引用本文： 李川, 沈俊颐, 文天夫. FOXA2在肝内胆管细胞癌组织中的表达及其与预后的关系分析. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(12): 1450-1454. doi: 10.7507/1007-9424.20160368 复制
肝癌是世界范围内第6大常见恶性肿瘤，其发生与乙肝及丙肝病毒的慢性感染密切相关[1]。我国是乙肝大国，2006年全国流行病学调查显示我国乙肝表面抗原阳性者约占7.18% [2]。由于我国乙肝病毒的感染率高，全球约55%的肝癌患者为中国患者[3]。肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是肝脏第二大常见原发性肿瘤，约占原发性肝脏恶性肿瘤的10%~15% [4-5]。ICC的恶性程度较高，其5年生存率约为20%~32% [6-8]。由于ICC的恶性程度高，有学者[9]甚至认为ICC患者不适合行肝移植。ICC行手术切除后的复发率较高，但其复发的危险因素及机制目前并不清楚。笔者探讨了ICC组织中叉头框蛋白A2（forkhead box A2，FOXA2）的表达情况，及其与患者临床病理学特征及预后的关系，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集2009-2013年期间于笔者所在医院行肝切除的ICC患者的临床病理资料，所有患者均经术后病理学检查证实为ICC。本组共纳入85例ICC患者，其中男42例，女43例；年龄23~81岁、（56.4±12.0）岁；肿瘤直径2~17 cm、（6.5±2.8）cm；79例肿瘤为单发，6例肿瘤为多发；低分化61例，中分化及高分化共24例；TNM分期为Ⅰ期42例，Ⅱ期17例，Ⅲ期9例，Ⅳ期17例；神经侵犯8例，未发生神经侵犯79例；微血管侵犯11例，未发生微血管侵犯74例；存在肿瘤卫星灶18例，不存在肿瘤卫星灶67例；发生肝硬变14例，未发生肝硬变71例；糖类抗原19-9（CA19-9）水平正常62例，升高23例。
1.2 ICC组织中FOXA2的检测
兔抗人FOXA2多克隆抗体购于美国Abcam公司，DVB显色试剂盒和二步法免疫组化检测试剂盒均购于丹麦DAKO公司，EDTA抗原修复试剂购于北京中杉金桥生物技术有限公司。ICC组织经4%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片；在62 ℃烤箱内烘烤2 h后，经二甲苯脱蜡；梯度乙醇脱水后，采用3%过氧化酶阻断溶液室温下孵育10 min，再采用PBS液洗涤3次，5 min/次；采用EDTA缓冲液高压热力修复抗原20 min后，采用PBS液洗涤3次，5 min/次；滴加兔抗人FOXA2单克隆抗体（1 : 300）作为一抗，4 ℃过夜；添加生物素标记的兔二抗37 ℃温育0.5 h；最后行DAB显色，以苏木精复染细胞核。用PBS液代替一抗作为阴性对照，采用反复试验验证的已知阳性切片（肝组织）作为阳性对照。
1.3 免疫组化结果判定
FOXA2主要表达在ICC细胞的细胞核上，以细胞核见到棕褐色染色为阳性表达。依据半定量方法对阳性表达结果进行判定，每张切片随机选取5个高倍镜视野以观察细胞染色情况（取均值）：阳性细胞所占比例≤50%时判定为低表达，阳性细胞所占比例 > 50%时判定为高表达。
1.4 随访
患者术后均每3个月随访1次。随访内容包括肝肾功能、血常规、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、CA19-9、腹部超声/CT/MRI。术后复发定义为：与术前影像学检查图像相比出现新的病灶，伴/不伴肿瘤标志物升高，或经活检/手术切除证实复发。
1.5 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。服从正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，不服从正态分布的计量资料以中位数（M）表示，统计方法采用成组t检验或成组设计两样本比较的秩和检验；计数资料的统计方法采用成组χ2检验或Fisher确切概率法；生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法，生存分析单因素分析采用log-rank检验，多因素分析采用Cox比例风险回归模型。检验水准α=0.050。
