引用本文： 胡伟, 沈丰, 张桢, 吴红伟, 周文波. 胰腺癌组织中 Beclin-1 mRNA 和 miR-216a 的表达及 VEGF 蛋白表达与 p-MAPK-ERK1/2信号通路的关系. 中国普外基础与临床杂志, 2018, 25(7): 859-862. doi: 10.7507/1007-9424.201712086 复制
胰腺癌因早期诊断困难和恶性程度高，多数患者确诊时已处进展期或晚期[1-2]，故手术切除的疗效和预后差，死亡率居高不下[3]，因此探究胰腺癌的发生与发展机制意义重大。近年来诸多循证医学和病例研究提出，胰腺癌的发生发展与慢性胰腺炎密切相关[4-5]，而血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有介导血管生成的作用，可参与肿瘤转移时新生血管的发生[6-7]。肿瘤细胞具有极强的增殖能力，这与肿瘤细胞的凋亡下调或功能紊乱有关，Beclin-1（BH3-only domain autophagy protein-1）是酵母自噬基因 Atg6/Vps30 的同源基因，Beclin-1 自噬基因的过表达可发挥一定的肿瘤抑制作用[8]。除此之外，microRNA（miR）是在转录水平上调控基因表达的非编码单链 RNA，具有抑癌基因的作用，其中 miR-216a 与胰腺癌具有一定的相关性[9-10]。本研究回顾性收集了因胰腺疾病行手术治疗的 40 例患者的切除组织标本，提取手术切除组织的基因，对比不同胰腺组织中 Beclin-1 和 miR-216a 基因表达是否存在差异；并对病变组织行细胞培养，探究 VEGF 的表达是否与磷酸化丝裂原活化蛋白激酶（phosphor-mitogen-activated protein kinase，p-MAPK）-细胞外调节蛋白激酶 1/2（ERK1/2）信号通路的活化有关，进而寻找有效的分子靶标以实现胰腺癌的早期筛查。
1 临床资料
1.1 标本来源
回顾性收集 2012 年 1 月至 2017 年 4 月期间于湖北医药学院附属东风医院肝胆胰外科住院行手术治疗的 40 例胰腺疾病患者的术中标本，标本经由 2 名病理科医师诊断定性为：腺癌 8 例（腺癌组），鳞癌 8 例（鳞癌组），黏液性囊腺瘤 8 例（黏液性囊腺瘤组），慢性胰腺炎 8 例（慢性胰腺炎组）和正常胰腺组织 8 例（正常对照组，其中 3 例来源于胰腺浆液性囊腺瘤，3 例来源于胰腺假性囊肿，2 例来源于胰岛素瘤）。正常组织取自疑似胰腺良性肿瘤需行手术治疗的患者，术中切取微量肿物周围组织（沿肿瘤边缘以远 2 cm 切除肿瘤，并经术中快速冰冻病理学检查证实切缘阴性，取剩余正常胰腺组织邻近切缘处少许组织）。手术取材后立即转入–80 ℃ 冰箱保存并尽快行原代细胞培养和基因检测。40 例患者中，男 24 例，女 16 例；年龄 43～76 岁，中位年龄为 58.4 岁。以上患者均签署知情同意书，且术前均未行化疗、放疗和免疫治疗。
1.2 主要仪器和试剂
主要仪器：icycler 荧光定量 PCR 仪、i-mark 酶标仪、DDY-10 型三恒电泳仪、半干转槽和 GelDocEZ 全自动凝胶图象分析仪均购自美国 BIO-RAD 公司，Leica 光学显微镜购自德国 Leica Microsystems Ltd 公司，3111 型 CO2 孵箱和 FRESCO 17 冷冻离心机均购自美国 Thermo 公司，芯片生物扫描仪（2 100 B ioanalyzer）购自安捷伦科技（中国）有限公司。
