 周至第 12 周时 LentivirusCre-IRES-Luciferase组的荧光信号较前有增强，而 LentivirusIRES-Luciferase组荧光信号出现衰减，甚至在第 8 周后已完全检测不到。结果见图 4。
图5
示小鼠结肠上皮细胞 HE 染色结果
a：为构建的未被诱导突变模型小鼠肠道组织（HE ×100）；b：为模型小鼠经 Cre 酶诱导成瘤后的肿瘤组织（HE ×400）
2.3.2 瘤变组织病理学检查结果
与正常的小鼠结直肠细胞相比，经病毒感染瘤变的组织行 HE 染色后镜下可见细胞异型性增加，细胞核大而深染，核质比例增加，并散在黏液空泡，经病理检查证实为腺癌，见图 5。
3 讨论
散发性结直肠癌的进展过程遵循腺瘤→腺癌→转移的发展轴，其分子机制包括：染色体不稳定[6]、微卫星不稳定[7]及 CpG 岛甲基化表型[8]，由此可见，散发性结直肠癌发病机制的多样性使得单个动物模型难以模拟疾病进展全过程。
Hung 等[9]认为，一个理想的结直肠癌动物模型至少应该满足：① 仅有一个或少数几个原发成瘤病灶并具有一定的远处转移能力；② 原发病灶必须局限于结肠上皮细胞和肌层之间；③ 具有较短的成瘤周期及可预知的时间轴。本研究所构建的双转基因模型小鼠利用病毒载体注射诱导肠上皮细胞癌变，通过注射的深度来控制原发病灶的位置，同时还能通过注射病毒的滴度和剂量保证仅有少量原发病灶产生；由于观察时间较短及多数成瘤小鼠因肠梗阻导致死亡影响了对远处转移能力的评估，在后期的实验中可以利用肠道支架等方式延长模型小鼠的生命周期，以观察肿瘤转移情况。
结肠上皮细胞的更新依赖于结肠隐窝基底部的多能干细胞维持，当隐窝干细胞基因发生突变后，细胞的自我更新、克隆、增殖及分化超过了正常肠上皮细胞凋亡速度，则将导致腺瘤的形成。基因工程小鼠模型的巨大优势在于利用相对简易的基因修饰，实现目的基因在某一时段只在特定的组织表达或者失活，使模型具有特定的生物表型或特性，提供与散发性结肠癌相似的基因分子学改变，最大程度上模拟临床状态[10-11]，同时也减少基因重组对模型动物发育影响而导致的癌性损伤或胚胎死亡[12]，并且还能精确研究目的基因与疾病发生的关系[13]。本研究利用了慢病毒介导 Cre-loxp 重组酶系统感染小鼠结直肠隐窝上皮细胞，Cre 重组酶对结直肠隐窝-绒毛轴的上皮细胞进行选择性基因修饰，激活致癌基因，诱导肠上皮细胞瘤变进而成癌。
腺瘤的形成常常起始于抑癌基因（如 APC 基因等）失活，通过 Wnt 信号的持续激活导致腺瘤的形成；从腺瘤向腺癌的转变往往还需要额外的分子事件，如原癌基因 Kras 的激活；在散发性结肠癌中常可见到突变的 Kras，并与肿瘤侵袭性及对化疗药物耐药相关，常常预示着患者不好的预后[14]。此外，突变的 Kras 可以与失活的抑癌基因如 Smad4 协同作用，以增强促进肿瘤生长和侵袭性的 Wnt 信号[15]。Smad4 基因的表达缺失在早期胃肠道肿瘤中就可见到，特别是在低分化肿瘤细胞及印戒细胞癌中更为普遍。研究[16]发现，转化生长因子-β/Smad4 基因低表达将会导致结直肠癌具有更高的增殖和转移倾向。Luo 等[17]研究发现，在构建的 LSL-KrasG12D+ApcΔ14/+双转基因小鼠中，Cre 诱导的成瘤与那些单转基因 ApcΔ14/+小鼠相比，肿瘤细胞的分化程度更差，侵袭性更强，成瘤率也更高。本研究的前期预实验结果也证实了双转基因小鼠的成瘤率比单转基因高。需要注意的是，本研究所构建的双转基因模型小鼠的基因型为部分杂合，每一代小鼠均需用普通 PCR 进行基因检测；有趣的是，根据孟德尔遗传定律，后代小鼠中杂合概率理论上为 50%，但我们在研究过程中发现，后代小鼠杂合概率稳定于 85%～90%，其可能的机制有待进一步探究。
