引用本文： 柯能文, 刘续宝. Beclin-1 分子在胰腺癌组织中的表达及其临床意义. 中国普外基础与临床杂志, 2017, 24(6): 671-679. doi: 10.7507/1007-9424.201704018 复制
胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocar cinoma，PDAC）是一种常见的消化系统恶性肿瘤。在所有肿瘤中，其发病率位居第 12 位，但死亡率却位居第 4 位[1-3]。目前胰腺癌的治疗方法以手术切除为主，辅助以化学治疗、放射治疗等。但经上述方法治疗后，患者的 1 年生存率仍低于 25%[4-5]，可手术切除者的 5 年生存率也不超过 5%[4-5]。自噬作为Ⅱ型程序性细胞死亡方式，是维持细胞自我平衡的重要机制，在肿瘤形成过程中发挥重要作用[6-9]。目前研究者对自噬与肿瘤的关系持两种截然相反的观点：一种认为自噬对肿瘤起保护作用，促进肿瘤的生长[10]；另外一种认为自噬是抑制肿瘤生长的重要因素[11-12]。在众多的自噬基因中，Beclin-1 基因是第一个被发现的哺乳动物“自噬基因”[13]。同时 Beclin-1 分子也是连接自噬与凋亡通道的关键分子之一[14]。胰腺癌相关研究中涉及自噬和 Beclin-1 基因的研究较少。有研究[15-16]表明，抑制胰腺癌细胞中的自噬过程，可促进胰腺癌的形成，提示自噬的存在对胰腺癌发挥抑制效应。仅有的数个关于 Beclin-1 基因的研究[17-18]得出的结论又相互矛盾。Akar 等[19]研究发现，抑制蛋白激酶 C-β/谷氨酰胺转胺酶 2（PKC-β/TG2）信号通路后，Beclin-1 蛋白的表达上调，促进胰腺癌细胞的自噬，从而抑制胰腺癌细胞的生长。另有研究[20]却表明，抑制 Beclin-1 蛋白的表达可促进胰腺癌细胞的自噬发生。为进一步探讨自噬基因 Beclin-1 基因在胰腺癌中的确切作用，笔者进行了本研究。
1 资料与方法
1.1 标本来源
本组 45 例组织石蜡标本来源于 2009 年 4 月至 2009 年 11 月期间在四川大学华西医院住院的手术患者，包括 25 例胰腺癌标本和 20 例正常胰腺组织标本。25 例胰腺癌患者的年龄为 16～80 岁，中位年龄为 52.2 岁，其中≤52 岁者 9 例，>52 岁者 16 例；男 12 例，女 13 例；临床分期：ⅠA 期 0 例，ⅠB 期 3 例，ⅡA 期 3 例，ⅡB 期 4 例，Ⅲ期 9 例，Ⅳ期 6 例；局部肿瘤直径（可估计的病灶最大直径）：≤3 cm 者 5 例，>3 cm 者 20 例；淋巴结转移：阳性 17 例，阴性 8 例；肿瘤分化程度：高分化 11 例，中低分化 14 例。所有标本的诊断均经术后病理学检查证实。20 例正常胰腺组织标本的来源：同期因胰腺体尾部 β 细胞瘤、脾切除时胰腺尾部无法与脾脏完全分离而予以切除的正常胰腺组织（14 例，距肿瘤边缘 2 cm 以上取组织），部分正常胰腺组织标本（6 例）来源于胰腺外伤患者，所有正常胰腺组织标本均经术后病理学检查证实为正常胰腺组织。20 例患者中，男 11 例，女 9 例；年龄 19～64 岁，中位年龄为 47 岁。为了排除肿瘤和慢性炎症对周围组织的影响，笔者并未采取同一胰腺癌患者的癌旁组织作为正常组织的对照。45 例患者术前均未接受任何放疗和化疗。45 例患者的临床病理资料均完整，病理诊断均由笔者所在医院病理科复核。该研究通过四川大学华西医院伦理委员会批准，所有受试对象均签署了知情同意书。
1.2 主要试剂和设备
主要试剂和材料包括：免疫组化 SP 试剂盒（美国 Sigma 公司），Anti-Beclin-1 兔抗人多克隆抗体（B6061）及 MTT 试剂盒（美国 Sigma 公司），PrimeScript® RT reagent Kit、BamHⅠ、MluⅠ及 Taq polymerase（日本 TaKara 公司），PLenO-WPI 载体（美国 Invabio 公司），用于酶切的工作酶 PmeⅠ（美国 NEB 公司），AxyPrep 质粒小量制备试剂盒和 AxyPrep 质粒大量制备试剂盒（美国 Axygen 公司），制备感受态试剂盒（美国 BIOSCIENCES 公司），SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒〔DRR081S，宝生物工程（大连）有限公司〕，superfect 转染试剂盒（德国 qiagen 公司）。239T 细胞和 PANC-1 细胞株均来源于中国科学院细胞库。
主要软件及设备包括：PowerPac 稳压 DNA 电泳仪、iCycler iQTM 荧光实时多波长 PCR 仪、BIO-RAD680 酶标仪、Mini-PROTEAN Tetra 蛋白电泳仪及 Gel Doc 1000 凝胶成像系统均来源于美国 BIO-RAD 公司，Image-Pro Plus Version 6.0 分析软件来源于美国 Media Cybernetics 公司。
1.3 PCR 法检测人胰腺癌及正常胰腺组织中 Beclin-1 mRNA 的表达
取 30～50 mg 胰腺癌或正常胰腺组织块，剪碎后置入装有 0.5 mL RNAisoTM Plus 液的 1.5 mL EP 管中，立刻采用匀浆法破碎细胞，再加入 0.5 mL RNAisoTM Plus 液，移液器吹打（>50 次）。将 EP 管置于冰上片刻后，于 4 ℃ 条件下离心 10 min（12 000 r/min，r=8 cm）。取上清转移至经焦碳酸二乙酯（DEPC）预处理的 EP 管中。室温放置 5 min 使样品充分裂解。在上述液体中加入 0.2 mL 氯仿，晃动 15 s，室温放置 10 min。于 4 ℃ 下离心 10 min（12 000 r/min，r=8 cm），提取 RNA。提取的总 RNA 行 1% 琼脂糖凝胶电泳检验。检验合格后，以提取的总 RNA 作为模板，采用 PrimeScript® RT reagent Kit 试剂盒提供的 Random 6 mers 及 Oligo（dT）引物，利用逆转录酶将 RNA 逆转录成 cDNA。再行实时荧光定量 PCR。Beclin-1 基因引物：正义链 5′-GATTGAA-GACACAGGAGGCAGT-3′，反义链 5′-GTGAGG-ACACCCAAGCAAGAC-3′（扩增长度为 97 bp）。β-actin 为内参基因：正义链 5′-GTGGACATCCG-CAAAGAC-3′，反义链 5′-AAAGGGTGTAACG-CAACTA-3′（扩增长度为 302 bp），上述引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。PCR 反应体系及反应条件按试剂盒说明书操作。PCR 扩增在 iCycler iQTM 荧光实时多波长 PCR 仪上进行，扩增采用两步法 PCR 扩增标准程序。第一步：95 ℃ 30 s，40 个循环；第二步：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。所有标本的 Beclin-1 mRNA 的相对表达量均经看家基因 β-actin 的校正，以减少实验误差。