主要试剂：Trizol 试剂和引物（β-actin 引物：前体链 5´-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3´，互补链 5´-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3´；Beclin-1 引物：前体链 5´-GAACTCACAGCTCCATTACT-3´，互补链 5´-GTTTCAATAAATGGCTCCT-3´，引物长度为 25 bp）均购自宝生物工程（大连）有限公司，DAB 显色试剂盒和 β-actin 小鼠抗人多克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术公司，胎牛血清购自美国 Gibco 公司，RPMI 1640 和无血清 RPMI 1640 培养基购于美国 Hyclone 公司，PD98095 购自美国 Sigma 公司。Anti-Beclin-1 兔抗人单克隆抗体购自美国 Epitomics 公司，miRNA 寡核苷酸基因芯片（p/n5190-0456）购自安捷伦科技（中国）有限公司，彩色预染蛋白质 Marker 购自赛默飞世尔科技有限公司，PD98095 Promega（V1191，ECL）购自美国 Bio-RAD 公司，二抗山羊抗鼠免疫球蛋白 G（IgG）/辣根过氧化物酶（HRP）、VEGF 一抗和磷酸化细胞外信号调节激酶 1/2（p-ERK1/2 ）一抗均购自美国 AbCam 公司。
1.3 实时荧光定量 PCR 法检测 Beclin-1 mRNA 的表达
采用 Trizol 法提取 5 组组织的总 RNA，依据逆转录试剂盒和 PCR 试剂盒说明（反应条件：94 ℃、20 s 预变性，1 个循环；55 ℃、30 s 变性，60 ℃、40 s 退火延伸，45 个循环。总体系为 30 μL）操作并进行 PCR 扩增。5 组组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平通过 β-actin 校正以减少误差。通过计算 Beclin-1 mRNA 的 ΔCt 值以计算 Beclin-1 mRNA 的表达水平，比较 5 组组织中 Beclin-1 mRNA 的表达。
1.4 基因芯片检测 miR-216a 的表达
以 Trizol 法提取 5 组组织的总 RNA，37 ℃ 孵育 30 min 去磷酸化后热变性，连接杂交后分别加入到 miR-216a 寡核苷酸基因芯片（型号为 v 12.0）中，操作步骤依据试剂盒说明进行。通过 2100 Bioanalyzer 扫描以检测 5 组组织中 miR-216a 的表达。每个样本重复测量 3 次，取平均值。
1.5 VEGF 蛋白的表达与 p-MAPK-ERK1/2 信号通路活化的相关性
1.5.1 原代细胞培养
将术中取到的病变组织剪碎并研磨细碎，加入适量含 10% 灭活胎牛血清的 RPMI1640 培养基与细碎组织混匀。移入细胞培养瓶后放入 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，适时更换培养基并搜集对数期细胞。细胞计数为 1×105个/mL后接种于 6 孔细胞培养板内（5 组标本，每组各培养 6 孔），并加入含 10%灭活胎牛血清的 RPMI1640 培养基培养。5 组培养的细胞中任选 3 孔（其余3 孔作为相应组织的空白对照组）加入 20 μL 的p-MAPK-ERK1/2 通路抑制剂 PD98095 刺激 48 h，进行相应蛋白的检测。每个复孔检测 3 次，以均值作为该复孔的检测结果。
1.5.2 Western blot 法检测 VEGF 和 p-ERK1/2 蛋白的表达