微型计算机断层扫描（microCT）、微型正电子发射断层扫描（microPET）等技术已被用于小动物肿瘤的体内成像[20]，但高成本和技术难度限制了这些成像技术的应用。因此，更符合成本效益原则，基于荧光和生物发光信号的光学成像技术得以广泛应用于肿瘤研究的各个领域。Qin 等[21]更是将表达有绿色荧光蛋白-荧光素酶 2-铁蛋白的质粒转染肝癌细胞，然后皮下注射到小鼠体内，构建了一种既可定量分析又可空间定位的肝癌模型。本研究模型利用慢病毒向肠上皮细胞内导入荧光素酶基因作为报告基因来示踪单个肠上皮细胞，使得可以在活体条件下研究单个肠上皮细胞的分化及转归。小动物活体显像技术使得人们可以在个体层面定量、无创及动态地观察动物体内的生理生化变化，提供了传统动物模型无法获得的重要信息[18]。在小鼠体内丰富的 ATP、氧气和外源性荧光素的条件下，荧光素酶催化产生低背景和高信噪比的荧光信号，可以在活体情况下定量分析肿瘤细胞的数量，可以动态地观察肿瘤的发生、发展过程[19]。
机体的免疫反应全程参与了结直肠癌的产生及进展过程，浸润于肿瘤组织和肿瘤周围区域的免疫细胞也被视为是影响患者预后的独立预测指标[22]。本研究以 C57BL/6J 小鼠为遗传背景所构建的模型与传统的裸鼠种植模型相比，完整保留了小鼠的免疫功能，后期的进一步研究中可以利用结肠镜系统在肿瘤发生、发展及转移过程中分别对原发灶及周围组织多次取材，用以探究局部免疫反应对结直肠癌发生、发展的影响。值得注意的是，机体的免疫反应对结直肠癌的发生和发展具有双重作用[23-25]，一方面，机体的免疫细胞能够特异性及非特异性地杀灭肿瘤细胞，从而发挥抑制肿瘤的作用；另一方面，肿瘤局部持续的免疫反应也可促进肿瘤生长、浸润及通过免疫逃避介导肿瘤转移。
总之，本研究所构建的双转基因小鼠模型保留了完整的免疫功能，能够在活体状态下动态研究机体免疫状态与结直肠癌发生、发展和转移的关系，同时该模型还进一步揭示了原癌基因 Kras 与抑癌基因 Smad4 之间的协同致癌作用。
结直肠癌发生是多步骤的过程，Kras 基因可以通过多种信号通路影响细胞不可控制的增殖和生长，参与结直肠癌发生的初始阶段，在约 50% 的原发性结直肠癌患者中可以检测到突变型 Kras[1]。Smad4 基因是细胞内信号传递介质家族成员，参与细胞生长和转录调控，扮演着肿瘤抑制因子的角色[2]；Smad4 表达缺失将导致结直肠上皮细胞增生活跃，导致腺瘤高发并呈现出癌变趋势，还通过包括上皮间质转化在内的机制表现出侵袭、转移倾向[3-4]。基因工程小鼠模型作为一种近年来发展迅速的动物模型，可以特异性地修饰感兴趣的目的基因，模拟与临床类似的肿瘤，为精确研究基因与疾病的关系提供了可能[5]。本课题组构建了同时表达 KrasLSL-G12D/-和 Smad4loxp/loxp的双转基因散发性结直肠癌小鼠模型，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料
1.1.1 实验动物
从美国杰克逊实验室（The Jackson Laboratory）购买的 SPF 级 B6.129S4-Krastm4Tyj/J （008179）和 Stock Smad4tm2.1Cxd/J（017462）雌雄小鼠各 1 对，C57BL/6J 小鼠来自本课题组前期保种。B6.129S4-Krastm4Tyj/J 小鼠是在 Kras 基因上游插入了 Loxp-stop-Loxp（LSL）序列，Stock Smad4tm2.1Cxd/J 小鼠是在 Smad4 基因上下游分别插入了 Loxp 序列。Cre 重组酶可特异性识别 LSL 序列，利用慢病毒载体将 Cre 基因转染入双转基因模型小鼠结直肠隐窝上皮细胞内，Cre 重组酶将对小鼠肠上皮细胞中 Kras 基因上游的终止序列以及 Smad4 基因序列进行特异性识别并切除，导致原癌基因 Kras 激活表达，诱导肠上皮细胞瘤变进而成癌。其基因重组模式见图 1。
图1
示 Cre 重组酶介导的基因重组模式图
1.1.2 主要材料
