引用本文： 张乙川, 刘峰, 王俊, 徐杰, 杨茂辉, 李劲. 雷公藤红素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡研究. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(1): 48-51. doi: 10.7507/1007-9424.20160013 复制
肝癌是常见的恶性肿瘤之一，是引起癌症相关死亡的主要原因，目前对于肝癌并没有有效的治疗方案[1-3]。全世界每年大约有50万人罹患肝癌，而我国占全世界肝癌发病的50%以上，可见肝癌的高发趋势已十分严峻，应引起足够的重视[4-5]。
雷公藤红素是从中药雷公藤的根皮当中提取出的一种三萜类的天然产物[6-8]。2006年，中美两国科学家的经体内和体外抗癌机理研究证实，雷公藤红素是一种有效的抗癌活性成分，从此掀起了雷公藤红素抗癌研究的热潮[9-11]。相继发现雷公藤红素对前列腺癌、子宫癌、乳腺癌等多种癌症的癌细胞具有较强的杀伤作用[12-16]。然而，雷公藤红素对肝癌细胞增殖及凋亡影响的研究较少，因此，本研究以人肝癌SMMC-7721细胞为对象，观察了雷公藤红素对人肝癌SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响，并初步探讨其可能的作用机理，为其临床应用提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
雷公藤红素（纯度> 98%）购于中国药品生物制品检定所，CCK-8试剂盒购自碧云天生物科技有限公司，细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC/PI）购自GIBCO公司，Caspase-3活性检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，RPMI 1640培养基购于Hyclone公司，NF-κB p65抗体购于Cell Signaling Technology（Beverly，MA），β-actin（I-19）购于Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA）。
1.2 细胞培养
人肝癌细胞系SMMC-7721购于中国科学院上海细胞库。将SMMC-7721细胞置于含RPMI 1640培养液（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素）的培养瓶中，于37°C、5% CO2的恒温细胞培养箱中进行培养。
1.3 CCK-8实验
采用RPMI 1 640培养液将SMMC-7721细胞密度调整至5×104个/mL，以100μL每孔将细胞悬液接种于96孔板中间孔，细胞贴壁之后分别向培养液中加入用培养基稀释的浓度为1、2、及5μmol/L的雷公藤红素溶液100μL，细胞接受药物处理24、48及72 h后每孔加入10μL的CCK-8溶液，然后将细胞置于培养箱中继续培养，4 h后采用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的吸光度值（A值），计算细胞活力。
1.4 Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测
SMMC-7721细胞接受不同浓度的雷公藤红素（1、2、5μmol/L）处理24 h之后，采用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒及流式细胞仪（FACSCalibur，BD公司，San Jose，CA）检测细胞凋亡情况。
1.5 Caspase-3酶活性测定
SMMC-7721细胞接受2μmol/L的雷公藤红素处理6、12及24 h之后，采用Caspase-3活性检测试剂盒按照说明书对Caspase-3活性进行测定。采用空白对照组A值对药物处理组A值进行归一化。
1.6 Western blot实验
SMMC-7721细胞接受2μmol/L的雷公藤红素处理12、24及36 h之后，700×g离心10 min收集细胞，然后采用RIPA裂解液于4℃裂解15 min重悬细胞。采用BCA试剂盒对蛋白含量进行测定。然后采用Western blot法对NF-κB蛋白表达进行检测。
1.7 裸鼠成瘤实验
