引用本文： 郭恩玲, 孔静, 刘彬彬, 姜清泉. 生物型人工肝模型的建立及其在实验中的应用. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(9): 1137-1142. doi: 10.7507/1007-9424.20150296 复制
人工肝是模拟人体肝脏的一种模型，根据性质不同分为非生物型人工肝、生物型人工肝及混合型人工肝3种。非生物型人工肝包括血液灌流、血浆置换、血液滤过、血浆透析滤过、白蛋白透析等方法；生物型人工肝通过在体外培养的肝细胞的基础上建立体外生物装置以代替衰竭的肝功能；混合型人工肝联合了非生物型人工肝的解毒功能与生物型人工肝的合成、转化等功能。生物型人工肝模型广泛应用于有关肝脏的各种研究中，如药物对肝脏的毒性研究、不同肝病的病因研究、肝脏的药代动力学变化研究等。同时，由于国内肝移植的供体稀缺，人工肝模型的建立亦可以有效解决肝供体短缺的问题。在肝细胞的分离和培养及生物型人工肝模型的建立方面，国内外的研究方法众多，笔者现就肝细胞的分离、培养等作一综述，以为日后各项研究提供参考。
1 肝细胞的取材
1.1 人体
人肝细胞是最理想的人工肝材料，但其取材较困难，受到伦理学的限制，仅能从手术切除的部分肝组织中获得，且其取下的肝组织多为不健康肝源，造成其相应研究结果受到很大的影响。
1.2 大鼠和小鼠
在鼠的肝细胞方面，从分离到培养技术都较为成熟，且其肝细胞模型的建立对于研究药理、毒理及疾病病因方面均有着深刻的意义。
1.3 猪
猪肝细胞曾一度成为生物型人工肝领域中应用较多的肝细胞，因为猪肝细胞的细胞色素P450（CYP450）含量及其代谢能力与人肝细胞最为接近，所以其代谢功能和人肝细胞有很多相同之处。此外，其混合氧化酶的高水平表达正是代偿肝功能衰竭患者解毒功能的重要基础[1]。与人肝细胞比较，猪肝细胞的取材范围广、细胞分离方法可以有多重选择、可以大量制备、细胞活力较好及细胞培养效果良好[2]，但在培养过程中发现维持猪肝细胞功能的时间较短，一般短于10 d，且难以传代培养，不易于开展实验室大量生产和制备；此外，其存在免疫反应和传染病毒的潜在高危风险，因此将猪肝细胞用于生物型人工肝领域仍有其局限性[3]。
2 肝细胞的分离方法
2.1 机械分离法
2.1.1 单纯剪切法
肝组织离体后，将其剪成小块，再通过震荡、挤压等物理手段进一步分离肝细胞。该方法的操作简单，成本低，但获得的单细胞的数量较少，且对肝细胞的破坏较大，部分损伤也不可逆，在之后的培养过程中，细胞的存活率低。该方法不限肝细胞的取材，因此较易获得肝细胞。1961年，Hillis等[4]最早采用此方法进行了人胚肝细胞的培养。但是在培养过程中，由于成纤维细胞增殖能力极强，在其增殖与分化的过程中，其与肝实质细胞的形态相似，不易区分，从而难以观察肝细胞的数目、生长情况及分化程度[5]。此外，在培养胚胎肝细胞的过程中，未分化肝细胞的分化及功能获得与正常肝细胞有一定差异，因而此法比较局限[6]。该方法现已被弃用，但对于某些需要获得大量肝细胞的实验，也可采用该方法。
2.1.2 剪切螯合法
在上述方法的基础上，用含有能结合Ca2+的螯合剂〔如枸橼酸盐或乙二胺四乙酸（EDTA）等）〕的消化液进行螯合消化，通过螯合肝细胞间的Ca2+依赖性黏附因子，使细胞间桥粒断裂而获得单个的肝细胞。单独使用螯合剂的效果并不理想，常需与下面介绍的酶消化法联合使用。
2.2 酶消化法
2.2.1 胰酶消化法
该方法通过胰酶来破坏细胞间质——肝细胞之间的桥连，以获得游离的肝细胞。但该方法的缺点也较为明显，由于胰蛋白酶为强消化酶，消化作用较强，不仅能消化细胞间质，也能消化细胞本身，因此对酶的浓度以及酶的作用时间的要求较严格，如控制不当，会造成大量肝细胞死亡，导致无法进行细胞培养。
2.2.2 胶原酶消化法