收集上述 5 组培养的细胞，用 PBS 缓冲液清洗后加入放射免疫沉淀分析（radio immunoprecipitation assay，RIPA）细胞裂解液，裂解完全后采用高速冷冻离心法提取总蛋白，并通过 BCA 蛋白检测试剂盒为所提取的蛋白定量。采用 Western blot 法检测 VEGF 和 p-ERK 1/2 蛋白的表达，以 β-actin 作为内参。每孔以 40 μg 可溶性蛋白含量加样到 8% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）中，电泳后电转至硝酸纤维素膜（PVDF）上，取封闭液室温封闭 1 h，漂洗 3 次后，分别加入 VEGF 一抗（1∶1 000）和 p-ERK1/2 一抗（1∶1 500）， 4 ℃冰箱过夜；以 TBST 清洗液洗 3 遍，将 PVDF 膜放入二抗 IgG/HRP 中，室温下轻摇孵育 2 h。洗膜3 次后在膜中央均匀滴加 DAB 显色剂曝光，迅速转移至成像分析仪中显影成像。计算目的条带与内参 β-actin 条带灰度值的比值，计算结果即为目的蛋白的相对表达量。每个复孔检测 3 次，以均值作为该复孔的检测结果。
1.6 统计学方法
采用 SPSS 17.0 统计软件进行分析。每个样本的结果为 3 次独立实验的均值。5 组间 Beclin-1 mRNA 和 miR-216a 的表达水平比较采用方差分析，两两比较采用 LSD 法；5 类细胞 PD98095 组和空白对照组的 p-ERK1/2 和 VEGF 蛋白的表达水平比较采用成组 t 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 5 组组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平
PCR 基因检测结果显示，与正常对照组比较，腺癌组和鳞癌组组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平较低，差异有统计学意义（P<0.05），但黏液性囊腺瘤组和慢性胰腺炎组组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平与正常对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；腺癌组、鳞癌组、黏液性囊腺瘤组和慢性胰腺炎组组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。具体见表 1。
表1
5 组组织中 Beclin-1 mRNA 和 miR-216a 的表达（
）
2.2 5 组组织中 miR-216a 的表达水平
基因芯片法检测结果显示，与正常对照组比较，腺癌组和鳞癌组组织中 miR-216a 的表达水平较低，差异有统计学意义（P<0.05），但黏液性囊腺瘤组和慢性胰腺炎组组织中 miR-216a 的表达水平与正常对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；腺癌组、鳞癌组、黏液性囊腺瘤组和慢性胰腺炎组组织中 miR-216a 的表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。具体见表 1。
2.3 5 组细胞中 p-ERK1/2 和 VEGF 蛋白的表达
2.3.1 PD98095 刺激后 5 组细胞中 p-ERK1/2 蛋白的表达
实验结果显示，腺癌组和鳞癌组中，未加入 PD98095 时细胞中 p-ERK1/2 细胞信号传导通路明显激活，PD98095 刺激后p-ERK1/2 蛋白的表达明显下调；黏液性囊腺瘤组和慢性胰腺炎组未加入 PD98095 处理时 p-ERK1/2 细胞信号传导通路轻度激活，而 PD98095 刺激后 p-ERK1/2 蛋白的表达稍有下调。正常对照组几乎无变化。具体见图 1。
与同类组织的空白对照组比较，腺癌组和鳞癌组加入 PD98095 后，细胞中 p-ERK1/2 蛋白的表达水平下调（P<0.05），但黏液性囊腺瘤组、慢性胰腺炎组和正常对照组加入 PD98095 前后细胞中p-ERK1/2 蛋白的表达水平变化不大，差异无统计学意义（P>0.05）。具体见图 2a。
图1
示 5 种细胞中 p-ERK1/2 蛋白表达的电泳图