1.4 免疫组化染色检测胰腺癌及正常胰腺组织中 Beclin-1 蛋白的表达
免疫组化染色步骤是：首先对组织进行固定、切片脱蜡至水后，置于 3% H2O2 溶液中，37 ℃ 孵育 10 min，以 PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次 5 min。置于枸橼酸缓冲液中（95 ℃）15～20 min，自然冷却 20 min 以上，冷水冲洗以加快冷却至室温，再以 PBS 缓冲液冲洗 3～5 min。加入正常羊血清工作液 10 mL 封闭，37 ℃ 孵育 10 min。滴加 Anti-Beclin-1 兔抗人多克隆抗体，比例为 1∶60，4 ℃ 冰箱孵育过夜，再以 PBS 缓冲液冲洗 3～5 min。用 PBS 缓冲液代替一抗作为阴性对照，以乳腺癌标本作为阳性对照。滴加生物素标记的二抗（1∶100），37 ℃ 孵育 30 min。滴加链亲和素——生物素过氧化物酶复合物，工作浓度为 1∶100，37 ℃ 恒温孵育 30 min。以 DAB/H2O2 显色，自来水充分冲洗后，以苏木精复染，75%、80%、85%、95% 及 100% 乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察结果。首先在 100 倍光镜下观察全片，选择 5 个阳性物质丰富的视野，然后采用 Image-Pro Plus Version 6.0 分析软件在 400 倍光镜下测定阳性物质的积分光密度（integated optical density，IOD）值，取 5 个视野的均值，分析 Beclin-1 蛋白的表达情况。IOD 值越高表明 Beclin-1 蛋白表达水平越高。
1.5 HE 染色
本实验的 HE 染色按常规操作进行。
1.6 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体的构建
提取人正常胰腺组织中（20 例中的任一例）的总 RNA（操作按试剂盒说明书进行）。于美国国立生物技术信息中心（NCBI）基因文库中获得人 Beclin-1 cDNA 序列（NM_003766），再根据 PLenO-WPI 载体的插入位点，设计扩增 Beclin-l 基因的一对引物。为了方便检测，在引物两端分别加入 BamHⅠ和 MluⅠ酶切位点，同时设计保护性碱基。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列：正义链 5′-C GGATCCATGGAA-GGGTCTAAGACGTCCAACA-3′（5′端下划线部分为 BamHⅠ酶切位点，斜体部分为保护性碱基）；反义链 5′-C ACGCGTTCATTTGTTATAAAATTGTG-AGG-3′（5′端下划线部分为 MluⅠ酶切位点，斜体部分为保护性碱基）。以提取的总 RNA 为模版，通过上述引物和逆转录，扩增出 Beclin-1 cDNA（PCR 法，按 PrimeScript® RT reagent Kit 试剂盒说明书进行）。Beclin-1 cDNA 通过 BamHⅠ、MluⅠ双酶切后，与 PLenO-WPI 载体连接，反应在 T4DNA 连接酶作用下进行。PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体完成后，行限制性内切酶 MluⅠ、BamHⅠ双酶切来鉴定是否有目的片段插入。酶切产物行 1% 琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察结果。同时通过 PCR 方法（PCR 操作按试剂盒说明书进行），扩增重组载体以再次确定是否有正确的 Beclin-1 基因插入 PLenO-WPI 载体。取经酶切反应及 PCR 反应均鉴定正确的克隆，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，将序列测定结果与 NCBI 数据库公布的人 Beclin-l 基因序列进行比对和分析。最后将 PLenO-WPI-Beclin-1 重组载体转染至 239T 细胞包装（转染按转染试剂盒说明书进行）。
1.7 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体转染 PANC-1 胰腺癌细胞
取冻存的 PANC-1 细胞株进行复苏，调整细胞浓度后接种于 96 孔板中（1×104 个/孔），每孔加入不含抗生素的 DMEM 培养基 100 μL，于 37 ℃、5% CO2 培养箱内培养；取在 1.6 实验中已包装好、储存于 –70 ℃ 保存的重组慢病毒，冰上融化（无菌操作），用汉克斯平衡液（HBSS）稀释，调整终浓度为 1×104/μL；按病毒与细胞比率（MOI）将 PANC-1 细胞分组，MOI 分别为 1、10 及 100，分别加入相应量 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体，37 ℃、5% CO2 培养箱内培养，每 12 小时更换 1 次培养基；加入重组慢病毒 3 d 后，用荧光显微镜观察阳性细胞比例，感染效率在 80% 以上者为最适转染 MOI 值。实验证实 MOI=10 时，感染效率最佳。将 PANC-1 细胞以 1×105 个/孔接种于 24 孔板中，同时每孔以最适 MOI 值加入PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体（同时设未转染组，未进行重组慢病毒转染），37 ℃、5% CO2 培养箱内混合培养，8 h 后更换为含 10% 小牛血清的 DMEM 培养基。分别于共培养 24 及 48 h 用荧光显微镜观察病毒感染情况；同时通过荧光定量 PCR 检测 Beclin-1 mRNA 的表达情况（操作按试剂盒说明书进行）。2 组不同时点均设 4 个复孔，不同时点提取不同培养孔中的细胞进行 PCR 实验（操作同上）和 Western blot 检测。
1.8 Western blot 法检测 Beclin-1 蛋白的表达
通过 Western blot 法检测 Beclin-1 蛋白的表达，具体步骤如下：在制备好的不连续变性聚丙稀酰胺胶上每孔上 20～100 μg 蛋白，置于电泳仪内电泳，电压 100 V。之后将聚偏二氟乙烯膜于甲醇中泡 15 s，和胶一起放在转膜液中平衡 15 min，然后按照阳极-海绵-滤纸-聚偏二氟乙烯膜-胶-滤纸-海绵-阴极的顺序安置好，放到湿转膜仪中，用冰覆盖，300 mA 转移 45 min。转膜结束后取出聚偏二氟乙烯膜，放入丽春红 S 中染色。再以 5% 牛奶封闭 1 h，TBST 缓冲液洗 3 次，每次 5 min。滴加一抗（Anti-Beclin-1 兔抗人多克隆抗体，1∶100）4 ℃ 过夜，第二天以 TBST 缓冲液洗 4 次，每次 5 min。上二抗室温放置 1 h 后，以 TBST 缓冲液洗 4 次，每次 5 min。最后以增强化学发光法（ ECL）显色，暗房压片。
1.9 MTT 法检测细胞增殖情况