该方法通过胶原酶来破坏肝细胞之间的桥连，以获得游离的肝细胞。其优点是不仅能得到较多的肝细胞，而且肝细胞的活性佳；但相对来说，该方法的费用较高。该方法对取材要求不限，在温度较低的环境下，将肝脏直接分离后置于培养基中剪碎，随后加入胶原酶，破坏肝细胞间的连接，再经震荡、沉淀，最后离心获得上清液，以取得游离的肝细胞悬液。该方法的关键在于对酶浓度和消化时间的调节。此方法的应用范围有一定的局限，仅适用于涉及肝细胞功能、肝细胞对外界的反应等少部分研究。需要注意的是，在成年鼠肝脏的分离培养中，由于成年鼠的肝组织连接多而紧密，分离困难，若剪得过于碎小，则边缘的肝细胞多已遭到破坏，不易成活；若肝脏的分离块过大，则造成消化时，中心的细胞未能接触到胶原酶，没能得到消化，周边的细胞却因消化过度而被破坏。在培养胚胎肝细胞时，又有细胞未分化的缺点，此时成纤维细胞大量增生，同时混有大量血细胞，肝细胞的纯度降低，故不常采用。Howard等[7]开启了胶原酶分离肝细胞的先河，他们在19世纪70年代中期，运用机械分离法+酶消化法分离鼠的肝细胞获得成功，而后Berry等[8]将此方法进一步改善并开创了Seglen改良的两步胶原酶灌注法。现在Seglen改良的两步胶原酶灌注法已广泛应用于各种有关肝脏功能的实验研究中。此后众多研究者对Seglen改良的两步胶原酶灌注法加以改进，以探索更优的实验步骤，使对肝细胞的损伤降至最小，以更有利于肝细胞的培养[9]。
2.3 灌流消化法
该方法在原始的胶原酶消化法的基础上进一步发展而来，可以广泛应用于各种实验动物的研究中。现将其影响因素一一进行阐述如下。
2.3.1 Ca2+的作用
Ca2+主要影响肝细胞间的分离方式和胶原酶的活性。肝细胞通过缝隙连接、紧密连接、桥粒以及由上述任何两种连接方式形成的复合连接进行连接。其中桥粒是Ca2+依赖性连接，因此在灌注时应选用Ca2+螯合剂，同时应选用无Ca2+的灌注液进行灌注，这样通过桥粒连接的细胞膜会分解成为只含有半个桥粒的核小体，有助于肝细胞的分离。但是为提高胶原酶的活性，需要将Ca2+的浓度维持在0.05% [9]。对于其机理，Berry等[9]认为，Ca2+的浓度能影响细胞内外的Na+、K+平衡，使Na+、K+平衡紊乱，导致肝细胞坏死，从而影响肝细胞的分离及培养。
2.3.2 胶原酶的选择及灌流速度
由于胶原酶的价格较为昂贵，因此对胶原酶的浓度及速度选择一直困惑着大多实验者。Sudhakaran等[10]认为，胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ的肝细胞分离效果更好。近来胶原酶的选择日益多样化，Shen等[11]在分离成年大鼠的肝细胞时采用的是胶原酶Ⅱ，他认为，配制好的胶原酶Ⅱ应该在30 min内用完，否则胶原酶的活性将会大大降低。而在分离小鼠的肝细胞时，Edwards等[12]选择的是胶原酶H。对于灌流速度，一般采取高速（40～50 mL/min）灌流法和低速（5 mL/min）灌流法。高速灌流法的缺点在于即使重复使用胶原酶，也会造成胶原酶的用量较大，浪费过多，导致实验费用增高。但相对来说，此法对肝细胞的分离效果较好。而低速灌流法使用的胶原酶量相对较少，较为经济，但分离效果相对较差。不管选用哪一种方法，都应对灌流的操作进行把关，因灌流过程中存在气泡或混入其他杂质致肝脏血管阻塞时，都会影响灌注的效果。
2.3.3 pH值和缓冲液
灌注液的pH值应保持在7.4～7.6之间（与培养基的pH值接近）。若偏离此范围，将影响胶原酶的活性，因此缓冲液起到了关键的作用。Seglen [13]认为，有机缓冲液〔4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）〕较为简单而实用。
2.3.4 灌流液温度的控制
配制好的灌流液在灌流前应保存在42 ℃的恒温箱中，这样可以使其在灌注过程中达到37 ℃[12]。另外，在灌注过程中应保持灌注液的温度为37 ℃，这样可以保证灌注液发挥更好的作用，同时可以避免细胞凋亡。
2.3.5 插管方式的选择
插管方式包括经典的门静脉插管、左心室插管、右心房的肝上下腔静脉插管等。经典的门静脉插管法：穿刺针插入门静脉后，启动蠕动泵，同时剪断肝上下腔静脉远端，用灌注液快速经门静脉灌注以清除肝内血液，使肝脏呈米黄色。当下腔静脉中流出的液体变清时，开始灌注消化酶液以充分消化肝脏，直至肝脏表面出现龟裂状裂隙且变软[14-15]。这种方法已在大鼠的肝细胞分离方面得到了广泛的应用，同时其也可以在一些较大的动物上使用。而对于小鼠来说，其门静脉较细，插管技术需要进一步提升。Ouji等[16]提出了一种新的插管方式，即从鼠的左心室插入针头，利用血液循环通路将灌注液灌注到肝脏内。通过这种插管方式获得的细胞数量为3.1×106～6.3×107个，活性为（89.3±6.5）%；而经典的门静脉插管法获得的细胞数量为（2.2～5.2）×107个，活性为（83.3±4.1）%，两者差异不大[16]。