2 结果
本组ICC患者中，FOXA2呈低表达50例（图 1），高表达35例（图 2）。
图1
免疫组化染色示FOXA2呈低表达（ABC ×200） 图 2 免疫组化染色示FOXA2呈高表达（ABC ×200）
2.1 ICC组织中FOXA2的表达与患者临床病理学特征的关系
ICC患者中FOXA2的表达与临床病理学特征的关系见表 1。由表 1可见，FOXA2表达与年龄、性别、肿瘤直径、多灶性、肿瘤分化程度、神经侵犯、微血管侵犯、卫星灶、肝硬变及CA19-9水平均无关（P > 0.050），而与TNM分期相关（P < 0.050），Ⅰ+Ⅱ期患者的高表达率高于Ⅲ+Ⅳ期患者。
表1
ICC组织中FOXA2表达与患者临床病理学特征的关系
2.2 ICC患者术后肿瘤复发的影响因素分析
术后所有患者均获访，随访时间3~73个月，中位数为15个月。随访期间65例肿瘤复发，64例死亡。单因素分析及多因素分析结果均表明，ICC患者术后复发与年龄、性别、肿瘤直径、多灶性、肿瘤分化程度、TNM分期、神经侵犯、微血管侵犯及肝硬变情况均无关（P > 0.050），而与卫星灶、FOXA2表达及CA19-9水平均相关（P < 0.050），存在卫星灶、FOXA2低表达及CA19-9水平升高者的术后复发率更高（表 2和表 3）。
表2
ICC患者术后复发影响因素的单因素分析结果
表3
ICC患者术后复发影响因素的多因素分析结果
2.3 ICC患者术后生存的影响因素分析
单因素分析结果表明，ICC患者术后生存与年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤分化程度、微血管侵犯及肝硬变均无关（P > 0.050），而与多灶性、TNM分期、神经侵犯、卫星灶、FOXA2表达及CA19-9水平均相关（P < 0.050），存在多灶性、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、有神经侵犯、存在卫星灶、FOXA2低表达及CA19-9水平升高患者的术后生存情况差（表 4）。多因素分析结果表明，ICC患者术后生存与神经侵犯、卫星灶、FOXA2表达及CA19-9水平均相关（P < 0.050），肿瘤神经侵犯、存在卫星灶、FOXA2低表达和术前CA19-9升高患者的术后生存差（表 5）。
表4
ICC患者术后死亡的单因素分析结果（例）
表5
ICC患者术后死亡的多因素分析结果
3 讨论
ICC起源于肝内胆管上皮细胞，在原发性肝癌中，其发病率仅次于肝细胞肝癌。目前ICC的病因尚不明确，可能与胆管慢性炎症及代谢性疾病相关[6]。ICC具有侵袭性强、转移早、切除率低等特征。既往的研究[10-12]显示，无论是行肝切除还是肝移植，ICC患者的预后均较肝细胞肝癌差。目前，手术切除仍然是ICC主要的根治性治疗手段，但ICC患者的术后复发率高，患者总体5年生存率约为20%~32% [6-8]。
3.1 FOXA2与肿瘤
FOXA是一类DNA结合区中的具有翼状螺旋结构的转录因子，已发现其3名成员（FOXA1、FOXA2和FOXA3）在哺乳动物胚胎期的器官形成、成体时期的新陈代谢和肿瘤的发生发展中起着重要作用[13-15]。在肝脏发育过程中，FOXA亚家族成员起着关键的调控作用，其在肝脏分化形成过程中扮演“先锋因子”的角色[13-14]。大量研究[16-19]表明，FOXA2在肝细胞肝癌、肺癌、乳腺癌及胰腺癌组织中的表达下调，提示FOXA2参与了肿瘤的发生与发展。Tang等[20]的研究显示，在肺癌组织中，FOXA2可结合slug，上调E-钙黏蛋白的表达，进而抑制上皮间充质转化。Zhang等[21]的研究显示，在乳腺癌组织中，FOXA2可促进转导素样分裂增强子3（TLE3）与E盒结合锌指蛋白2（ZEB2）结合，进而抑制上皮间充质转化过程。Song等[22]的研究显示，在胰腺肿瘤组织中，FOXA2的表达可导致E-钙黏蛋白基因的启动子广泛甲基化，从而使E-钙黏蛋白基因再活化。Wang等[16]的研究显示，FOXA2的表达上调后，其可通过抑制金属蛋白酶-9的表达，从而抑制肝细胞肝癌的转移和侵袭。