①：空白对照组，②：PD98095 组
图2
示 5 种细胞中 p-ERK1/2 蛋白和 VEGF 蛋白的表达水平
a：p-ERK1/2 蛋白；b：VEGF 蛋白；①：腺癌；②：鳞癌；③：黏液性囊腺瘤；④：慢性胰腺炎；⑤：正常胰腺；与同类型细胞的空白对照组比较，*
2.3.2 PD98095 刺激后 5 组细胞中 VEGF 蛋白的表达
实验结果显示，腺癌组和鳞癌组中，未加入 PD98095 时细胞中 VEGF 蛋白表达明显，PD98095 刺激后 VEGF 蛋白的表达明显下调；黏液性囊腺瘤组和慢性胰腺炎组未加入 PD98095 处理时 VEGF 蛋白表达也较明显，而 PD98095 刺激后 VEGF 蛋白的表达轻微下降。正常对照组几乎无变化。
与同类组织的空白对照组比较，腺癌组和鳞癌组加入 PD98095 后，细胞中 VEGF 蛋白的表达下调（P<0.05），但黏液性囊腺瘤组、慢性胰腺炎组和正常对照组加入 PD98095 前后细胞中 p-MAPK-ERK1/2 蛋白的表达水平变化不大，差异无统计学意义（P>0.05）。具体见图 2b。
3 讨论
胰腺癌作为病死率较高的肿瘤，其发病机制尚不明确，发生发展过程复杂，早期诊治困难，术后患者的 5 年生存率在 5%以下[11]。而目前检测胰腺癌的相关指标和基因过于单一，对于多基因调控的胰腺癌来说过于片面[12]。因此，探索多基因和转录后蛋白质的表达变化与胰腺癌之间的关系，对其发病机制的研究尤为重要。
Beclin-1 mRNA 作为自噬诱导基因，可发挥抗肿瘤的作用，Beclin-1 mRNA 参与人类皮肤黑素细胞癌的发生与发展过程，在肿瘤生存的不同阶段其表达水平存在差异[13]。本研究通过对比 Beclin-1 mRNA 在胰腺癌、胰腺良性肿瘤和慢性胰腺炎组织中的表达，发现与正常胰腺组织相比，胰腺癌（腺癌和鳞癌）组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平明显下调，而在胰腺良性肿瘤和慢性胰腺炎中下调不明显。因此笔者认为，Beclin-1 mRNA 与胰腺癌的发生和发展有一定相关性，这与 Beclin-1 mRNA 诱导肿瘤细胞的自噬有关。
Szafranska 等[14]发现，胰腺组织以 miR-216a 等的表达为特征，在胰腺炎患者血清中明显升高，其特异性较血淀粉酶和脂肪酶更高，是急性胰腺炎的特异分子标志物。Kong 等[15]发现，miR-216a 在胰腺炎组织中的表达与正常胰腺组织的表达相近，而在胰腺癌组织中 miR-216a 的表达明显低于正常组织[16]。本研究通过基因芯片技术发现，较正常胰腺组织相比，胰腺癌组织（腺癌和鳞癌）中 miR-216a 的表达水平明显下调，而在胰腺良性肿瘤和慢性胰腺炎中下调不明显。因此笔者认为，miR-216a 与胰腺癌的发生发展有一定相关性，这与 miR-216a 可发挥抑癌基因的作用有关。
VEGF 蛋白的过表达是介导肿瘤新生血管大量形成的主要原因，在胰腺癌的发展中起重要作用，是造成肿瘤转移和血管泛化的原因之一[17]。本研究通过对比加入 p-ERK1/2 通路特异性抑制剂 PD98095 后的胰腺癌细胞与未加入抑制剂的胰腺癌细胞中 VEGF 和 p-ERK1/2 蛋白的表达，发现加入 PD98095 的胰腺癌细胞中 VEGF 蛋白的表达明显下调，提示 VEGF 蛋白通过 p-ERK1/2 通路高表达，这可能与胰腺癌的发展有一定相关性。而加入p-ERK1/2 通路特异性抑制剂 PD98095 后的胰腺良性肿瘤和慢性胰腺炎细胞与未加入抑制剂的同类细胞相比，VEGF 和 p-ERK1/2 蛋白的表达仅出现轻微下调。因此，笔者认为，胰腺癌细胞内 VEGF 蛋白的高表达与 p-ERK1/2 通路的激活存在相关性。