故Ouji等[16]认为，左心室插管法可等同于经典的门静脉插管法，并具有操作简单的优点，适用于体型较小的鼠，尤其是新生鼠的肝细胞分离。余招焱等[17]也提出了一种新的插管方法，即在肾脏平面以上结扎肝上下腔静脉，剪断肝蒂，剪开胸廓及肝脏上方的两侧膈肌，通过右心房裂口向下方插入肝上下腔静脉。由于右心房犹如漏斗状的外形使得插管过程较为简便，实验者通过短期的学习较易掌握这种插管方式。其实验结果也证实了此插管方法的可行性[17]，避免了门静脉穿透后无法继续进行插管导致的实验动物死亡（因大出血而死亡），避免了实验失败。同时，下腔静脉的管径较粗，可以承受较大的液体灌注量而不至于发生血管破裂等，有利于肝脏的均匀灌注[17]。
2.4 细胞纯化
提取肝细胞后，用细胞刮板将肝细胞分散到含有培养基的培养皿内，用100 μm或者200 μm不锈钢筛目过滤细胞液，以去除结缔组织和未消化的细胞。然后在4 ℃的条件下离心（50×g，3 min），吸取上层清液后，重新悬浮，再离心两次（条件同前）。Shen等[11]提出，在第三次离心过程中，以部分percoll液代替部分培养基，则经过离心后，可形成连续的浓度梯度，坏死的细胞将在上层，而底部则是可进行培养的细胞。
3 肝细胞的培养条件
肝细胞的功能包括白蛋白分泌和尿素合成，其表达CYP3A4基因。肝细胞表面可分为血窦面、肝细胞连接面和胆小管面三面。例如，胆汁酸分泌到胆管时会通过胆小管面，而白蛋白分泌到血液循环中则是通过在血窦面的窦周隙完成物质交换而实现的。胆小管面将肝细胞分成两个基底面，在肝细胞培养过程中，基底面将会和细胞外基质贴合，所以细胞外基质在肝细胞的培养过程中发挥着重要作用[18]。研究者对肝细胞的培养液进行了不断探索，在培养液中添加抗生素、生长因子、鼠尾胶原、胰岛素、胰高血糖素、地塞米松等，以实现不同的目的。
3.1 培养液的选择
目前用到的基础培养液有DMEM、RPMI 1640、L-15、Hepatozyme-SFM、Willams’E完全培养基等，其中DMEM培养基较为常用。周星辉等[19]指出，在原代肝细胞出现增殖前（培养1～5 d），DMEM培养基的培养效果明显好于RPMI 1640培养基。Willams’E完全培养基的成份适合肝细胞培养，但此培养基的价格相对昂贵。
3.2 培养液的添加物
3.2.1 胰岛素
胰岛素的作用是使接种的细胞更容易存活，促进核蛋白磷酸化。另外，胰岛素具有特异性生长因子的作用，能结合到生长因子受体上，有利于球蛋白、糖原和DNA合成，以及脂肪生成；同时，其能催化许多酶类，如乙酰-辅酶A羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6P）、葡萄糖激酶、酪氨酸转化酶及鸟氨酸脱氢酶，尤其是在胰岛素和上皮细胞生长因子（EGF）的协同作用下能诱导合成鸟氨酸脱氢酶[20]。胰岛素和胰高血糖素都有促进肝细胞再生的作用[21]。
3.2.2 地塞米松
地塞米松的作用是使细胞分裂相增多，并使毛细胆管样结构扩张明显。随着地塞米松浓度的递增，毛细胆管样结构扩张的程度也会发生改变：在0.5 μmol/L浓度下，地塞米松就可以引起毛细胆管样结构扩张；在5～20 μmol/L浓度时细胞状态好，并且可以引起毛细胆管样结构明显扩张[22]。
3.2.3 血清
血清的作用是提供肝细胞生长所需要的营养，但过多的血清会导致成纤维细胞大量生长。现大多数研究者选用胎牛血清。研究[23]表明，血清中含有一些生长因子和激素，其能结合肝细胞表面的各种生长因子受体和激素受体，能促进肝细胞的生长、分化及增殖，同时对维持肝细胞的生物学功能也具有重要意义。
3.2.4 生长因子
生长因子主要有EGF、肝细胞生长因子（HGF）等。EGF的作用是通过提高细胞的DNA合成能力，从而刺激细胞的增殖。EGF是一种很强的促细胞分裂因子，其还具有促进肝细胞的氨基酸转运、蛋白合成等功能，这可能是因为EGF可以明显降低臭氧所致的3H释放、消除臭氧降低细胞内还原型谷胱甘肽含量的作用，增加细胞内谷胱甘肽总含量，进而减少细胞膜的脂质过氧化[24]。
3.3 聚苯乙烯培养板
聚苯乙烯培养板最常用于HepG2细胞株（人肝癌细胞）的培养中，以及人和其他动物的肝细胞的培养中[25]。
4 肝细胞的培养方法
4.1 传统的单层胶原培养