将 PANC-1 细胞接种于 96 孔板中（1×104 个/孔）后，分为 3 组：转染组、空载体组和空白对照组。转染组加入 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体；空载体组加入 PLenO-WPI 慢病毒载体；空白对照组只加入培养基。将细胞于 37 ℃、5% CO2 培养箱内培养，每 12 小时更换 1 次培养基。于转染 1～7 d 期间每天检测细胞增殖情况（每个时点 3 组均设 3 个复孔）。MTT 检测步骤：每孔加入 MTT 20 μL，孵育 4 h 后离心（1 200 r/min，r=11 cm，5 min），去上清，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，振荡 10 min，用酶标仪于 570 nm 处测定 OD 值。OD 值随细胞增殖而增加。
1.10 统计学方法
所有数据资料采用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（ ±s）表示，统计分析方法采用成组 t 检验或方差分析（两两比较采用 LSD 法）。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 胰腺癌及正常胰腺组织中 Beclin-1 mRNA 及其蛋白的表达结果
实时荧光定量 PCR 结果显示：胰腺癌组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平低于正常胰腺组织（P=0.003 9），见图 1a，提示胰腺癌组织中 Beclin-1 mRNA 的表达下调。免疫组化染色结果显示：Beclin-1 蛋白主要于细胞浆内表达，呈棕黄色物质沉积；胰腺癌组织中 Beclin-1 蛋白的 IOD 值低于正常胰腺组织（P=0.000 2），见图 1b 和图 2，提示胰腺癌组织中 Beclin-1 蛋白的表达也下调。
图1
示胰腺癌组织和正常胰腺组织中 Beclin-1 mRNA 及其蛋白的表达结果 a：Beclin-1 mRNA；b：Beclin-1 蛋白；与正常胰腺组织比较，*P<0.05
图2
示免疫组化染色结果（SP ×200） a：正常胰腺组织；b：胰腺癌组织
2.2 HE 染色结果
HE 染色显示，胰腺癌组织中无典型的腺泡样结构，细胞排列不规则，细胞大小不一，边界不清，核大深染，无核仁，腺管呈条索状；正常胰腺组织中可见典型的外分泌腺腺泡结构，细胞排列规则，极性分明（图 3）。
图3
示病理学检查结果（HE ×200） a：正常胰腺组织；b：胰腺癌组织
2.3 人胰腺癌组织中 Beclin-1 蛋白表达与患者临床病理学特征的关系
在胰腺癌患者中，Beclin-1 蛋白的表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤直径及分化程度均无关（P>0.05），与 TNM 分期及淋巴结转移有关，TNM Ⅲ期和Ⅳ期患者的 Beclin-1 蛋白的表达水平均低于Ⅰ期或Ⅱ期患者（P<0.05），但Ⅲ期和Ⅳ期比较、Ⅰ期和Ⅱ期比较差异均无统计学意义（P>0.05）；淋巴结转移阳性患者 Beclin-1 蛋白的表达水平低于阴性患者（P=0.011）。见表 1。
表1
胰腺癌组织中 Beclin-l 蛋白的表达与患者临床病理学特征的关系
2.4 PLenO-WPI-Beclin-1 重组载体的鉴定结果
用限制性内切酶 MluⅠ、BamHⅠ双酶切PLenO-WPI-Beclin-1重组慢病毒载体，通过电泳分离酶切片段，得到 1 条长约 1 233 bp 的片段和 1 条长约 11 kp 的片段，片段长度符合 Beclin-1 基因及 PLenO-WPI 载体大小；而用 MluⅠ、BamHⅠ双酶切的空质粒，电泳结果显示为 1 条片段，长约 11 kp（图 4a）。该结果显示，目的基因片段已正确地插入到真核表达载体 PLenO-WPI 中。将获得的 PLenO-WPI-Beclin-1 重组载体与 Beclin-1 特异引物混合，通过 PCR 扩增，电泳后得到 1 条长为 1 233 bp的片段（图 4b），证明 Beclin-1 基因在重组载体中。将酶切鉴定及 PCR 鉴定均为阳性的克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行插入片段的序列测定。测序结果显示，插入片段序列长度为 1 233 bp，测序图谱如图 4c 所示。将测序结果与 NCBI 数据库公布的人 Beclin-l 基因序列进行 BLAST 比对，结果显示插入片段与人 Beclin-1 基因序列相同。目的片段插入方向正确，阅读框架不变。
图4
示 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体鉴定 a： PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体酶切后的电泳图，M 为 DNA maker，1、2 及 4 条带为 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体，3 条带为 PLenO-WPI 空载体；b：实时荧光 PCR 产物电泳图，M 为 DNA marker，1 条带为 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体；c：插入片段的测序结果
2.5 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体转染 PANC-1 胰腺癌细胞后 Beclin-1 mRNA 的表达
PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体与 PANC-1 细胞共培养 24 h 后，可在荧光显微镜下观察到 PANC-1 细胞荧光表达明显（图 5）；共培养 48 h 后，有 80% 细胞的胞浆内能观察到绿色荧光显示，提示 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体成功转染 PANC-1 细胞并表达。为进一步明确是否有 Beclin-1 mRNA 的表达，笔者进行了 PCR 实验。结果如图 6 所示，和未转染组对比，转染后 24 h 和 48 h，同时点转染组细胞的 Beclin-1 mRNA 的表达水平均高于未转染组（P<0.05）。通过 Western blot 检测转染后 PANC-1 细胞中 Beclin-1 蛋白的表达，同样发现，转染后蛋白表达明显上调（图 7）。上述结果表明，PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体能在 PANC-1 细胞内正确表达 Beclin-1 基因。
图5
示转染组和未转染组 PANC-1 细胞的荧光显微镜观察结果（ ×400） a：未转染组 24 h；b：未转染组 48 h；c：转染组 24 h；d：转染组 48 h
图6
示 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体转染 PANC-1 细胞后细胞中 Beclin-1 mRNA 的表达情况 同时点与未转染组比较，*P<0.05
图7