鉴于本研究纳入的样本量较少，且研究的相关基因和细胞信号通路也比较有限，还不能提出如何能早期诊断胰腺癌，以及如何抑制胰腺癌进展的有效方案，故仍需进一步研究。在未来的研究中，我们将纳入更多的病例，期待从分子机制入手，在阐明胰腺癌发病机制的同时为胰腺癌提供可靠的诊疗方案。
胰腺癌因早期诊断困难和恶性程度高，多数患者确诊时已处进展期或晚期[1-2]，故手术切除的疗效和预后差，死亡率居高不下[3]，因此探究胰腺癌的发生与发展机制意义重大。近年来诸多循证医学和病例研究提出，胰腺癌的发生发展与慢性胰腺炎密切相关[4-5]，而血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有介导血管生成的作用，可参与肿瘤转移时新生血管的发生[6-7]。肿瘤细胞具有极强的增殖能力，这与肿瘤细胞的凋亡下调或功能紊乱有关，Beclin-1（BH3-only domain autophagy protein-1）是酵母自噬基因 Atg6/Vps30 的同源基因，Beclin-1 自噬基因的过表达可发挥一定的肿瘤抑制作用[8]。除此之外，microRNA（miR）是在转录水平上调控基因表达的非编码单链 RNA，具有抑癌基因的作用，其中 miR-216a 与胰腺癌具有一定的相关性[9-10]。本研究回顾性收集了因胰腺疾病行手术治疗的 40 例患者的切除组织标本，提取手术切除组织的基因，对比不同胰腺组织中 Beclin-1 和 miR-216a 基因表达是否存在差异；并对病变组织行细胞培养，探究 VEGF 的表达是否与磷酸化丝裂原活化蛋白激酶（phosphor-mitogen-activated protein kinase，p-MAPK）-细胞外调节蛋白激酶 1/2（ERK1/2）信号通路的活化有关，进而寻找有效的分子靶标以实现胰腺癌的早期筛查。
1 临床资料
1.1 标本来源
回顾性收集 2012 年 1 月至 2017 年 4 月期间于湖北医药学院附属东风医院肝胆胰外科住院行手术治疗的 40 例胰腺疾病患者的术中标本，标本经由 2 名病理科医师诊断定性为：腺癌 8 例（腺癌组），鳞癌 8 例（鳞癌组），黏液性囊腺瘤 8 例（黏液性囊腺瘤组），慢性胰腺炎 8 例（慢性胰腺炎组）和正常胰腺组织 8 例（正常对照组，其中 3 例来源于胰腺浆液性囊腺瘤，3 例来源于胰腺假性囊肿，2 例来源于胰岛素瘤）。正常组织取自疑似胰腺良性肿瘤需行手术治疗的患者，术中切取微量肿物周围组织（沿肿瘤边缘以远 2 cm 切除肿瘤，并经术中快速冰冻病理学检查证实切缘阴性，取剩余正常胰腺组织邻近切缘处少许组织）。手术取材后立即转入–80 ℃ 冰箱保存并尽快行原代细胞培养和基因检测。40 例患者中，男 24 例，女 16 例；年龄 43～76 岁，中位年龄为 58.4 岁。以上患者均签署知情同意书，且术前均未行化疗、放疗和免疫治疗。
1.2 主要仪器和试剂
主要仪器：icycler 荧光定量 PCR 仪、i-mark 酶标仪、DDY-10 型三恒电泳仪、半干转槽和 GelDocEZ 全自动凝胶图象分析仪均购自美国 BIO-RAD 公司，Leica 光学显微镜购自德国 Leica Microsystems Ltd 公司，3111 型 CO2 孵箱和 FRESCO 17 冷冻离心机均购自美国 Thermo 公司，芯片生物扫描仪（2 100 B ioanalyzer）购自安捷伦科技（中国）有限公司。