小鼠结肠镜系统，由 PENTAX FB-8V 改装，日本；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪，ABI 公司，美国；凝胶成像系统，VILBER，法国；琼脂糖凝胶电泳仪，六一生物公司，北京；鼠尾 DNA 提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司，北京；氯化钙（CaCl2）转染试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司，上海；IVIS 系统，PE 公司，美国；D-Luciferin，上海前尘生物科技有限公司，上海；引物，上海生工生物工程有限公司，上海。
1.2 动物饲养环境
实验小鼠饲养于武汉大学动物实验中心独立通气笼具系统（苏州市苏杭科技器材有限公司，苏州），室温 22～25 °C，相对湿度 60%～70%；小鼠饲养盒、垫料及饮用水均经过高温高压灭菌处理；小鼠繁殖饲料（北京华阜康生物科技股份有限公司，北京）经辐照灭菌。
1.3 双转基因模型小鼠的构建
1.3.1 双转基因模型小鼠的培育与筛选
首先将 B6.129S4-Krastm4Tyj/J 小鼠与 C57BL/6J 小鼠杂交和反复回交，转换其遗传背景，以增强其存活和繁殖能力。利用普通 PCR 筛选出 C57BL/6J-KrasLSL-G12D/-/J 杂合子小鼠（由于该型纯合子小鼠在母体子宫内已死亡，故只能筛选出杂合子小鼠，简记为 KrasLSL-G12D/-）。同时将 Stock Smad4tm2.1Cxd/J 小鼠转化遗传背景后通过杂交和回交并利用普通 PCR 筛选出纯合子小鼠，简记为 Smad4loxp/loxp。最后将 KrasLSL-G12D/-和 Smad4loxp/loxp小鼠杂交形成双杂合子的 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/-小鼠，再将此种基因型的双杂合子小鼠自交，利用普通 PCR 和侧交最终筛选出 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp品系小鼠，该小鼠即为本研究所构建的双转基因模型小鼠。
1.3.2 小鼠组织 DNA 提取
为提取实验小鼠 DNA 进行基因型的鉴定与筛选，剪取 2 周龄实验小鼠尾尖组织 4～6 mm 长，剪碎后置于 1.5 mL EP 管中，使用鼠尾 DNA 提取试剂盒提取小鼠组织 DNA，于 4 °C 保存备检。
1.3.3 KrasLSL-G12D/- 的检测
正向引物为5′-TGTCTTTCCCCAGCACAGT-3′（针对野生型）、5′-GCAGGTCGAGGGACCTAATA-3′（针对突变型）；反向引物均为5′-CTGCATAGTACGCTATACCCTGT-3′。PCR 扩增条件为：94 °C 变性 2 min；94 °C 15 s，60 °C15 s，72 °C 10 s，28 个循环；72 °C 2 min，4 °C 冷却保温。PCR 产物 1.5% 琼脂糖凝胶电泳 20 min，凝胶荧光成像系统下观察，KrasLSL-G12D/-小鼠应扩增出 100 bp 和 250 bp 的片段，而野生型小鼠仅扩增出 250 bp 的片段。
1.3.4 Smad4loxp/loxp的检测
正向引物为5′-TAAGAGCCACAGGGTCAAGC-3′，反向引物为5′-TTCCAGGAAAAACAGGGCTA-3′。PCR 扩增条件为：94 °C 预变性 2 min；94 °C 变性 20 s，65 °C 复性 15 s（每个循环温度降低 0.5 °C），68 °C 延伸10 s，10 个循环；接着再 94 °C 变性 15 s，60 °C 复性 15 s，72 °C延伸 10 s，共 28 个循环；72 °C 延伸2 min，4 °C 保存。将PCR 产物 3% 琼脂糖凝胶电泳30 min，Smad4loxp/loxp小鼠只扩增出 500 bp 的片段，而野生型小鼠则扩增出 500 bp 和 436 bp 的片段。