示 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体转染 PANC-1 细胞后细胞中 Beclin-1 蛋白表达的电泳图
2.6 MTT 检测结果
总体来说，转染 1～7 d 期间，转染组、空白对照组和空载体组细胞的增殖能力在转染第 2 天时开始均有所升高，但转染组相较于空白对照组和空载体组升高幅度较低，而空载体组和空白对照组间区分度不大（图 8）。转染 1、2 及 3 d 时，3 组细胞的 OD 值比较差异均无统计学意义（P>0.05）；从转染 4 d 开始，至转染 7 d 期间，同时点转染组细胞的 OD 值较空白对照组和空载体组均较低（P<0.05），但同时点空载体组和空白对照组细胞的 OD 值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。提示随着 Beclin-1 基因的增强表达，PANC-1 细胞的增殖能力受到明显抑制。
图8
示 MTT 法检测结果 同时点与空载体组和空白对照组比较，*P<0.05
3 讨论
Beclin-1 基因是调控自噬的重要基因，自从认识到自噬与肿瘤的发生发展相关后，Beclin-1 表达对肿瘤的影响就成为研究的热点。
3.1 Beclin-1 与肿瘤的关系
Beclin-1 基因与肿瘤的关系首先在乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌中得到验证。研究[17]表明，有 75% 的卵巢癌、50% 的乳腺癌以及 40% 的前列腺癌组织中存在染色体 17q21 位点等位基因的缺失。通过对卵巢癌染色体 17q21 位点缺失的精确序列分析找到了目前唯一已知与自噬相关的基因就是 Beclin-l 基因[19]。Liang 等[18]将 Beclin-1 基因转染人乳腺癌细胞后，发现细胞的增殖能力降低，在裸鼠上的成瘤能力减弱。2003 年，Qu 等[21]通过建立携带 Beclin-1+/– 杂合缺失的鼠模型，结果发现，Beclin-1+/– 杂合缺失鼠的自发性肿瘤的发生率很高，这些自发肿瘤包括肺腺癌、肝细胞癌、淋巴瘤等，在这些 Beclin-1+/– 杂合缺失的鼠细胞中自噬活性明显下降，但没有证据证明凋亡发生改变；此外还发现，Beclin-1+/– 杂合缺失可导致自噬空泡形成减少。据此，多数研究者[22-23]认为，Beclin-1 等位基因的缺失或表达降低促进了细胞增殖，削弱了自噬，导致肿瘤的形成。但并非所有肿瘤组织中 Beclin-1 基因的表达都是降低的。康凯夫等[24]在肝癌的研究中发现，肝癌组织中 Beclin-1 蛋白的表达水平明显高于正常组织。对结肠癌的研究[25]也表明，Beclin-1 蛋白在肿瘤组织中的表达阳性率高达 85.2%（98/115），而癌旁组织中无或只有中等程度的 Beclin-1 蛋白表达。在其他肿瘤中也有类似发现[26-27]。
3.2 自噬在肿瘤中的作用
Beclin-1 分子对肿瘤的影响，最终要通过自噬来实现。如同 Beclin-1 分子在肿瘤组织中的表达不全是降低一样，目前自噬与肿瘤的关系同样存在较大争论。研究[28]表明，自噬水平在细胞的“危机”状况下可快速上调，如营养缺乏、细胞密度负荷、低氧等。此时自噬的降解产物如氨基酸、核苷酸、游离脂肪酸等可供能量并再循环；此外自噬还可以作为一种防御机制清除胞质内受损的细胞器和代谢产物，进行亚细胞水平上的重构，保护受损的细胞[28]。另有研究者[29-30]发现，在营养缺乏的环境下，自噬可保护肿瘤细胞，维持肿瘤的生存。如果此时阻断自噬效应，肿瘤细胞则会发生凋亡[29-30]。然而其他研究者[31-33]对比肿瘤与正常细胞的自噬水平后却发现，肿瘤细胞的自噬水平均明显低于正常细胞。使用致癌物质作用于正常细胞，也发现这些细胞的自噬水平与未处理组对比明显降低[11, 34]。在对大鼠胰腺癌的研究中发现，在癌前病变或良性肿瘤期，自噬活性增强，而腺瘤向腺癌转化的过程中，自噬活性明显降低，提示在胰腺癌的发生过程中自噬活性降低可能是必须的[35]。这些相互矛盾的研究结果表明，自噬对于肿瘤细胞可能是把“双刃剑”。自噬时因大分子物质循环和有害物质得到隔离使肿瘤细胞生存，但当自噬超过某一阈值、大量降解蛋白质与细胞器时则会导致自噬性死亡。
3.3 Beclin-1 分子的表达下调可能是胰腺癌发展的机制之一
本研究通过实时荧光定量 PCR 及免疫组化染色技术检测了人胰腺癌及正常胰腺组织中 Beclin-1 分子的表达情况，结果发现，人胰腺癌组织中 Beclin-1 基因及蛋白的表达水平均低于正常胰腺组织。胰腺癌组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平仅为正常胰腺组织的 5.47%（0.148 5/2.713 9），且其 Beclin-1 蛋白的表达水平仅为正常胰腺组织的 10.20%（22 990.304 3/225 432.089 3）。该结果表明，Beclin-1 分子在人胰腺癌组织中的表达下调，Beclin-1 分子的表达下调可能是导致胰腺癌发生发展的机制之一。本研究结论支持自噬及 Beclin-1 分子为肿瘤抑制机制之一的观点。
本研究组进一步分析了胰腺癌组织中 Beclin-1 蛋白的表达水平与患者临床病理学特征的关系。结果显示，Beclin-1 蛋白的表达水平在不同年龄和不同性别组之间并无差别，且其表达和肿瘤直径及分化程度间的关系也无统计学意义。但在不同临床分期患者之间，Beclin-1 蛋白的表达水平存在差别，分期较早（Ⅰ期和Ⅱ期）的胰腺癌组织中 Beclin-1 蛋白的表达水平高于分期较晚（Ⅲ期和Ⅳ期）者。这一结果提示，Beclin-1 蛋白的表达下调，可能增强了胰腺癌细胞的侵袭力。因为分期较早的胰腺癌（Ⅰ期和Ⅱ期）并无血管侵袭及远处转移，而Ⅲ期和Ⅳ期患者均有远隔器官转移及血管侵袭现象。此外，本组资料结果还表明，淋巴结转移阳性组患者的 Beclin-1 蛋白的表达水平低于转移阴性组，提示 Beclin-1 蛋白可能对肿瘤淋巴转移也有影响。
为进一步验证 Beclin-1 基因对胰腺癌的影响，笔者通过体外实验将 Beclin-1 基因表达载体转染进入 PANC-1 细胞。结果提示，转染了 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体的 PANC-1 细胞的体外增殖能力明显下降。MTT 法检测结果表明，自培养第 4 天开始，转染组与空载体组和空白对照组之间的 OD 值出现差别，转染组的 OD 值较低；转染第 7 天时，转染组的 OD 值仅为空白对照组的 44.38%（0.851 5/1.918 7）。这一结果与 Liang 等[18]在乳腺癌细胞上的研究结果一致，表明自噬基因 Beclin-1 在体外确实对肿瘤细胞有抑制作用。Chau 等[36]的研究表明，自噬可能是抑制肿瘤血管形成和分布的一种方式。当血管形成抑制剂 endostatin 作用于细胞时，可以在血管内皮细胞中观察到自噬性细胞死亡的特征。在实性肿瘤中，血管形成有助于肿瘤的转移和增长，通过自噬性细胞死亡抑制血管形成可以阻止肿瘤的进展。而自噬能力的减弱，有助于胰腺癌周围毛细血管的形成，提高了肿瘤的侵袭力。