该方法的优点在于操作较为简单，但肝细胞的生存时间较短，一般不会超过1周；同时培养出的肝细胞的功能也受到不同程度的影响，不能培养出肝细胞的极性；肝细胞培养12～24 h后其丧失间隙连接，3～5 d后细胞呈扁平状，并失去其特异的分泌功能，最终于1～2周内死亡[26]。
4.2 三明治双层胶原培养
该方法的培养环境较传统的单层胶原培养法更接近肝细胞在体内的环境，从形态和功能上恢复了肝细胞的极性，改善了细胞基质的拓扑结构，国外已用于小规模的生物型人工肝构型[27-28]。Choi等[29]认为，三明治双层胶原培养法能为肝细胞提供一个更接近于体内的几何形状的环境，细胞表现出胆小管面、基底面和Disse间隙；同时，他通过分析抗胰蛋白酶α1（AAT）、肝细胞核因子4α（HNF4A）、甲胎蛋白、白蛋白、酪氨酸氨基转移酶（TAT）基因、G6P、色氨酸氧化酶（TO）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的表达情况，从而证实了三明治双层胶原培养法的效果明显优于单层胶原培养法。
胶原蛋白对肝细胞有很强的黏附能力，能较长时间地维持细胞活力状态，有效地保持和诱导细胞分化[30]。国内张先杰等[31]运用三明治双层胶原培养法培养肝细胞，结果肝细胞在48 h内形成胆小管，并发展成肝板样结构；肝细胞相对扁平，个体细胞的收缩明显，阻止了细胞的进一步延伸；肝细胞呈多边形，其胞浆浓缩，大多数细胞呈单核或双核；同时蛋白分泌功能稳定，蛋白水平持续增高。原代培养的肝细胞在药物代谢研究中得到了广泛的应用。Komoroski等[32]研究了金丝桃素（St John’s Wort）对人原代肝细胞的诱导和抑制作用，同时探讨了金丝桃素和贯叶金丝桃素对人原代肝细胞中CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4基因的表达、蛋白含量及其酶活性的影响，结果表明，原代培养的肝细胞能成为检测中草药产物对CYP450酶影响的体外通用模型。Cai等[33]利用原代培养的大鼠肝细胞模型证实了四氯化碳诱导的肝毒性是通过氧化损伤造成的，此模型在药物代谢及毒理学中都得到了广泛的应用。
4.3 微载体培养
微载体通常适用于贴壁依赖型细胞生长的微珠，它的直径为60～250 μm [34]。它增大了细胞的培养面积，同时使细胞处于均一的环境，由于更加符合体内三维立体环境，从而避免了细胞接触抑制的发生。其能够控制温度、pH值、CO2等培养系统环境条件，并能观察微珠上细胞的生长情况。该培养方法为均相培养，可高效地利用培养基，并兼有单层培养和悬浮培养的优势[35]。匡洁等[36]探索出了一种新型的微囊包载体肝细胞培养模式，由于微载体有单层培养无法比拟的体表面积（4 600 cm2/g），利用微载体Cytodex3可在较短时间及较小空间内达到高密度细胞培养的目的[36]。通过连接设计良好的生物反应器来辅助微载体培养，然后根据细胞的增殖情况适时增加微载体，最高可使细胞密度达10倍以上[37]。
利用海藻酸钠/壳聚糖/海藻酸钠（ACA）微囊免疫隔离的功能，使微载体在囊内对细胞起立体支撑作用，则细胞的生存环境更加符合体内环境，更有利于细胞活性的维持[38]。采用微载体模式培养肝细胞，可观察到白蛋白水平呈逐渐升高的趋势[36]。近年来，有不少学者通过不断分析肝细胞周围的基质成分、在制备微囊的过程中模拟肝细胞周围的基质成分、向ACA溶液中添加木糖葡聚糖等物质，使肝细胞的功能得到进一步提升[39]。肝细胞在微囊内聚集成球形三维结构，细胞间接触良好，可进行较大规模培养。可将微囊化肝细胞置入容器内，以血液或血浆直接进行灌流，以应用于异种肝细胞移植[40]。
5 生物反应器
生物反应器是生物型人工肝的主要功能部件，决定了生物型人工肝的治疗效果。生物反应器必须具备以下功能：①提供给肝细胞一个良好的生长代谢环境；②提供一个血液或血浆与肝细胞相互作用的场所；③避免宿主免疫系统对肝细胞的损伤；④为肝细胞提供高通量的物质交换效能[41]。目前，生物型人工肝最常用的生物反应器是半透膜中空纤维型生物反应器。使用半透膜中空纤维型生物反应器时，一般将肝细胞种植于纤维管的外表面，血浆通过中空纤维毛细管柱对肝细胞进行灌注，肝细胞通过多孔质的中空纤维壁与血浆进行自由分子交换，从而达到吸收氧和营养物质的目的，并发挥解毒功能和代谢产物的功能[42]。
6 小结