主要试剂：Trizol 试剂和引物（β-actin 引物：前体链 5´-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3´，互补链 5´-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3´；Beclin-1 引物：前体链 5´-GAACTCACAGCTCCATTACT-3´，互补链 5´-GTTTCAATAAATGGCTCCT-3´，引物长度为 25 bp）均购自宝生物工程（大连）有限公司，DAB 显色试剂盒和 β-actin 小鼠抗人多克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术公司，胎牛血清购自美国 Gibco 公司，RPMI 1640 和无血清 RPMI 1640 培养基购于美国 Hyclone 公司，PD98095 购自美国 Sigma 公司。Anti-Beclin-1 兔抗人单克隆抗体购自美国 Epitomics 公司，miRNA 寡核苷酸基因芯片（p/n5190-0456）购自安捷伦科技（中国）有限公司，彩色预染蛋白质 Marker 购自赛默飞世尔科技有限公司，PD98095 Promega（V1191，ECL）购自美国 Bio-RAD 公司，二抗山羊抗鼠免疫球蛋白 G（IgG）/辣根过氧化物酶（HRP）、VEGF 一抗和磷酸化细胞外信号调节激酶 1/2（p-ERK1/2 ）一抗均购自美国 AbCam 公司。
1.3 实时荧光定量 PCR 法检测 Beclin-1 mRNA 的表达
采用 Trizol 法提取 5 组组织的总 RNA，依据逆转录试剂盒和 PCR 试剂盒说明（反应条件：94 ℃、20 s 预变性，1 个循环；55 ℃、30 s 变性，60 ℃、40 s 退火延伸，45 个循环。总体系为 30 μL）操作并进行 PCR 扩增。5 组组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平通过 β-actin 校正以减少误差。通过计算 Beclin-1 mRNA 的 ΔCt 值以计算 Beclin-1 mRNA 的表达水平，比较 5 组组织中 Beclin-1 mRNA 的表达。
1.4 基因芯片检测 miR-216a 的表达
以 Trizol 法提取 5 组组织的总 RNA，37 ℃ 孵育 30 min 去磷酸化后热变性，连接杂交后分别加入到 miR-216a 寡核苷酸基因芯片（型号为 v 12.0）中，操作步骤依据试剂盒说明进行。通过 2100 Bioanalyzer 扫描以检测 5 组组织中 miR-216a 的表达。每个样本重复测量 3 次，取平均值。
1.5 VEGF 蛋白的表达与 p-MAPK-ERK1/2 信号通路活化的相关性
1.5.1 原代细胞培养
将术中取到的病变组织剪碎并研磨细碎，加入适量含 10% 灭活胎牛血清的 RPMI1640 培养基与细碎组织混匀。移入细胞培养瓶后放入 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，适时更换培养基并搜集对数期细胞。细胞计数为 1×105个/mL后接种于 6 孔细胞培养板内（5 组标本，每组各培养 6 孔），并加入含 10%灭活胎牛血清的 RPMI1640 培养基培养。5 组培养的细胞中任选 3 孔（其余3 孔作为相应组织的空白对照组）加入 20 μL 的p-MAPK-ERK1/2 通路抑制剂 PD98095 刺激 48 h，进行相应蛋白的检测。每个复孔检测 3 次，以均值作为该复孔的检测结果。
1.5.2 Western blot 法检测 VEGF 和 p-ERK1/2 蛋白的表达
收集上述 5 组培养的细胞，用 PBS 缓冲液清洗后加入放射免疫沉淀分析（radio immunoprecipitation assay，RIPA）细胞裂解液，裂解完全后采用高速冷冻离心法提取总蛋白，并通过 BCA 蛋白检测试剂盒为所提取的蛋白定量。采用 Western blot 法检测 VEGF 和 p-ERK 1/2 蛋白的表达，以 β-actin 作为内参。每孔以 40 μg 可溶性蛋白含量加样到 8% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）中，电泳后电转至硝酸纤维素膜（PVDF）上，取封闭液室温封闭 1 h，漂洗 3 次后，分别加入 VEGF 一抗（1∶1 000）和 p-ERK1/2 一抗（1∶1 500）， 4 ℃冰箱过夜；以 TBST 清洗液洗 3 遍，将 PVDF 膜放入二抗 IgG/HRP 中，室温下轻摇孵育 2 h。洗膜3 次后在膜中央均匀滴加 DAB 显色剂曝光，迅速转移至成像分析仪中显影成像。计算目的条带与内参 β-actin 条带灰度值的比值，计算结果即为目的蛋白的相对表达量。每个复孔检测 3 次，以均值作为该复孔的检测结果。