胰腺癌预后极差的原因除了胰腺癌症状不明显、患者就诊时就属中晚期之外，其侵袭和转移能力也是制约和影响胰腺癌治疗效果的关键所在。本研究结果表明，Beclin-1 基因的表达与胰腺癌侵袭力及淋巴结转移有关，这可能为胰腺癌的治疗提供了新的思路。
胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocar cinoma，PDAC）是一种常见的消化系统恶性肿瘤。在所有肿瘤中，其发病率位居第 12 位，但死亡率却位居第 4 位[1-3]。目前胰腺癌的治疗方法以手术切除为主，辅助以化学治疗、放射治疗等。但经上述方法治疗后，患者的 1 年生存率仍低于 25%[4-5]，可手术切除者的 5 年生存率也不超过 5%[4-5]。自噬作为Ⅱ型程序性细胞死亡方式，是维持细胞自我平衡的重要机制，在肿瘤形成过程中发挥重要作用[6-9]。目前研究者对自噬与肿瘤的关系持两种截然相反的观点：一种认为自噬对肿瘤起保护作用，促进肿瘤的生长[10]；另外一种认为自噬是抑制肿瘤生长的重要因素[11-12]。在众多的自噬基因中，Beclin-1 基因是第一个被发现的哺乳动物“自噬基因”[13]。同时 Beclin-1 分子也是连接自噬与凋亡通道的关键分子之一[14]。胰腺癌相关研究中涉及自噬和 Beclin-1 基因的研究较少。有研究[15-16]表明，抑制胰腺癌细胞中的自噬过程，可促进胰腺癌的形成，提示自噬的存在对胰腺癌发挥抑制效应。仅有的数个关于 Beclin-1 基因的研究[17-18]得出的结论又相互矛盾。Akar 等[19]研究发现，抑制蛋白激酶 C-β/谷氨酰胺转胺酶 2（PKC-β/TG2）信号通路后，Beclin-1 蛋白的表达上调，促进胰腺癌细胞的自噬，从而抑制胰腺癌细胞的生长。另有研究[20]却表明，抑制 Beclin-1 蛋白的表达可促进胰腺癌细胞的自噬发生。为进一步探讨自噬基因 Beclin-1 基因在胰腺癌中的确切作用，笔者进行了本研究。
1 资料与方法
1.1 标本来源
本组 45 例组织石蜡标本来源于 2009 年 4 月至 2009 年 11 月期间在四川大学华西医院住院的手术患者，包括 25 例胰腺癌标本和 20 例正常胰腺组织标本。25 例胰腺癌患者的年龄为 16～80 岁，中位年龄为 52.2 岁，其中≤52 岁者 9 例，>52 岁者 16 例；男 12 例，女 13 例；临床分期：ⅠA 期 0 例，ⅠB 期 3 例，ⅡA 期 3 例，ⅡB 期 4 例，Ⅲ期 9 例，Ⅳ期 6 例；局部肿瘤直径（可估计的病灶最大直径）：≤3 cm 者 5 例，>3 cm 者 20 例；淋巴结转移：阳性 17 例，阴性 8 例；肿瘤分化程度：高分化 11 例，中低分化 14 例。所有标本的诊断均经术后病理学检查证实。20 例正常胰腺组织标本的来源：同期因胰腺体尾部 β 细胞瘤、脾切除时胰腺尾部无法与脾脏完全分离而予以切除的正常胰腺组织（14 例，距肿瘤边缘 2 cm 以上取组织），部分正常胰腺组织标本（6 例）来源于胰腺外伤患者，所有正常胰腺组织标本均经术后病理学检查证实为正常胰腺组织。20 例患者中，男 11 例，女 9 例；年龄 19～64 岁，中位年龄为 47 岁。为了排除肿瘤和慢性炎症对周围组织的影响，笔者并未采取同一胰腺癌患者的癌旁组织作为正常组织的对照。45 例患者术前均未接受任何放疗和化疗。45 例患者的临床病理资料均完整，病理诊断均由笔者所在医院病理科复核。该研究通过四川大学华西医院伦理委员会批准，所有受试对象均签署了知情同意书。
1.2 主要试剂和设备
主要试剂和材料包括：免疫组化 SP 试剂盒（美国 Sigma 公司），Anti-Beclin-1 兔抗人多克隆抗体（B6061）及 MTT 试剂盒（美国 Sigma 公司），PrimeScript® RT reagent Kit、BamHⅠ、MluⅠ及 Taq polymerase（日本 TaKara 公司），PLenO-WPI 载体（美国 Invabio 公司），用于酶切的工作酶 PmeⅠ（美国 NEB 公司），AxyPrep 质粒小量制备试剂盒和 AxyPrep 质粒大量制备试剂盒（美国 Axygen 公司），制备感受态试剂盒（美国 BIOSCIENCES 公司），SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒〔DRR081S，宝生物工程（大连）有限公司〕，superfect 转染试剂盒（德国 qiagen 公司）。239T 细胞和 PANC-1 细胞株均来源于中国科学院细胞库。
主要软件及设备包括：PowerPac 稳压 DNA 电泳仪、iCycler iQTM 荧光实时多波长 PCR 仪、BIO-RAD680 酶标仪、Mini-PROTEAN Tetra 蛋白电泳仪及 Gel Doc 1000 凝胶成像系统均来源于美国 BIO-RAD 公司，Image-Pro Plus Version 6.0 分析软件来源于美国 Media Cybernetics 公司。
1.3 PCR 法检测人胰腺癌及正常胰腺组织中 Beclin-1 mRNA 的表达
取 30～50 mg 胰腺癌或正常胰腺组织块，剪碎后置入装有 0.5 mL RNAisoTM Plus 液的 1.5 mL EP 管中，立刻采用匀浆法破碎细胞，再加入 0.5 mL RNAisoTM Plus 液，移液器吹打（>50 次）。将 EP 管置于冰上片刻后，于 4 ℃ 条件下离心 10 min（12 000 r/min，r=8 cm）。取上清转移至经焦碳酸二乙酯（DEPC）预处理的 EP 管中。室温放置 5 min 使样品充分裂解。在上述液体中加入 0.2 mL 氯仿，晃动 15 s，室温放置 10 min。于 4 ℃ 下离心 10 min（12 000 r/min，r=8 cm），提取 RNA。提取的总 RNA 行 1% 琼脂糖凝胶电泳检验。检验合格后，以提取的总 RNA 作为模板，采用 PrimeScript® RT reagent Kit 试剂盒提供的 Random 6 mers 及 Oligo（dT）引物，利用逆转录酶将 RNA 逆转录成 cDNA。再行实时荧光定量 PCR。Beclin-1 基因引物：正义链 5′-GATTGAA-GACACAGGAGGCAGT-3′，反义链 5′-GTGAGG-ACACCCAAGCAAGAC-3′（扩增长度为 97 bp）。β-actin 为内参基因：正义链 5′-GTGGACATCCG-CAAAGAC-3′，反义链 5′-AAAGGGTGTAACG-CAACTA-3′（扩增长度为 302 bp），上述引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。PCR 反应体系及反应条件按试剂盒说明书操作。PCR 扩增在 iCycler iQTM 荧光实时多波长 PCR 仪上进行，扩增采用两步法 PCR 扩增标准程序。第一步：95 ℃ 30 s，40 个循环；第二步：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。所有标本的 Beclin-1 mRNA 的相对表达量均经看家基因 β-actin 的校正，以减少实验误差。