对于供体的选择要根据不同的实验目的采取不同的细胞来源。在对肝细胞进行分离的过程中，单纯的机械分离和胰酶/胶原酶消化法可以同时使用，以达到协同作用的目的。但是，即使同时使用机械分离和胰酶/胶原酶消化，也会造成肝细胞的存活率较低，肝细胞的纯度较差。现在应用较多的是胶原酶灌注的方法，虽然此种方法较为繁琐，对实验者的要求较高，因实验者要根据具体情况略微调整浓度、灌流时间、培养基种类等，但该方法极大地改善了肝细胞的存活率和肝细胞的纯度，对于接下来的肝细胞培养奠定了基础。在肝细胞的培养过程中，各研究者经过不断的探索，从传统的单层胶原培养到三明治双层胶原培养，再到微载体培养，不断地在体外寻找能更好地模拟体内、更适合肝细胞生长的环境。肝细胞的分离和培养还需要更多的研究者进行不断探索，且各种方法均存在着各种各样的不足，这些不足等待着更多的研究者去克服和改善。对生物反应器的不断探索，将对生物型人工肝的广泛临床应用起到关键的作用。
人工肝是模拟人体肝脏的一种模型，根据性质不同分为非生物型人工肝、生物型人工肝及混合型人工肝3种。非生物型人工肝包括血液灌流、血浆置换、血液滤过、血浆透析滤过、白蛋白透析等方法；生物型人工肝通过在体外培养的肝细胞的基础上建立体外生物装置以代替衰竭的肝功能；混合型人工肝联合了非生物型人工肝的解毒功能与生物型人工肝的合成、转化等功能。生物型人工肝模型广泛应用于有关肝脏的各种研究中，如药物对肝脏的毒性研究、不同肝病的病因研究、肝脏的药代动力学变化研究等。同时，由于国内肝移植的供体稀缺，人工肝模型的建立亦可以有效解决肝供体短缺的问题。在肝细胞的分离和培养及生物型人工肝模型的建立方面，国内外的研究方法众多，笔者现就肝细胞的分离、培养等作一综述，以为日后各项研究提供参考。
1 肝细胞的取材
1.1 人体
人肝细胞是最理想的人工肝材料，但其取材较困难，受到伦理学的限制，仅能从手术切除的部分肝组织中获得，且其取下的肝组织多为不健康肝源，造成其相应研究结果受到很大的影响。
1.2 大鼠和小鼠
在鼠的肝细胞方面，从分离到培养技术都较为成熟，且其肝细胞模型的建立对于研究药理、毒理及疾病病因方面均有着深刻的意义。
1.3 猪
猪肝细胞曾一度成为生物型人工肝领域中应用较多的肝细胞，因为猪肝细胞的细胞色素P450（CYP450）含量及其代谢能力与人肝细胞最为接近，所以其代谢功能和人肝细胞有很多相同之处。此外，其混合氧化酶的高水平表达正是代偿肝功能衰竭患者解毒功能的重要基础[1]。与人肝细胞比较，猪肝细胞的取材范围广、细胞分离方法可以有多重选择、可以大量制备、细胞活力较好及细胞培养效果良好[2]，但在培养过程中发现维持猪肝细胞功能的时间较短，一般短于10 d，且难以传代培养，不易于开展实验室大量生产和制备；此外，其存在免疫反应和传染病毒的潜在高危风险，因此将猪肝细胞用于生物型人工肝领域仍有其局限性[3]。
2 肝细胞的分离方法
2.1 机械分离法
2.1.1 单纯剪切法
肝组织离体后，将其剪成小块，再通过震荡、挤压等物理手段进一步分离肝细胞。该方法的操作简单，成本低，但获得的单细胞的数量较少，且对肝细胞的破坏较大，部分损伤也不可逆，在之后的培养过程中，细胞的存活率低。该方法不限肝细胞的取材，因此较易获得肝细胞。1961年，Hillis等[4]最早采用此方法进行了人胚肝细胞的培养。但是在培养过程中，由于成纤维细胞增殖能力极强，在其增殖与分化的过程中，其与肝实质细胞的形态相似，不易区分，从而难以观察肝细胞的数目、生长情况及分化程度[5]。此外，在培养胚胎肝细胞的过程中，未分化肝细胞的分化及功能获得与正常肝细胞有一定差异，因而此法比较局限[6]。该方法现已被弃用，但对于某些需要获得大量肝细胞的实验，也可采用该方法。
2.1.2 剪切螯合法
在上述方法的基础上，用含有能结合Ca2+的螯合剂〔如枸橼酸盐或乙二胺四乙酸（EDTA）等）〕的消化液进行螯合消化，通过螯合肝细胞间的Ca2+依赖性黏附因子，使细胞间桥粒断裂而获得单个的肝细胞。单独使用螯合剂的效果并不理想，常需与下面介绍的酶消化法联合使用。
2.2 酶消化法
2.2.1 胰酶消化法
该方法通过胰酶来破坏细胞间质——肝细胞之间的桥连，以获得游离的肝细胞。但该方法的缺点也较为明显，由于胰蛋白酶为强消化酶，消化作用较强，不仅能消化细胞间质，也能消化细胞本身，因此对酶的浓度以及酶的作用时间的要求较严格，如控制不当，会造成大量肝细胞死亡，导致无法进行细胞培养。
2.2.2 胶原酶消化法