本组资料结果表明，ICC患者中FOXA2的表达与TNM分期相关（P < 0.050）。Ⅰ+Ⅱ期患者的高表达率高于Ⅲ+Ⅳ期患者。张正良等[23]针对胃癌的研究亦表明，在胃癌组织中，FOXA2的表达与胃癌的TNM分期有关；且在胃癌MKN-45细胞系中FOXA2过表达可以抑制胃癌细胞的侵袭。
3.2 ICC术后复发和生存的危险因素
本组资料结果表明，存在肿瘤卫星灶、FOXA2低表达及术前CA19-9水平升高均是ICC患者术后肿瘤复发的危险因素；肿瘤神经侵犯、存在卫星灶、FOXA2低表达和术前CA19-9水平升高均是患者预后差的危险因素。本组资料结果提示，CA19-9可能能反映ICC患者的预后。Nuzzo等[4]认为，ICC患者术前CA19-9水平 > 100 U/mL是患者术后早期复发的危险因素。Yoo等[24]认为，患者术后CA19-9水平的变化与患者术后的生存相关。本组结果与前述研究[4, 24]结论一致。本组资料结果同时还提示，肿瘤存在卫星灶亦是患者术后复发与死亡的危险因素。Sulpice等[25]的研究亦报道存在卫星灶的ICC患者术后更易于复发。这可能与存在卫星灶的患者更易于肝内转移相关。
3.3 FOXA2与ICC术后复发、生存的关系
本组资料结果表明，FOXA2低表达与患者术后复发与生存密切相关。最近，Kondratyeva等[26]的研究证实，在胰腺癌细胞中，FOXA2的低表达可以促进胰腺癌细胞的上皮间充质转化，从而增强癌细胞的侵袭转移能力。Smith等[27]对子宫内膜癌患者的研究提示，FOXA2是一种抑癌基因，具有抑制肿瘤生长的作用。这些可能亦是FOXA2低表达的ICC患者术后易于复发的原因。但目前针对FOXA2与ICC的研究较少，FOXA2表达影响ICC预后的具体机制尚不清楚。
综上所述，在ICC患者中，FOXA2的表达与TNM分期有关；此外，FOXA2低表达是ICC患者术后肿瘤复发与死亡的危险因素。但FOXA2表达影响ICC患者预后的具体机理目前尚不清楚，值得进一步研究。
肝癌是世界范围内第6大常见恶性肿瘤，其发生与乙肝及丙肝病毒的慢性感染密切相关[1]。我国是乙肝大国，2006年全国流行病学调查显示我国乙肝表面抗原阳性者约占7.18% [2]。由于我国乙肝病毒的感染率高，全球约55%的肝癌患者为中国患者[3]。肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是肝脏第二大常见原发性肿瘤，约占原发性肝脏恶性肿瘤的10%~15% [4-5]。ICC的恶性程度较高，其5年生存率约为20%~32% [6-8]。由于ICC的恶性程度高，有学者[9]甚至认为ICC患者不适合行肝移植。ICC行手术切除后的复发率较高，但其复发的危险因素及机制目前并不清楚。笔者探讨了ICC组织中叉头框蛋白A2（forkhead box A2，FOXA2）的表达情况，及其与患者临床病理学特征及预后的关系，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集2009-2013年期间于笔者所在医院行肝切除的ICC患者的临床病理资料，所有患者均经术后病理学检查证实为ICC。本组共纳入85例ICC患者，其中男42例，女43例；年龄23~81岁、（56.4±12.0）岁；肿瘤直径2~17 cm、（6.5±2.8）cm；79例肿瘤为单发，6例肿瘤为多发；低分化61例，中分化及高分化共24例；TNM分期为Ⅰ期42例，Ⅱ期17例，Ⅲ期9例，Ⅳ期17例；神经侵犯8例，未发生神经侵犯79例；微血管侵犯11例，未发生微血管侵犯74例；存在肿瘤卫星灶18例，不存在肿瘤卫星灶67例；发生肝硬变14例，未发生肝硬变71例；糖类抗原19-9（CA19-9）水平正常62例，升高23例。
1.2 ICC组织中FOXA2的检测