1.4 免疫组化染色检测胰腺癌及正常胰腺组织中 Beclin-1 蛋白的表达
免疫组化染色步骤是：首先对组织进行固定、切片脱蜡至水后，置于 3% H2O2 溶液中，37 ℃ 孵育 10 min，以 PBS 缓冲液冲洗 3 次，每次 5 min。置于枸橼酸缓冲液中（95 ℃）15～20 min，自然冷却 20 min 以上，冷水冲洗以加快冷却至室温，再以 PBS 缓冲液冲洗 3～5 min。加入正常羊血清工作液 10 mL 封闭，37 ℃ 孵育 10 min。滴加 Anti-Beclin-1 兔抗人多克隆抗体，比例为 1∶60，4 ℃ 冰箱孵育过夜，再以 PBS 缓冲液冲洗 3～5 min。用 PBS 缓冲液代替一抗作为阴性对照，以乳腺癌标本作为阳性对照。滴加生物素标记的二抗（1∶100），37 ℃ 孵育 30 min。滴加链亲和素——生物素过氧化物酶复合物，工作浓度为 1∶100，37 ℃ 恒温孵育 30 min。以 DAB/H2O2 显色，自来水充分冲洗后，以苏木精复染，75%、80%、85%、95% 及 100% 乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察结果。首先在 100 倍光镜下观察全片，选择 5 个阳性物质丰富的视野，然后采用 Image-Pro Plus Version 6.0 分析软件在 400 倍光镜下测定阳性物质的积分光密度（integated optical density，IOD）值，取 5 个视野的均值，分析 Beclin-1 蛋白的表达情况。IOD 值越高表明 Beclin-1 蛋白表达水平越高。
1.5 HE 染色
本实验的 HE 染色按常规操作进行。
1.6 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体的构建
提取人正常胰腺组织中（20 例中的任一例）的总 RNA（操作按试剂盒说明书进行）。于美国国立生物技术信息中心（NCBI）基因文库中获得人 Beclin-1 cDNA 序列（NM_003766），再根据 PLenO-WPI 载体的插入位点，设计扩增 Beclin-l 基因的一对引物。为了方便检测，在引物两端分别加入 BamHⅠ和 MluⅠ酶切位点，同时设计保护性碱基。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列：正义链 5′-C GGATCCATGGAA-GGGTCTAAGACGTCCAACA-3′（5′端下划线部分为 BamHⅠ酶切位点，斜体部分为保护性碱基）；反义链 5′-C ACGCGTTCATTTGTTATAAAATTGTG-AGG-3′（5′端下划线部分为 MluⅠ酶切位点，斜体部分为保护性碱基）。以提取的总 RNA 为模版，通过上述引物和逆转录，扩增出 Beclin-1 cDNA（PCR 法，按 PrimeScript® RT reagent Kit 试剂盒说明书进行）。Beclin-1 cDNA 通过 BamHⅠ、MluⅠ双酶切后，与 PLenO-WPI 载体连接，反应在 T4DNA 连接酶作用下进行。PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体完成后，行限制性内切酶 MluⅠ、BamHⅠ双酶切来鉴定是否有目的片段插入。酶切产物行 1% 琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察结果。同时通过 PCR 方法（PCR 操作按试剂盒说明书进行），扩增重组载体以再次确定是否有正确的 Beclin-1 基因插入 PLenO-WPI 载体。取经酶切反应及 PCR 反应均鉴定正确的克隆，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，将序列测定结果与 NCBI 数据库公布的人 Beclin-l 基因序列进行比对和分析。最后将 PLenO-WPI-Beclin-1 重组载体转染至 239T 细胞包装（转染按转染试剂盒说明书进行）。
1.7 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体转染 PANC-1 胰腺癌细胞
取冻存的 PANC-1 细胞株进行复苏，调整细胞浓度后接种于 96 孔板中（1×104 个/孔），每孔加入不含抗生素的 DMEM 培养基 100 μL，于 37 ℃、5% CO2 培养箱内培养；取在 1.6 实验中已包装好、储存于 –70 ℃ 保存的重组慢病毒，冰上融化（无菌操作），用汉克斯平衡液（HBSS）稀释，调整终浓度为 1×104/μL；按病毒与细胞比率（MOI）将 PANC-1 细胞分组，MOI 分别为 1、10 及 100，分别加入相应量 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体，37 ℃、5% CO2 培养箱内培养，每 12 小时更换 1 次培养基；加入重组慢病毒 3 d 后，用荧光显微镜观察阳性细胞比例，感染效率在 80% 以上者为最适转染 MOI 值。实验证实 MOI=10 时，感染效率最佳。将 PANC-1 细胞以 1×105 个/孔接种于 24 孔板中，同时每孔以最适 MOI 值加入PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体（同时设未转染组，未进行重组慢病毒转染），37 ℃、5% CO2 培养箱内混合培养，8 h 后更换为含 10% 小牛血清的 DMEM 培养基。分别于共培养 24 及 48 h 用荧光显微镜观察病毒感染情况；同时通过荧光定量 PCR 检测 Beclin-1 mRNA 的表达情况（操作按试剂盒说明书进行）。2 组不同时点均设 4 个复孔，不同时点提取不同培养孔中的细胞进行 PCR 实验（操作同上）和 Western blot 检测。
1.8 Western blot 法检测 Beclin-1 蛋白的表达
通过 Western blot 法检测 Beclin-1 蛋白的表达，具体步骤如下：在制备好的不连续变性聚丙稀酰胺胶上每孔上 20～100 μg 蛋白，置于电泳仪内电泳，电压 100 V。之后将聚偏二氟乙烯膜于甲醇中泡 15 s，和胶一起放在转膜液中平衡 15 min，然后按照阳极-海绵-滤纸-聚偏二氟乙烯膜-胶-滤纸-海绵-阴极的顺序安置好，放到湿转膜仪中，用冰覆盖，300 mA 转移 45 min。转膜结束后取出聚偏二氟乙烯膜，放入丽春红 S 中染色。再以 5% 牛奶封闭 1 h，TBST 缓冲液洗 3 次，每次 5 min。滴加一抗（Anti-Beclin-1 兔抗人多克隆抗体，1∶100）4 ℃ 过夜，第二天以 TBST 缓冲液洗 4 次，每次 5 min。上二抗室温放置 1 h 后，以 TBST 缓冲液洗 4 次，每次 5 min。最后以增强化学发光法（ ECL）显色，暗房压片。
1.9 MTT 法检测细胞增殖情况