该方法通过胶原酶来破坏肝细胞之间的桥连，以获得游离的肝细胞。其优点是不仅能得到较多的肝细胞，而且肝细胞的活性佳；但相对来说，该方法的费用较高。该方法对取材要求不限，在温度较低的环境下，将肝脏直接分离后置于培养基中剪碎，随后加入胶原酶，破坏肝细胞间的连接，再经震荡、沉淀，最后离心获得上清液，以取得游离的肝细胞悬液。该方法的关键在于对酶浓度和消化时间的调节。此方法的应用范围有一定的局限，仅适用于涉及肝细胞功能、肝细胞对外界的反应等少部分研究。需要注意的是，在成年鼠肝脏的分离培养中，由于成年鼠的肝组织连接多而紧密，分离困难，若剪得过于碎小，则边缘的肝细胞多已遭到破坏，不易成活；若肝脏的分离块过大，则造成消化时，中心的细胞未能接触到胶原酶，没能得到消化，周边的细胞却因消化过度而被破坏。在培养胚胎肝细胞时，又有细胞未分化的缺点，此时成纤维细胞大量增生，同时混有大量血细胞，肝细胞的纯度降低，故不常采用。Howard等[7]开启了胶原酶分离肝细胞的先河，他们在19世纪70年代中期，运用机械分离法+酶消化法分离鼠的肝细胞获得成功，而后Berry等[8]将此方法进一步改善并开创了Seglen改良的两步胶原酶灌注法。现在Seglen改良的两步胶原酶灌注法已广泛应用于各种有关肝脏功能的实验研究中。此后众多研究者对Seglen改良的两步胶原酶灌注法加以改进，以探索更优的实验步骤，使对肝细胞的损伤降至最小，以更有利于肝细胞的培养[9]。
2.3 灌流消化法
该方法在原始的胶原酶消化法的基础上进一步发展而来，可以广泛应用于各种实验动物的研究中。现将其影响因素一一进行阐述如下。
2.3.1 Ca2+的作用
Ca2+主要影响肝细胞间的分离方式和胶原酶的活性。肝细胞通过缝隙连接、紧密连接、桥粒以及由上述任何两种连接方式形成的复合连接进行连接。其中桥粒是Ca2+依赖性连接，因此在灌注时应选用Ca2+螯合剂，同时应选用无Ca2+的灌注液进行灌注，这样通过桥粒连接的细胞膜会分解成为只含有半个桥粒的核小体，有助于肝细胞的分离。但是为提高胶原酶的活性，需要将Ca2+的浓度维持在0.05% [9]。对于其机理，Berry等[9]认为，Ca2+的浓度能影响细胞内外的Na+、K+平衡，使Na+、K+平衡紊乱，导致肝细胞坏死，从而影响肝细胞的分离及培养。
2.3.2 胶原酶的选择及灌流速度
由于胶原酶的价格较为昂贵，因此对胶原酶的浓度及速度选择一直困惑着大多实验者。Sudhakaran等[10]认为，胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ的肝细胞分离效果更好。近来胶原酶的选择日益多样化，Shen等[11]在分离成年大鼠的肝细胞时采用的是胶原酶Ⅱ，他认为，配制好的胶原酶Ⅱ应该在30 min内用完，否则胶原酶的活性将会大大降低。而在分离小鼠的肝细胞时，Edwards等[12]选择的是胶原酶H。对于灌流速度，一般采取高速（40～50 mL/min）灌流法和低速（5 mL/min）灌流法。高速灌流法的缺点在于即使重复使用胶原酶，也会造成胶原酶的用量较大，浪费过多，导致实验费用增高。但相对来说，此法对肝细胞的分离效果较好。而低速灌流法使用的胶原酶量相对较少，较为经济，但分离效果相对较差。不管选用哪一种方法，都应对灌流的操作进行把关，因灌流过程中存在气泡或混入其他杂质致肝脏血管阻塞时，都会影响灌注的效果。
2.3.3 pH值和缓冲液
灌注液的pH值应保持在7.4～7.6之间（与培养基的pH值接近）。若偏离此范围，将影响胶原酶的活性，因此缓冲液起到了关键的作用。Seglen [13]认为，有机缓冲液〔4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）〕较为简单而实用。
2.3.4 灌流液温度的控制
配制好的灌流液在灌流前应保存在42 ℃的恒温箱中，这样可以使其在灌注过程中达到37 ℃[12]。另外，在灌注过程中应保持灌注液的温度为37 ℃，这样可以保证灌注液发挥更好的作用，同时可以避免细胞凋亡。
2.3.5 插管方式的选择