将24只6周龄裸鼠（由攀枝花学院提供，18～22 g、雌雄各半），于每只裸鼠右侧腋腹壁皮下接种SMMC-7721细胞悬液0.2 mL（5×106/100μL）。每日观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积，肿瘤体积=（D×d×π）/6（D表示肿瘤的长径，d表示肿瘤的短径）。当肿瘤体积约为80 mm3时，采用完全随机设计的方法的将裸鼠分为3组，每组8只。分别为对照组（含10%胎牛血清的DMEM培养液）、雷公藤红素低剂量组（15 mg/kg)及雷公藤红素高剂量组（30 mg/kg）。各组分别于腹腔注射相应的药物（雷公藤红素以含10%胎牛血清的DMEM培养液为溶剂），每次注射200μL，隔日注射，连续7次给药。于给药后的第16天处死裸鼠，剥离肿瘤，称取肿瘤质量。计算抑瘤率：抑瘤率=（对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量）/对照组平均瘤质量×100%。
1.8 统计学方法
采用SPSS 20进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（
2 结果
2.1 雷公藤红素对SMMC-7721细胞增殖的影响
结果见图 1。由图 1所示，雷公藤红素可以抑制SMMC-7721细胞的增殖，并呈现出时间和剂量依赖性。当药物浓度为2和5μmol/L时，呈现出明显的抑制作用（P < 0.05）。
图1
示不同浓度雷公藤红素对SMMC-7721细胞增殖的影响。同时相与1μL组比较，* P < 0.05；同浓度不同时相间比较，△P < 0.05 图 2 示不同浓度雷公藤红素诱导SMMC-7721细胞凋亡结果。2A：对照组；2B：雷公藤红素1μmol/L组；2C：雷公藤红素2μmol/L组；2D：雷公藤红素5μmol/L组 图 3 示SMMC-7721细胞接受2μmol/L的雷公藤红素处理6、12及24 h后Caspase-3活性变化。与6 h组比较，* P < 0.05
2.2 雷公藤红素诱导SMMC-7721细胞凋亡情况
结果见图 2。由图 2所示，雷公藤红素可以诱导SMMC-7721细胞出现凋亡，对照组细胞凋亡率为4.3%，而给药组（1、2、5μmol/L）的细胞凋亡率分别为7.2%、34.8和37.3%。结果表明雷公藤红素可以明显促进SMMC-7721细胞凋亡，当浓度为2和5μmol/L时，SMMC-7721细胞出现明显的凋亡（P < 0.05）。
图4
示SMCC-7721细胞接受2μmol/L雷公藤红素处理12、24及36 h后NF-κB蛋白表达检测结果
2.3 雷公藤红素对Caspase-3酶活性的影响
结果见图 3。由图 3所示，随着药物处理时间的延长，Caspase-3酶活性明显增强（P < 0.05）。提示Caspase-3在雷公藤红素诱导的细胞凋亡过程中可能发挥着重要的作用。
2.4 雷公藤红素对NF-κB蛋白表达的影响
结果见图 4。由图 4所示，随着药物处理时间的延长，NF-κB蛋白表达呈现下调趋势。提示雷公藤红素可能通过抑制人肝癌SMCC-7721细胞中NF-κB蛋白的表达，从而达到抑制细胞的增殖，促进细胞凋亡的作用。
2.5 雷公藤红素对裸鼠种植瘤生长的影响
在雷公藤红素对裸鼠种植瘤生长影响的实验中发现，高剂量和低剂量的雷公藤红素均可抑制种植瘤的生长，其中高剂量组与对照组比较差异具有统计学意义（P < 0.05）。该结果表明，雷公藤红素可以显著抑制裸鼠种植瘤生长，种植瘤体积和质量较对照组明显减小，其中低剂量组抑瘤率为26.27%，高剂量组抑瘤率为56.24%，抑瘤效果明显。见表 1。
表1
3组裸鼠种植瘤生长情况比较
3 讨论
本研究发现，雷公藤红素可以抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖并诱导其凋亡，并呈现一定的时间和剂量依赖性，同时裸鼠种植瘤实验显示雷公藤红素可以明显抑制裸鼠种植瘤的生长。
Caspase家族在细胞凋亡的过程中扮演着非常重要的角色，其中caspase-3为关键的执行分子，它在细胞凋亡信号传导的途径中发挥着重要的功能[17-19]。
本研究在细胞接受雷公藤红素处理后，采用Caspase-3活性检测试剂盒检测了Caspase-3活性，结果发现，Caspase-3活性明显增强，提示细胞接受雷公藤红素处理后，开始出现凋亡现象，雷公藤红素可能通过激活Caspase-3来诱导细胞凋亡。
有研究[20-25]发现，NF-κB信号通路在癌细胞的增殖和凋亡过程中发挥着重要的作用，包括骨髓瘤细胞、肝癌细胞等肿瘤细胞。因此，本研究采用Western blot法检测了SMMC-7721细胞NF-κB蛋白的表达，结果发现，随着雷公藤红素处理时间的延长，NF-κB蛋白表达呈现下调趋势。表明雷公藤红素可抑制人肝癌SMCC-7721细胞NF-κB蛋白的表达，从而达到抑制细胞增殖，促进细胞凋亡的作用。裸鼠种植瘤实验显示，30 mg/kg的雷公藤红素可以明显降低裸鼠种植瘤的体积和质量，最终抑制肿瘤的增长。