1.6 统计学方法
采用 SPSS 17.0 统计软件进行分析。每个样本的结果为 3 次独立实验的均值。5 组间 Beclin-1 mRNA 和 miR-216a 的表达水平比较采用方差分析，两两比较采用 LSD 法；5 类细胞 PD98095 组和空白对照组的 p-ERK1/2 和 VEGF 蛋白的表达水平比较采用成组 t 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 5 组组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平
PCR 基因检测结果显示，与正常对照组比较，腺癌组和鳞癌组组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平较低，差异有统计学意义（P<0.05），但黏液性囊腺瘤组和慢性胰腺炎组组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平与正常对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；腺癌组、鳞癌组、黏液性囊腺瘤组和慢性胰腺炎组组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。具体见表 1。
表1
5 组组织中 Beclin-1 mRNA 和 miR-216a 的表达（
）
2.2 5 组组织中 miR-216a 的表达水平
基因芯片法检测结果显示，与正常对照组比较，腺癌组和鳞癌组组织中 miR-216a 的表达水平较低，差异有统计学意义（P<0.05），但黏液性囊腺瘤组和慢性胰腺炎组组织中 miR-216a 的表达水平与正常对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；腺癌组、鳞癌组、黏液性囊腺瘤组和慢性胰腺炎组组织中 miR-216a 的表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。具体见表 1。
2.3 5 组细胞中 p-ERK1/2 和 VEGF 蛋白的表达
2.3.1 PD98095 刺激后 5 组细胞中 p-ERK1/2 蛋白的表达
实验结果显示，腺癌组和鳞癌组中，未加入 PD98095 时细胞中 p-ERK1/2 细胞信号传导通路明显激活，PD98095 刺激后p-ERK1/2 蛋白的表达明显下调；黏液性囊腺瘤组和慢性胰腺炎组未加入 PD98095 处理时 p-ERK1/2 细胞信号传导通路轻度激活，而 PD98095 刺激后 p-ERK1/2 蛋白的表达稍有下调。正常对照组几乎无变化。具体见图 1。
与同类组织的空白对照组比较，腺癌组和鳞癌组加入 PD98095 后，细胞中 p-ERK1/2 蛋白的表达水平下调（P<0.05），但黏液性囊腺瘤组、慢性胰腺炎组和正常对照组加入 PD98095 前后细胞中p-ERK1/2 蛋白的表达水平变化不大，差异无统计学意义（P>0.05）。具体见图 2a。
图1
示 5 种细胞中 p-ERK1/2 蛋白表达的电泳图
①：空白对照组，②：PD98095 组
图2
示 5 种细胞中 p-ERK1/2 蛋白和 VEGF 蛋白的表达水平