兔抗人FOXA2多克隆抗体购于美国Abcam公司，DVB显色试剂盒和二步法免疫组化检测试剂盒均购于丹麦DAKO公司，EDTA抗原修复试剂购于北京中杉金桥生物技术有限公司。ICC组织经4%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片；在62 ℃烤箱内烘烤2 h后，经二甲苯脱蜡；梯度乙醇脱水后，采用3%过氧化酶阻断溶液室温下孵育10 min，再采用PBS液洗涤3次，5 min/次；采用EDTA缓冲液高压热力修复抗原20 min后，采用PBS液洗涤3次，5 min/次；滴加兔抗人FOXA2单克隆抗体（1 : 300）作为一抗，4 ℃过夜；添加生物素标记的兔二抗37 ℃温育0.5 h；最后行DAB显色，以苏木精复染细胞核。用PBS液代替一抗作为阴性对照，采用反复试验验证的已知阳性切片（肝组织）作为阳性对照。
1.3 免疫组化结果判定
FOXA2主要表达在ICC细胞的细胞核上，以细胞核见到棕褐色染色为阳性表达。依据半定量方法对阳性表达结果进行判定，每张切片随机选取5个高倍镜视野以观察细胞染色情况（取均值）：阳性细胞所占比例≤50%时判定为低表达，阳性细胞所占比例 > 50%时判定为高表达。
1.4 随访
患者术后均每3个月随访1次。随访内容包括肝肾功能、血常规、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、CA19-9、腹部超声/CT/MRI。术后复发定义为：与术前影像学检查图像相比出现新的病灶，伴/不伴肿瘤标志物升高，或经活检/手术切除证实复发。
1.5 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。服从正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，不服从正态分布的计量资料以中位数（M）表示，统计方法采用成组t检验或成组设计两样本比较的秩和检验；计数资料的统计方法采用成组χ2检验或Fisher确切概率法；生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法，生存分析单因素分析采用log-rank检验，多因素分析采用Cox比例风险回归模型。检验水准α=0.050。
2 结果
本组ICC患者中，FOXA2呈低表达50例（图 1），高表达35例（图 2）。
图1
免疫组化染色示FOXA2呈低表达（ABC ×200） 图 2 免疫组化染色示FOXA2呈高表达（ABC ×200）
2.1 ICC组织中FOXA2的表达与患者临床病理学特征的关系
ICC患者中FOXA2的表达与临床病理学特征的关系见表 1。由表 1可见，FOXA2表达与年龄、性别、肿瘤直径、多灶性、肿瘤分化程度、神经侵犯、微血管侵犯、卫星灶、肝硬变及CA19-9水平均无关（P > 0.050），而与TNM分期相关（P < 0.050），Ⅰ+Ⅱ期患者的高表达率高于Ⅲ+Ⅳ期患者。
表1
ICC组织中FOXA2表达与患者临床病理学特征的关系
2.2 ICC患者术后肿瘤复发的影响因素分析
术后所有患者均获访，随访时间3~73个月，中位数为15个月。随访期间65例肿瘤复发，64例死亡。单因素分析及多因素分析结果均表明，ICC患者术后复发与年龄、性别、肿瘤直径、多灶性、肿瘤分化程度、TNM分期、神经侵犯、微血管侵犯及肝硬变情况均无关（P > 0.050），而与卫星灶、FOXA2表达及CA19-9水平均相关（P < 0.050），存在卫星灶、FOXA2低表达及CA19-9水平升高者的术后复发率更高（表 2和表 3）。
表2
ICC患者术后复发影响因素的单因素分析结果
表3
ICC患者术后复发影响因素的多因素分析结果
2.3 ICC患者术后生存的影响因素分析
单因素分析结果表明，ICC患者术后生存与年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤分化程度、微血管侵犯及肝硬变均无关（P > 0.050），而与多灶性、TNM分期、神经侵犯、卫星灶、FOXA2表达及CA19-9水平均相关（P < 0.050），存在多灶性、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、有神经侵犯、存在卫星灶、FOXA2低表达及CA19-9水平升高患者的术后生存情况差（表 4）。多因素分析结果表明，ICC患者术后生存与神经侵犯、卫星灶、FOXA2表达及CA19-9水平均相关（P < 0.050），肿瘤神经侵犯、存在卫星灶、FOXA2低表达和术前CA19-9升高患者的术后生存差（表 5）。