插管方式包括经典的门静脉插管、左心室插管、右心房的肝上下腔静脉插管等。经典的门静脉插管法：穿刺针插入门静脉后，启动蠕动泵，同时剪断肝上下腔静脉远端，用灌注液快速经门静脉灌注以清除肝内血液，使肝脏呈米黄色。当下腔静脉中流出的液体变清时，开始灌注消化酶液以充分消化肝脏，直至肝脏表面出现龟裂状裂隙且变软[14-15]。这种方法已在大鼠的肝细胞分离方面得到了广泛的应用，同时其也可以在一些较大的动物上使用。而对于小鼠来说，其门静脉较细，插管技术需要进一步提升。Ouji等[16]提出了一种新的插管方式，即从鼠的左心室插入针头，利用血液循环通路将灌注液灌注到肝脏内。通过这种插管方式获得的细胞数量为3.1×106～6.3×107个，活性为（89.3±6.5）%；而经典的门静脉插管法获得的细胞数量为（2.2～5.2）×107个，活性为（83.3±4.1）%，两者差异不大[16]。故Ouji等[16]认为，左心室插管法可等同于经典的门静脉插管法，并具有操作简单的优点，适用于体型较小的鼠，尤其是新生鼠的肝细胞分离。余招焱等[17]也提出了一种新的插管方法，即在肾脏平面以上结扎肝上下腔静脉，剪断肝蒂，剪开胸廓及肝脏上方的两侧膈肌，通过右心房裂口向下方插入肝上下腔静脉。由于右心房犹如漏斗状的外形使得插管过程较为简便，实验者通过短期的学习较易掌握这种插管方式。其实验结果也证实了此插管方法的可行性[17]，避免了门静脉穿透后无法继续进行插管导致的实验动物死亡（因大出血而死亡），避免了实验失败。同时，下腔静脉的管径较粗，可以承受较大的液体灌注量而不至于发生血管破裂等，有利于肝脏的均匀灌注[17]。
2.4 细胞纯化
提取肝细胞后，用细胞刮板将肝细胞分散到含有培养基的培养皿内，用100 μm或者200 μm不锈钢筛目过滤细胞液，以去除结缔组织和未消化的细胞。然后在4 ℃的条件下离心（50×g，3 min），吸取上层清液后，重新悬浮，再离心两次（条件同前）。Shen等[11]提出，在第三次离心过程中，以部分percoll液代替部分培养基，则经过离心后，可形成连续的浓度梯度，坏死的细胞将在上层，而底部则是可进行培养的细胞。
3 肝细胞的培养条件
肝细胞的功能包括白蛋白分泌和尿素合成，其表达CYP3A4基因。肝细胞表面可分为血窦面、肝细胞连接面和胆小管面三面。例如，胆汁酸分泌到胆管时会通过胆小管面，而白蛋白分泌到血液循环中则是通过在血窦面的窦周隙完成物质交换而实现的。胆小管面将肝细胞分成两个基底面，在肝细胞培养过程中，基底面将会和细胞外基质贴合，所以细胞外基质在肝细胞的培养过程中发挥着重要作用[18]。研究者对肝细胞的培养液进行了不断探索，在培养液中添加抗生素、生长因子、鼠尾胶原、胰岛素、胰高血糖素、地塞米松等，以实现不同的目的。
3.1 培养液的选择
目前用到的基础培养液有DMEM、RPMI 1640、L-15、Hepatozyme-SFM、Willams’E完全培养基等，其中DMEM培养基较为常用。周星辉等[19]指出，在原代肝细胞出现增殖前（培养1～5 d），DMEM培养基的培养效果明显好于RPMI 1640培养基。Willams’E完全培养基的成份适合肝细胞培养，但此培养基的价格相对昂贵。
3.2 培养液的添加物
3.2.1 胰岛素
胰岛素的作用是使接种的细胞更容易存活，促进核蛋白磷酸化。另外，胰岛素具有特异性生长因子的作用，能结合到生长因子受体上，有利于球蛋白、糖原和DNA合成，以及脂肪生成；同时，其能催化许多酶类，如乙酰-辅酶A羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6P）、葡萄糖激酶、酪氨酸转化酶及鸟氨酸脱氢酶，尤其是在胰岛素和上皮细胞生长因子（EGF）的协同作用下能诱导合成鸟氨酸脱氢酶[20]。胰岛素和胰高血糖素都有促进肝细胞再生的作用[21]。
3.2.2 地塞米松
地塞米松的作用是使细胞分裂相增多，并使毛细胆管样结构扩张明显。随着地塞米松浓度的递增，毛细胆管样结构扩张的程度也会发生改变：在0.5 μmol/L浓度下，地塞米松就可以引起毛细胆管样结构扩张；在5～20 μmol/L浓度时细胞状态好，并且可以引起毛细胆管样结构明显扩张[22]。
3.2.3 血清
血清的作用是提供肝细胞生长所需要的营养，但过多的血清会导致成纤维细胞大量生长。现大多数研究者选用胎牛血清。研究[23]表明，血清中含有一些生长因子和激素，其能结合肝细胞表面的各种生长因子受体和激素受体，能促进肝细胞的生长、分化及增殖，同时对维持肝细胞的生物学功能也具有重要意义。
3.2.4 生长因子