1.4 双转基因模型小鼠验证
1.4.1 构建病毒载体
利用CaCl2转染法进行病毒载体构建，慢病毒质粒为课题组前期构建的pHIV-Ubi-Puromycin-IRES-Luciferase和pHIV-Ubi-Puromycin-Cre-IRES-Luciferase（Luciferase 即荧光素酶基因用来示踪单个细胞，以研究单个细胞的行为变化）；包装质粒PMD2G（addgene12259）和PSPAX2（addgene12260），按照转染试剂盒说明书进行操作，收取病毒后进行纯化并测定病毒滴度， 然后于 –80 ℃下保存。将病毒载体分别简记为 Lentivirus IRES-Luciferase和 LentivirusCre-IRES-Luciferase。
1.4.2 体外验证 Cre 酶活性
取处于对数生长期状态良好的小鼠结肠癌细胞 MCA38 用于慢病毒感染。在 12 孔板中接种 MCA38，在 37 °C、体积分数为 5% CO2 的培养箱中培养，待细胞密度达到60%~70%时用慢病毒颗粒感染细胞，在 IVIS 系统下观察病毒载体体外感染效果。
1.4.3 Cre 重组酶诱导小鼠结肠上皮细胞突变
采用生理盐水灌肠去除直肠及远端结肠内的肠内容物，戊巴比妥钠（10 mg/mL，50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，小鼠结肠镜检查肠道清洁情况，同时确定感染的部位，利用微量注射器向小鼠肠黏膜下注射 LentivirusCre-IRES-Luciferase（108 pfu），对照组注射 LentivirusIRES-Luciferase（108 pfu）。感染 1 周后，于小鼠腹腔内注射 D-Luciferin（150 μg/mL，10 μL/g），IVIS 系统下观察荧光，调整病毒滴度和感染频率以获得仅 1～2 处成瘤病灶的小鼠模型（病毒滴度一般为108 pfu，每只小鼠注射量30 μL，用微量注射器通过结肠镜下注射于结直肠肠黏膜下，可见黏膜隆起是注射深度正确的标志，一般注射1或2处）。然后每4周利用IVIS系统监测双转基因模型小鼠成瘤情况。
1.4.4 组织病理学检查
待双转基因模型小鼠肿瘤形成后，将小鼠麻醉，解剖取出结肠并用 PBS 冲洗，在新制备的甲醛中固定 24 h，石蜡包埋切片后行苏木精-伊红（ HE ）染色，显微镜下观察肿瘤组织病理学变化，记录结肠上皮细胞瘤变情况。
1.5 统计学方法
统计分析使用 GraphPad Prism 6 软件。小鼠的繁殖学指标用均数±标准差（
±s）表示，双转基因模型小鼠与 C57BL/6J 小鼠的差异比较用独立样本 t 检验。检验水准 α=0.050。
2 结果
2.1 双转基因模型小鼠 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp的检测
目前共繁育出48只C57BL/6J小鼠，69只双转基因模型小鼠。构建的双转基因模型小鼠与 C57BL/6J 小鼠相比外形无明显差别，见图 2a。与 C57BL/6J 小鼠比较，双转基因模型小鼠的窝产仔数更多（P=0.038）、胎间隔时间短（P<0.001），见表 1。双转基因模型小鼠的基因鉴定结果见图 2b，其中 1、2 和 3 号小鼠基因型为 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp，为本研究所构建的双转基因模型小鼠；4 号小鼠是培育过程中另一种常见的基因型，为 Kras-/-+Smad4loxp/loxp，该型小鼠在实验过程中需剔除。
图2