综上所述，雷公藤红素可以抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖并诱导其凋亡，裸鼠成瘤实验显示雷公藤红素可以抑制裸鼠种植瘤的生长。这种作用的发挥可能是通过激活Caspase-3和抑制NF-κB通路诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡来实现的。
肝癌是常见的恶性肿瘤之一，是引起癌症相关死亡的主要原因，目前对于肝癌并没有有效的治疗方案[1-3]。全世界每年大约有50万人罹患肝癌，而我国占全世界肝癌发病的50%以上，可见肝癌的高发趋势已十分严峻，应引起足够的重视[4-5]。
雷公藤红素是从中药雷公藤的根皮当中提取出的一种三萜类的天然产物[6-8]。2006年，中美两国科学家的经体内和体外抗癌机理研究证实，雷公藤红素是一种有效的抗癌活性成分，从此掀起了雷公藤红素抗癌研究的热潮[9-11]。相继发现雷公藤红素对前列腺癌、子宫癌、乳腺癌等多种癌症的癌细胞具有较强的杀伤作用[12-16]。然而，雷公藤红素对肝癌细胞增殖及凋亡影响的研究较少，因此，本研究以人肝癌SMMC-7721细胞为对象，观察了雷公藤红素对人肝癌SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响，并初步探讨其可能的作用机理，为其临床应用提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
雷公藤红素（纯度> 98%）购于中国药品生物制品检定所，CCK-8试剂盒购自碧云天生物科技有限公司，细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC/PI）购自GIBCO公司，Caspase-3活性检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，RPMI 1640培养基购于Hyclone公司，NF-κB p65抗体购于Cell Signaling Technology（Beverly，MA），β-actin（I-19）购于Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA）。
1.2 细胞培养
人肝癌细胞系SMMC-7721购于中国科学院上海细胞库。将SMMC-7721细胞置于含RPMI 1640培养液（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素）的培养瓶中，于37°C、5% CO2的恒温细胞培养箱中进行培养。
1.3 CCK-8实验
采用RPMI 1 640培养液将SMMC-7721细胞密度调整至5×104个/mL，以100μL每孔将细胞悬液接种于96孔板中间孔，细胞贴壁之后分别向培养液中加入用培养基稀释的浓度为1、2、及5μmol/L的雷公藤红素溶液100μL，细胞接受药物处理24、48及72 h后每孔加入10μL的CCK-8溶液，然后将细胞置于培养箱中继续培养，4 h后采用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的吸光度值（A值），计算细胞活力。
1.4 Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测
SMMC-7721细胞接受不同浓度的雷公藤红素（1、2、5μmol/L）处理24 h之后，采用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒及流式细胞仪（FACSCalibur，BD公司，San Jose，CA）检测细胞凋亡情况。
1.5 Caspase-3酶活性测定
SMMC-7721细胞接受2μmol/L的雷公藤红素处理6、12及24 h之后，采用Caspase-3活性检测试剂盒按照说明书对Caspase-3活性进行测定。采用空白对照组A值对药物处理组A值进行归一化。
1.6 Western blot实验
SMMC-7721细胞接受2μmol/L的雷公藤红素处理12、24及36 h之后，700×g离心10 min收集细胞，然后采用RIPA裂解液于4℃裂解15 min重悬细胞。采用BCA试剂盒对蛋白含量进行测定。然后采用Western blot法对NF-κB蛋白表达进行检测。
1.7 裸鼠成瘤实验
将24只6周龄裸鼠（由攀枝花学院提供，18～22 g、雌雄各半），于每只裸鼠右侧腋腹壁皮下接种SMMC-7721细胞悬液0.2 mL（5×106/100μL）。每日观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积，肿瘤体积=（D×d×π）/6（D表示肿瘤的长径，d表示肿瘤的短径）。当肿瘤体积约为80 mm3时，采用完全随机设计的方法的将裸鼠分为3组，每组8只。分别为对照组（含10%胎牛血清的DMEM培养液）、雷公藤红素低剂量组（15 mg/kg)及雷公藤红素高剂量组（30 mg/kg）。各组分别于腹腔注射相应的药物（雷公藤红素以含10%胎牛血清的DMEM培养液为溶剂），每次注射200μL，隔日注射，连续7次给药。于给药后的第16天处死裸鼠，剥离肿瘤，称取肿瘤质量。计算抑瘤率：抑瘤率=（对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量）/对照组平均瘤质量×100%。