将 PANC-1 细胞接种于 96 孔板中（1×104 个/孔）后，分为 3 组：转染组、空载体组和空白对照组。转染组加入 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体；空载体组加入 PLenO-WPI 慢病毒载体；空白对照组只加入培养基。将细胞于 37 ℃、5% CO2 培养箱内培养，每 12 小时更换 1 次培养基。于转染 1～7 d 期间每天检测细胞增殖情况（每个时点 3 组均设 3 个复孔）。MTT 检测步骤：每孔加入 MTT 20 μL，孵育 4 h 后离心（1 200 r/min，r=11 cm，5 min），去上清，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，振荡 10 min，用酶标仪于 570 nm 处测定 OD 值。OD 值随细胞增殖而增加。
1.10 统计学方法
所有数据资料采用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（ ±s）表示，统计分析方法采用成组 t 检验或方差分析（两两比较采用 LSD 法）。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 胰腺癌及正常胰腺组织中 Beclin-1 mRNA 及其蛋白的表达结果
实时荧光定量 PCR 结果显示：胰腺癌组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平低于正常胰腺组织（P=0.003 9），见图 1a，提示胰腺癌组织中 Beclin-1 mRNA 的表达下调。免疫组化染色结果显示：Beclin-1 蛋白主要于细胞浆内表达，呈棕黄色物质沉积；胰腺癌组织中 Beclin-1 蛋白的 IOD 值低于正常胰腺组织（P=0.000 2），见图 1b 和图 2，提示胰腺癌组织中 Beclin-1 蛋白的表达也下调。
图1
示胰腺癌组织和正常胰腺组织中 Beclin-1 mRNA 及其蛋白的表达结果 a：Beclin-1 mRNA；b：Beclin-1 蛋白；与正常胰腺组织比较，*P<0.05
图2
示免疫组化染色结果（SP ×200） a：正常胰腺组织；b：胰腺癌组织
2.2 HE 染色结果
HE 染色显示，胰腺癌组织中无典型的腺泡样结构，细胞排列不规则，细胞大小不一，边界不清，核大深染，无核仁，腺管呈条索状；正常胰腺组织中可见典型的外分泌腺腺泡结构，细胞排列规则，极性分明（图 3）。
图3
示病理学检查结果（HE ×200） a：正常胰腺组织；b：胰腺癌组织
2.3 人胰腺癌组织中 Beclin-1 蛋白表达与患者临床病理学特征的关系
在胰腺癌患者中，Beclin-1 蛋白的表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤直径及分化程度均无关（P>0.05），与 TNM 分期及淋巴结转移有关，TNM Ⅲ期和Ⅳ期患者的 Beclin-1 蛋白的表达水平均低于Ⅰ期或Ⅱ期患者（P<0.05），但Ⅲ期和Ⅳ期比较、Ⅰ期和Ⅱ期比较差异均无统计学意义（P>0.05）；淋巴结转移阳性患者 Beclin-1 蛋白的表达水平低于阴性患者（P=0.011）。见表 1。
表1
胰腺癌组织中 Beclin-l 蛋白的表达与患者临床病理学特征的关系
2.4 PLenO-WPI-Beclin-1 重组载体的鉴定结果
用限制性内切酶 MluⅠ、BamHⅠ双酶切PLenO-WPI-Beclin-1重组慢病毒载体，通过电泳分离酶切片段，得到 1 条长约 1 233 bp 的片段和 1 条长约 11 kp 的片段，片段长度符合 Beclin-1 基因及 PLenO-WPI 载体大小；而用 MluⅠ、BamHⅠ双酶切的空质粒，电泳结果显示为 1 条片段，长约 11 kp（图 4a）。该结果显示，目的基因片段已正确地插入到真核表达载体 PLenO-WPI 中。将获得的 PLenO-WPI-Beclin-1 重组载体与 Beclin-1 特异引物混合，通过 PCR 扩增，电泳后得到 1 条长为 1 233 bp的片段（图 4b），证明 Beclin-1 基因在重组载体中。将酶切鉴定及 PCR 鉴定均为阳性的克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行插入片段的序列测定。测序结果显示，插入片段序列长度为 1 233 bp，测序图谱如图 4c 所示。将测序结果与 NCBI 数据库公布的人 Beclin-l 基因序列进行 BLAST 比对，结果显示插入片段与人 Beclin-1 基因序列相同。目的片段插入方向正确，阅读框架不变。
图4
示 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体鉴定 a： PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体酶切后的电泳图，M 为 DNA maker，1、2 及 4 条带为 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体，3 条带为 PLenO-WPI 空载体；b：实时荧光 PCR 产物电泳图，M 为 DNA marker，1 条带为 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体；c：插入片段的测序结果
2.5 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体转染 PANC-1 胰腺癌细胞后 Beclin-1 mRNA 的表达
PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体与 PANC-1 细胞共培养 24 h 后，可在荧光显微镜下观察到 PANC-1 细胞荧光表达明显（图 5）；共培养 48 h 后，有 80% 细胞的胞浆内能观察到绿色荧光显示，提示 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体成功转染 PANC-1 细胞并表达。为进一步明确是否有 Beclin-1 mRNA 的表达，笔者进行了 PCR 实验。结果如图 6 所示，和未转染组对比，转染后 24 h 和 48 h，同时点转染组细胞的 Beclin-1 mRNA 的表达水平均高于未转染组（P<0.05）。通过 Western blot 检测转染后 PANC-1 细胞中 Beclin-1 蛋白的表达，同样发现，转染后蛋白表达明显上调（图 7）。上述结果表明，PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体能在 PANC-1 细胞内正确表达 Beclin-1 基因。
图5
示转染组和未转染组 PANC-1 细胞的荧光显微镜观察结果（ ×400） a：未转染组 24 h；b：未转染组 48 h；c：转染组 24 h；d：转染组 48 h
图6
示 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体转染 PANC-1 细胞后细胞中 Beclin-1 mRNA 的表达情况 同时点与未转染组比较，*P<0.05
图7
示 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体转染 PANC-1 细胞后细胞中 Beclin-1 蛋白表达的电泳图