示双转基因构建结果及基因鉴定结果
a：为第 8 周时双转基因模型小鼠（右边）与 C57BL/6J 小鼠（左边）相比，其外观无明显差别；b：为双转基因模型小鼠的基因鉴定结果，从左往右的电泳图依次为加 Kras 突变型引物、加 Kras 野生型引物和加 Smad4 引物；1、2 和 3 号泳道为构建的双转基因模型小鼠；4 号泳道为 Kras-/- +Smad4loxp/loxp小鼠；M 为 Marker
表1
两种小鼠繁殖学指标比较结果（
）
2.2 LentivirusCre-IRES-Luciferase和 LentivirusIRES-Luciferase体外功能验证
体外验证病毒载体功能的 IVIS 下显像结果见图 3，LentivirusCre-IRES-Luciferase和 LentivirusIRES-Luciferase均能顺利导入小鼠结肠癌细胞中并表现出荧光，间接验证了 Cre 重组酶的功能。
图3
示体外验证慢病毒载体功能在 IVIS 系统下的显像情况
a：为用 LentivirusIRES-Luciferase感染 MCA38 细胞；b：为用 LentivirusCre-IRES-Luciferase感染 MCA38 细胞；c：为未用病毒载体感染的 MCA38 细胞作为阴性对照
2.3 构建 KrasLSL-G12D/-+Smad4loxp/loxp双转基因小鼠散发性结直肠癌模型情况
图4
示 LentivirusCre-IRES-Luciferase和 LentivirusIRES-Luciferase感染双转基因模型小鼠结肠上皮细胞后第 4、8 及12 周时 IVIS 系统下的荧光情况
a：为LentivirusCre-IRES-Luciferase感染；b：为LentivirusIRES-Luciferase感染
2.3.1 Cre 重组酶诱导小鼠结肠上皮细胞突变
用慢病毒感染双转基因模型小鼠结肠上皮细胞，在注射后第 4 周时 2 组小鼠荧光信号基本相同，在第 8 周至第 12 周时 LentivirusCre-IRES-Luciferase组的荧光信号较前有增强，而 LentivirusIRES-Luciferase组荧光信号出现衰减，甚至在第 8 周后已完全检测不到。结果见图 4。
图5
示小鼠结肠上皮细胞 HE 染色结果
a：为构建的未被诱导突变模型小鼠肠道组织（HE ×100）；b：为模型小鼠经 Cre 酶诱导成瘤后的肿瘤组织（HE ×400）
2.3.2 瘤变组织病理学检查结果
与正常的小鼠结直肠细胞相比，经病毒感染瘤变的组织行 HE 染色后镜下可见细胞异型性增加，细胞核大而深染，核质比例增加，并散在黏液空泡，经病理检查证实为腺癌，见图 5。
3 讨论
散发性结直肠癌的进展过程遵循腺瘤→腺癌→转移的发展轴，其分子机制包括：染色体不稳定[6]、微卫星不稳定[7]及 CpG 岛甲基化表型[8]，由此可见，散发性结直肠癌发病机制的多样性使得单个动物模型难以模拟疾病进展全过程。
Hung 等[9]认为，一个理想的结直肠癌动物模型至少应该满足：① 仅有一个或少数几个原发成瘤病灶并具有一定的远处转移能力；② 原发病灶必须局限于结肠上皮细胞和肌层之间；③ 具有较短的成瘤周期及可预知的时间轴。本研究所构建的双转基因模型小鼠利用病毒载体注射诱导肠上皮细胞癌变，通过注射的深度来控制原发病灶的位置，同时还能通过注射病毒的滴度和剂量保证仅有少量原发病灶产生；由于观察时间较短及多数成瘤小鼠因肠梗阻导致死亡影响了对远处转移能力的评估，在后期的实验中可以利用肠道支架等方式延长模型小鼠的生命周期，以观察肿瘤转移情况。