1.8 统计学方法
采用SPSS 20进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（
2 结果
2.1 雷公藤红素对SMMC-7721细胞增殖的影响
结果见图 1。由图 1所示，雷公藤红素可以抑制SMMC-7721细胞的增殖，并呈现出时间和剂量依赖性。当药物浓度为2和5μmol/L时，呈现出明显的抑制作用（P < 0.05）。
图1
示不同浓度雷公藤红素对SMMC-7721细胞增殖的影响。同时相与1μL组比较，* P < 0.05；同浓度不同时相间比较，△P < 0.05 图 2 示不同浓度雷公藤红素诱导SMMC-7721细胞凋亡结果。2A：对照组；2B：雷公藤红素1μmol/L组；2C：雷公藤红素2μmol/L组；2D：雷公藤红素5μmol/L组 图 3 示SMMC-7721细胞接受2μmol/L的雷公藤红素处理6、12及24 h后Caspase-3活性变化。与6 h组比较，* P < 0.05
2.2 雷公藤红素诱导SMMC-7721细胞凋亡情况
结果见图 2。由图 2所示，雷公藤红素可以诱导SMMC-7721细胞出现凋亡，对照组细胞凋亡率为4.3%，而给药组（1、2、5μmol/L）的细胞凋亡率分别为7.2%、34.8和37.3%。结果表明雷公藤红素可以明显促进SMMC-7721细胞凋亡，当浓度为2和5μmol/L时，SMMC-7721细胞出现明显的凋亡（P < 0.05）。
图4
示SMCC-7721细胞接受2μmol/L雷公藤红素处理12、24及36 h后NF-κB蛋白表达检测结果
2.3 雷公藤红素对Caspase-3酶活性的影响
结果见图 3。由图 3所示，随着药物处理时间的延长，Caspase-3酶活性明显增强（P < 0.05）。提示Caspase-3在雷公藤红素诱导的细胞凋亡过程中可能发挥着重要的作用。
2.4 雷公藤红素对NF-κB蛋白表达的影响
结果见图 4。由图 4所示，随着药物处理时间的延长，NF-κB蛋白表达呈现下调趋势。提示雷公藤红素可能通过抑制人肝癌SMCC-7721细胞中NF-κB蛋白的表达，从而达到抑制细胞的增殖，促进细胞凋亡的作用。
2.5 雷公藤红素对裸鼠种植瘤生长的影响
在雷公藤红素对裸鼠种植瘤生长影响的实验中发现，高剂量和低剂量的雷公藤红素均可抑制种植瘤的生长，其中高剂量组与对照组比较差异具有统计学意义（P < 0.05）。该结果表明，雷公藤红素可以显著抑制裸鼠种植瘤生长，种植瘤体积和质量较对照组明显减小，其中低剂量组抑瘤率为26.27%，高剂量组抑瘤率为56.24%，抑瘤效果明显。见表 1。
表1
3组裸鼠种植瘤生长情况比较
3 讨论
本研究发现，雷公藤红素可以抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖并诱导其凋亡，并呈现一定的时间和剂量依赖性，同时裸鼠种植瘤实验显示雷公藤红素可以明显抑制裸鼠种植瘤的生长。
Caspase家族在细胞凋亡的过程中扮演着非常重要的角色，其中caspase-3为关键的执行分子，它在细胞凋亡信号传导的途径中发挥着重要的功能[17-19]。
本研究在细胞接受雷公藤红素处理后，采用Caspase-3活性检测试剂盒检测了Caspase-3活性，结果发现，Caspase-3活性明显增强，提示细胞接受雷公藤红素处理后，开始出现凋亡现象，雷公藤红素可能通过激活Caspase-3来诱导细胞凋亡。
有研究[20-25]发现，NF-κB信号通路在癌细胞的增殖和凋亡过程中发挥着重要的作用，包括骨髓瘤细胞、肝癌细胞等肿瘤细胞。因此，本研究采用Western blot法检测了SMMC-7721细胞NF-κB蛋白的表达，结果发现，随着雷公藤红素处理时间的延长，NF-κB蛋白表达呈现下调趋势。表明雷公藤红素可抑制人肝癌SMCC-7721细胞NF-κB蛋白的表达，从而达到抑制细胞增殖，促进细胞凋亡的作用。裸鼠种植瘤实验显示，30 mg/kg的雷公藤红素可以明显降低裸鼠种植瘤的体积和质量，最终抑制肿瘤的增长。
综上所述，雷公藤红素可以抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖并诱导其凋亡，裸鼠成瘤实验显示雷公藤红素可以抑制裸鼠种植瘤的生长。这种作用的发挥可能是通过激活Caspase-3和抑制NF-κB通路诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡来实现的。