a：p-ERK1/2 蛋白；b：VEGF 蛋白；①：腺癌；②：鳞癌；③：黏液性囊腺瘤；④：慢性胰腺炎；⑤：正常胰腺；与同类型细胞的空白对照组比较，*
2.3.2 PD98095 刺激后 5 组细胞中 VEGF 蛋白的表达
实验结果显示，腺癌组和鳞癌组中，未加入 PD98095 时细胞中 VEGF 蛋白表达明显，PD98095 刺激后 VEGF 蛋白的表达明显下调；黏液性囊腺瘤组和慢性胰腺炎组未加入 PD98095 处理时 VEGF 蛋白表达也较明显，而 PD98095 刺激后 VEGF 蛋白的表达轻微下降。正常对照组几乎无变化。
与同类组织的空白对照组比较，腺癌组和鳞癌组加入 PD98095 后，细胞中 VEGF 蛋白的表达下调（P<0.05），但黏液性囊腺瘤组、慢性胰腺炎组和正常对照组加入 PD98095 前后细胞中 p-MAPK-ERK1/2 蛋白的表达水平变化不大，差异无统计学意义（P>0.05）。具体见图 2b。
3 讨论
胰腺癌作为病死率较高的肿瘤，其发病机制尚不明确，发生发展过程复杂，早期诊治困难，术后患者的 5 年生存率在 5%以下[11]。而目前检测胰腺癌的相关指标和基因过于单一，对于多基因调控的胰腺癌来说过于片面[12]。因此，探索多基因和转录后蛋白质的表达变化与胰腺癌之间的关系，对其发病机制的研究尤为重要。
Beclin-1 mRNA 作为自噬诱导基因，可发挥抗肿瘤的作用，Beclin-1 mRNA 参与人类皮肤黑素细胞癌的发生与发展过程，在肿瘤生存的不同阶段其表达水平存在差异[13]。本研究通过对比 Beclin-1 mRNA 在胰腺癌、胰腺良性肿瘤和慢性胰腺炎组织中的表达，发现与正常胰腺组织相比，胰腺癌（腺癌和鳞癌）组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平明显下调，而在胰腺良性肿瘤和慢性胰腺炎中下调不明显。因此笔者认为，Beclin-1 mRNA 与胰腺癌的发生和发展有一定相关性，这与 Beclin-1 mRNA 诱导肿瘤细胞的自噬有关。
Szafranska 等[14]发现，胰腺组织以 miR-216a 等的表达为特征，在胰腺炎患者血清中明显升高，其特异性较血淀粉酶和脂肪酶更高，是急性胰腺炎的特异分子标志物。Kong 等[15]发现，miR-216a 在胰腺炎组织中的表达与正常胰腺组织的表达相近，而在胰腺癌组织中 miR-216a 的表达明显低于正常组织[16]。本研究通过基因芯片技术发现，较正常胰腺组织相比，胰腺癌组织（腺癌和鳞癌）中 miR-216a 的表达水平明显下调，而在胰腺良性肿瘤和慢性胰腺炎中下调不明显。因此笔者认为，miR-216a 与胰腺癌的发生发展有一定相关性，这与 miR-216a 可发挥抑癌基因的作用有关。
VEGF 蛋白的过表达是介导肿瘤新生血管大量形成的主要原因，在胰腺癌的发展中起重要作用，是造成肿瘤转移和血管泛化的原因之一[17]。本研究通过对比加入 p-ERK1/2 通路特异性抑制剂 PD98095 后的胰腺癌细胞与未加入抑制剂的胰腺癌细胞中 VEGF 和 p-ERK1/2 蛋白的表达，发现加入 PD98095 的胰腺癌细胞中 VEGF 蛋白的表达明显下调，提示 VEGF 蛋白通过 p-ERK1/2 通路高表达，这可能与胰腺癌的发展有一定相关性。而加入p-ERK1/2 通路特异性抑制剂 PD98095 后的胰腺良性肿瘤和慢性胰腺炎细胞与未加入抑制剂的同类细胞相比，VEGF 和 p-ERK1/2 蛋白的表达仅出现轻微下调。因此，笔者认为，胰腺癌细胞内 VEGF 蛋白的高表达与 p-ERK1/2 通路的激活存在相关性。
鉴于本研究纳入的样本量较少，且研究的相关基因和细胞信号通路也比较有限，还不能提出如何能早期诊断胰腺癌，以及如何抑制胰腺癌进展的有效方案，故仍需进一步研究。在未来的研究中，我们将纳入更多的病例，期待从分子机制入手，在阐明胰腺癌发病机制的同时为胰腺癌提供可靠的诊疗方案。