结肠上皮细胞的更新依赖于结肠隐窝基底部的多能干细胞维持，当隐窝干细胞基因发生突变后，细胞的自我更新、克隆、增殖及分化超过了正常肠上皮细胞凋亡速度，则将导致腺瘤的形成。基因工程小鼠模型的巨大优势在于利用相对简易的基因修饰，实现目的基因在某一时段只在特定的组织表达或者失活，使模型具有特定的生物表型或特性，提供与散发性结肠癌相似的基因分子学改变，最大程度上模拟临床状态[10-11]，同时也减少基因重组对模型动物发育影响而导致的癌性损伤或胚胎死亡[12]，并且还能精确研究目的基因与疾病发生的关系[13]。本研究利用了慢病毒介导 Cre-loxp 重组酶系统感染小鼠结直肠隐窝上皮细胞，Cre 重组酶对结直肠隐窝-绒毛轴的上皮细胞进行选择性基因修饰，激活致癌基因，诱导肠上皮细胞瘤变进而成癌。
腺瘤的形成常常起始于抑癌基因（如 APC 基因等）失活，通过 Wnt 信号的持续激活导致腺瘤的形成；从腺瘤向腺癌的转变往往还需要额外的分子事件，如原癌基因 Kras 的激活；在散发性结肠癌中常可见到突变的 Kras，并与肿瘤侵袭性及对化疗药物耐药相关，常常预示着患者不好的预后[14]。此外，突变的 Kras 可以与失活的抑癌基因如 Smad4 协同作用，以增强促进肿瘤生长和侵袭性的 Wnt 信号[15]。Smad4 基因的表达缺失在早期胃肠道肿瘤中就可见到，特别是在低分化肿瘤细胞及印戒细胞癌中更为普遍。研究[16]发现，转化生长因子-β/Smad4 基因低表达将会导致结直肠癌具有更高的增殖和转移倾向。Luo 等[17]研究发现，在构建的 LSL-KrasG12D+ApcΔ14/+双转基因小鼠中，Cre 诱导的成瘤与那些单转基因 ApcΔ14/+小鼠相比，肿瘤细胞的分化程度更差，侵袭性更强，成瘤率也更高。本研究的前期预实验结果也证实了双转基因小鼠的成瘤率比单转基因高。需要注意的是，本研究所构建的双转基因模型小鼠的基因型为部分杂合，每一代小鼠均需用普通 PCR 进行基因检测；有趣的是，根据孟德尔遗传定律，后代小鼠中杂合概率理论上为 50%，但我们在研究过程中发现，后代小鼠杂合概率稳定于 85%～90%，其可能的机制有待进一步探究。
微型计算机断层扫描（microCT）、微型正电子发射断层扫描（microPET）等技术已被用于小动物肿瘤的体内成像[20]，但高成本和技术难度限制了这些成像技术的应用。因此，更符合成本效益原则，基于荧光和生物发光信号的光学成像技术得以广泛应用于肿瘤研究的各个领域。Qin 等[21]更是将表达有绿色荧光蛋白-荧光素酶 2-铁蛋白的质粒转染肝癌细胞，然后皮下注射到小鼠体内，构建了一种既可定量分析又可空间定位的肝癌模型。本研究模型利用慢病毒向肠上皮细胞内导入荧光素酶基因作为报告基因来示踪单个肠上皮细胞，使得可以在活体条件下研究单个肠上皮细胞的分化及转归。小动物活体显像技术使得人们可以在个体层面定量、无创及动态地观察动物体内的生理生化变化，提供了传统动物模型无法获得的重要信息[18]。在小鼠体内丰富的 ATP、氧气和外源性荧光素的条件下，荧光素酶催化产生低背景和高信噪比的荧光信号，可以在活体情况下定量分析肿瘤细胞的数量，可以动态地观察肿瘤的发生、发展过程[19]。
机体的免疫反应全程参与了结直肠癌的产生及进展过程，浸润于肿瘤组织和肿瘤周围区域的免疫细胞也被视为是影响患者预后的独立预测指标[22]。本研究以 C57BL/6J 小鼠为遗传背景所构建的模型与传统的裸鼠种植模型相比，完整保留了小鼠的免疫功能，后期的进一步研究中可以利用结肠镜系统在肿瘤发生、发展及转移过程中分别对原发灶及周围组织多次取材，用以探究局部免疫反应对结直肠癌发生、发展的影响。值得注意的是，机体的免疫反应对结直肠癌的发生和发展具有双重作用[23-25]，一方面，机体的免疫细胞能够特异性及非特异性地杀灭肿瘤细胞，从而发挥抑制肿瘤的作用；另一方面，肿瘤局部持续的免疫反应也可促进肿瘤生长、浸润及通过免疫逃避介导肿瘤转移。
总之，本研究所构建的双转基因小鼠模型保留了完整的免疫功能，能够在活体状态下动态研究机体免疫状态与结直肠癌发生、发展和转移的关系，同时该模型还进一步揭示了原癌基因 Kras 与抑癌基因 Smad4 之间的协同致癌作用。