表4
ICC患者术后死亡的单因素分析结果（例）
表5
ICC患者术后死亡的多因素分析结果
3 讨论
ICC起源于肝内胆管上皮细胞，在原发性肝癌中，其发病率仅次于肝细胞肝癌。目前ICC的病因尚不明确，可能与胆管慢性炎症及代谢性疾病相关[6]。ICC具有侵袭性强、转移早、切除率低等特征。既往的研究[10-12]显示，无论是行肝切除还是肝移植，ICC患者的预后均较肝细胞肝癌差。目前，手术切除仍然是ICC主要的根治性治疗手段，但ICC患者的术后复发率高，患者总体5年生存率约为20%~32% [6-8]。
3.1 FOXA2与肿瘤
FOXA是一类DNA结合区中的具有翼状螺旋结构的转录因子，已发现其3名成员（FOXA1、FOXA2和FOXA3）在哺乳动物胚胎期的器官形成、成体时期的新陈代谢和肿瘤的发生发展中起着重要作用[13-15]。在肝脏发育过程中，FOXA亚家族成员起着关键的调控作用，其在肝脏分化形成过程中扮演“先锋因子”的角色[13-14]。大量研究[16-19]表明，FOXA2在肝细胞肝癌、肺癌、乳腺癌及胰腺癌组织中的表达下调，提示FOXA2参与了肿瘤的发生与发展。Tang等[20]的研究显示，在肺癌组织中，FOXA2可结合slug，上调E-钙黏蛋白的表达，进而抑制上皮间充质转化。Zhang等[21]的研究显示，在乳腺癌组织中，FOXA2可促进转导素样分裂增强子3（TLE3）与E盒结合锌指蛋白2（ZEB2）结合，进而抑制上皮间充质转化过程。Song等[22]的研究显示，在胰腺肿瘤组织中，FOXA2的表达可导致E-钙黏蛋白基因的启动子广泛甲基化，从而使E-钙黏蛋白基因再活化。Wang等[16]的研究显示，FOXA2的表达上调后，其可通过抑制金属蛋白酶-9的表达，从而抑制肝细胞肝癌的转移和侵袭。
本组资料结果表明，ICC患者中FOXA2的表达与TNM分期相关（P < 0.050）。Ⅰ+Ⅱ期患者的高表达率高于Ⅲ+Ⅳ期患者。张正良等[23]针对胃癌的研究亦表明，在胃癌组织中，FOXA2的表达与胃癌的TNM分期有关；且在胃癌MKN-45细胞系中FOXA2过表达可以抑制胃癌细胞的侵袭。
3.2 ICC术后复发和生存的危险因素
本组资料结果表明，存在肿瘤卫星灶、FOXA2低表达及术前CA19-9水平升高均是ICC患者术后肿瘤复发的危险因素；肿瘤神经侵犯、存在卫星灶、FOXA2低表达和术前CA19-9水平升高均是患者预后差的危险因素。本组资料结果提示，CA19-9可能能反映ICC患者的预后。Nuzzo等[4]认为，ICC患者术前CA19-9水平 > 100 U/mL是患者术后早期复发的危险因素。Yoo等[24]认为，患者术后CA19-9水平的变化与患者术后的生存相关。本组结果与前述研究[4, 24]结论一致。本组资料结果同时还提示，肿瘤存在卫星灶亦是患者术后复发与死亡的危险因素。Sulpice等[25]的研究亦报道存在卫星灶的ICC患者术后更易于复发。这可能与存在卫星灶的患者更易于肝内转移相关。
3.3 FOXA2与ICC术后复发、生存的关系
本组资料结果表明，FOXA2低表达与患者术后复发与生存密切相关。最近，Kondratyeva等[26]的研究证实，在胰腺癌细胞中，FOXA2的低表达可以促进胰腺癌细胞的上皮间充质转化，从而增强癌细胞的侵袭转移能力。Smith等[27]对子宫内膜癌患者的研究提示，FOXA2是一种抑癌基因，具有抑制肿瘤生长的作用。这些可能亦是FOXA2低表达的ICC患者术后易于复发的原因。但目前针对FOXA2与ICC的研究较少，FOXA2表达影响ICC预后的具体机制尚不清楚。
综上所述，在ICC患者中，FOXA2的表达与TNM分期有关；此外，FOXA2低表达是ICC患者术后肿瘤复发与死亡的危险因素。但FOXA2表达影响ICC患者预后的具体机理目前尚不清楚，值得进一步研究。