2.6 MTT 检测结果
总体来说，转染 1～7 d 期间，转染组、空白对照组和空载体组细胞的增殖能力在转染第 2 天时开始均有所升高，但转染组相较于空白对照组和空载体组升高幅度较低，而空载体组和空白对照组间区分度不大（图 8）。转染 1、2 及 3 d 时，3 组细胞的 OD 值比较差异均无统计学意义（P>0.05）；从转染 4 d 开始，至转染 7 d 期间，同时点转染组细胞的 OD 值较空白对照组和空载体组均较低（P<0.05），但同时点空载体组和空白对照组细胞的 OD 值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。提示随着 Beclin-1 基因的增强表达，PANC-1 细胞的增殖能力受到明显抑制。
图8
示 MTT 法检测结果 同时点与空载体组和空白对照组比较，*P<0.05
3 讨论
Beclin-1 基因是调控自噬的重要基因，自从认识到自噬与肿瘤的发生发展相关后，Beclin-1 表达对肿瘤的影响就成为研究的热点。
3.1 Beclin-1 与肿瘤的关系
Beclin-1 基因与肿瘤的关系首先在乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌中得到验证。研究[17]表明，有 75% 的卵巢癌、50% 的乳腺癌以及 40% 的前列腺癌组织中存在染色体 17q21 位点等位基因的缺失。通过对卵巢癌染色体 17q21 位点缺失的精确序列分析找到了目前唯一已知与自噬相关的基因就是 Beclin-l 基因[19]。Liang 等[18]将 Beclin-1 基因转染人乳腺癌细胞后，发现细胞的增殖能力降低，在裸鼠上的成瘤能力减弱。2003 年，Qu 等[21]通过建立携带 Beclin-1+/– 杂合缺失的鼠模型，结果发现，Beclin-1+/– 杂合缺失鼠的自发性肿瘤的发生率很高，这些自发肿瘤包括肺腺癌、肝细胞癌、淋巴瘤等，在这些 Beclin-1+/– 杂合缺失的鼠细胞中自噬活性明显下降，但没有证据证明凋亡发生改变；此外还发现，Beclin-1+/– 杂合缺失可导致自噬空泡形成减少。据此，多数研究者[22-23]认为，Beclin-1 等位基因的缺失或表达降低促进了细胞增殖，削弱了自噬，导致肿瘤的形成。但并非所有肿瘤组织中 Beclin-1 基因的表达都是降低的。康凯夫等[24]在肝癌的研究中发现，肝癌组织中 Beclin-1 蛋白的表达水平明显高于正常组织。对结肠癌的研究[25]也表明，Beclin-1 蛋白在肿瘤组织中的表达阳性率高达 85.2%（98/115），而癌旁组织中无或只有中等程度的 Beclin-1 蛋白表达。在其他肿瘤中也有类似发现[26-27]。
3.2 自噬在肿瘤中的作用
Beclin-1 分子对肿瘤的影响，最终要通过自噬来实现。如同 Beclin-1 分子在肿瘤组织中的表达不全是降低一样，目前自噬与肿瘤的关系同样存在较大争论。研究[28]表明，自噬水平在细胞的“危机”状况下可快速上调，如营养缺乏、细胞密度负荷、低氧等。此时自噬的降解产物如氨基酸、核苷酸、游离脂肪酸等可供能量并再循环；此外自噬还可以作为一种防御机制清除胞质内受损的细胞器和代谢产物，进行亚细胞水平上的重构，保护受损的细胞[28]。另有研究者[29-30]发现，在营养缺乏的环境下，自噬可保护肿瘤细胞，维持肿瘤的生存。如果此时阻断自噬效应，肿瘤细胞则会发生凋亡[29-30]。然而其他研究者[31-33]对比肿瘤与正常细胞的自噬水平后却发现，肿瘤细胞的自噬水平均明显低于正常细胞。使用致癌物质作用于正常细胞，也发现这些细胞的自噬水平与未处理组对比明显降低[11, 34]。在对大鼠胰腺癌的研究中发现，在癌前病变或良性肿瘤期，自噬活性增强，而腺瘤向腺癌转化的过程中，自噬活性明显降低，提示在胰腺癌的发生过程中自噬活性降低可能是必须的[35]。这些相互矛盾的研究结果表明，自噬对于肿瘤细胞可能是把“双刃剑”。自噬时因大分子物质循环和有害物质得到隔离使肿瘤细胞生存，但当自噬超过某一阈值、大量降解蛋白质与细胞器时则会导致自噬性死亡。
3.3 Beclin-1 分子的表达下调可能是胰腺癌发展的机制之一
本研究通过实时荧光定量 PCR 及免疫组化染色技术检测了人胰腺癌及正常胰腺组织中 Beclin-1 分子的表达情况，结果发现，人胰腺癌组织中 Beclin-1 基因及蛋白的表达水平均低于正常胰腺组织。胰腺癌组织中 Beclin-1 mRNA 的表达水平仅为正常胰腺组织的 5.47%（0.148 5/2.713 9），且其 Beclin-1 蛋白的表达水平仅为正常胰腺组织的 10.20%（22 990.304 3/225 432.089 3）。该结果表明，Beclin-1 分子在人胰腺癌组织中的表达下调，Beclin-1 分子的表达下调可能是导致胰腺癌发生发展的机制之一。本研究结论支持自噬及 Beclin-1 分子为肿瘤抑制机制之一的观点。
本研究组进一步分析了胰腺癌组织中 Beclin-1 蛋白的表达水平与患者临床病理学特征的关系。结果显示，Beclin-1 蛋白的表达水平在不同年龄和不同性别组之间并无差别，且其表达和肿瘤直径及分化程度间的关系也无统计学意义。但在不同临床分期患者之间，Beclin-1 蛋白的表达水平存在差别，分期较早（Ⅰ期和Ⅱ期）的胰腺癌组织中 Beclin-1 蛋白的表达水平高于分期较晚（Ⅲ期和Ⅳ期）者。这一结果提示，Beclin-1 蛋白的表达下调，可能增强了胰腺癌细胞的侵袭力。因为分期较早的胰腺癌（Ⅰ期和Ⅱ期）并无血管侵袭及远处转移，而Ⅲ期和Ⅳ期患者均有远隔器官转移及血管侵袭现象。此外，本组资料结果还表明，淋巴结转移阳性组患者的 Beclin-1 蛋白的表达水平低于转移阴性组，提示 Beclin-1 蛋白可能对肿瘤淋巴转移也有影响。
为进一步验证 Beclin-1 基因对胰腺癌的影响，笔者通过体外实验将 Beclin-1 基因表达载体转染进入 PANC-1 细胞。结果提示，转染了 PLenO-WPI-Beclin-1 重组慢病毒载体的 PANC-1 细胞的体外增殖能力明显下降。MTT 法检测结果表明，自培养第 4 天开始，转染组与空载体组和空白对照组之间的 OD 值出现差别，转染组的 OD 值较低；转染第 7 天时，转染组的 OD 值仅为空白对照组的 44.38%（0.851 5/1.918 7）。这一结果与 Liang 等[18]在乳腺癌细胞上的研究结果一致，表明自噬基因 Beclin-1 在体外确实对肿瘤细胞有抑制作用。Chau 等[36]的研究表明，自噬可能是抑制肿瘤血管形成和分布的一种方式。当血管形成抑制剂 endostatin 作用于细胞时，可以在血管内皮细胞中观察到自噬性细胞死亡的特征。在实性肿瘤中，血管形成有助于肿瘤的转移和增长，通过自噬性细胞死亡抑制血管形成可以阻止肿瘤的进展。而自噬能力的减弱，有助于胰腺癌周围毛细血管的形成，提高了肿瘤的侵袭力。
胰腺癌预后极差的原因除了胰腺癌症状不明显、患者就诊时就属中晚期之外，其侵袭和转移能力也是制约和影响胰腺癌治疗效果的关键所在。本研究结果表明，Beclin-1 基因的表达与胰腺癌侵袭力及淋巴结转移有关，这可能为胰腺癌的治疗提供了新的思路。