生长因子主要有EGF、肝细胞生长因子（HGF）等。EGF的作用是通过提高细胞的DNA合成能力，从而刺激细胞的增殖。EGF是一种很强的促细胞分裂因子，其还具有促进肝细胞的氨基酸转运、蛋白合成等功能，这可能是因为EGF可以明显降低臭氧所致的3H释放、消除臭氧降低细胞内还原型谷胱甘肽含量的作用，增加细胞内谷胱甘肽总含量，进而减少细胞膜的脂质过氧化[24]。
3.3 聚苯乙烯培养板
聚苯乙烯培养板最常用于HepG2细胞株（人肝癌细胞）的培养中，以及人和其他动物的肝细胞的培养中[25]。
4 肝细胞的培养方法
4.1 传统的单层胶原培养
该方法的优点在于操作较为简单，但肝细胞的生存时间较短，一般不会超过1周；同时培养出的肝细胞的功能也受到不同程度的影响，不能培养出肝细胞的极性；肝细胞培养12～24 h后其丧失间隙连接，3～5 d后细胞呈扁平状，并失去其特异的分泌功能，最终于1～2周内死亡[26]。
4.2 三明治双层胶原培养
该方法的培养环境较传统的单层胶原培养法更接近肝细胞在体内的环境，从形态和功能上恢复了肝细胞的极性，改善了细胞基质的拓扑结构，国外已用于小规模的生物型人工肝构型[27-28]。Choi等[29]认为，三明治双层胶原培养法能为肝细胞提供一个更接近于体内的几何形状的环境，细胞表现出胆小管面、基底面和Disse间隙；同时，他通过分析抗胰蛋白酶α1（AAT）、肝细胞核因子4α（HNF4A）、甲胎蛋白、白蛋白、酪氨酸氨基转移酶（TAT）基因、G6P、色氨酸氧化酶（TO）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的表达情况，从而证实了三明治双层胶原培养法的效果明显优于单层胶原培养法。
胶原蛋白对肝细胞有很强的黏附能力，能较长时间地维持细胞活力状态，有效地保持和诱导细胞分化[30]。国内张先杰等[31]运用三明治双层胶原培养法培养肝细胞，结果肝细胞在48 h内形成胆小管，并发展成肝板样结构；肝细胞相对扁平，个体细胞的收缩明显，阻止了细胞的进一步延伸；肝细胞呈多边形，其胞浆浓缩，大多数细胞呈单核或双核；同时蛋白分泌功能稳定，蛋白水平持续增高。原代培养的肝细胞在药物代谢研究中得到了广泛的应用。Komoroski等[32]研究了金丝桃素（St John’s Wort）对人原代肝细胞的诱导和抑制作用，同时探讨了金丝桃素和贯叶金丝桃素对人原代肝细胞中CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4基因的表达、蛋白含量及其酶活性的影响，结果表明，原代培养的肝细胞能成为检测中草药产物对CYP450酶影响的体外通用模型。Cai等[33]利用原代培养的大鼠肝细胞模型证实了四氯化碳诱导的肝毒性是通过氧化损伤造成的，此模型在药物代谢及毒理学中都得到了广泛的应用。
4.3 微载体培养
微载体通常适用于贴壁依赖型细胞生长的微珠，它的直径为60～250 μm [34]。它增大了细胞的培养面积，同时使细胞处于均一的环境，由于更加符合体内三维立体环境，从而避免了细胞接触抑制的发生。其能够控制温度、pH值、CO2等培养系统环境条件，并能观察微珠上细胞的生长情况。该培养方法为均相培养，可高效地利用培养基，并兼有单层培养和悬浮培养的优势[35]。匡洁等[36]探索出了一种新型的微囊包载体肝细胞培养模式，由于微载体有单层培养无法比拟的体表面积（4 600 cm2/g），利用微载体Cytodex3可在较短时间及较小空间内达到高密度细胞培养的目的[36]。通过连接设计良好的生物反应器来辅助微载体培养，然后根据细胞的增殖情况适时增加微载体，最高可使细胞密度达10倍以上[37]。
利用海藻酸钠/壳聚糖/海藻酸钠（ACA）微囊免疫隔离的功能，使微载体在囊内对细胞起立体支撑作用，则细胞的生存环境更加符合体内环境，更有利于细胞活性的维持[38]。采用微载体模式培养肝细胞，可观察到白蛋白水平呈逐渐升高的趋势[36]。近年来，有不少学者通过不断分析肝细胞周围的基质成分、在制备微囊的过程中模拟肝细胞周围的基质成分、向ACA溶液中添加木糖葡聚糖等物质，使肝细胞的功能得到进一步提升[39]。肝细胞在微囊内聚集成球形三维结构，细胞间接触良好，可进行较大规模培养。可将微囊化肝细胞置入容器内，以血液或血浆直接进行灌流，以应用于异种肝细胞移植[40]。
5 生物反应器
生物反应器是生物型人工肝的主要功能部件，决定了生物型人工肝的治疗效果。生物反应器必须具备以下功能：①提供给肝细胞一个良好的生长代谢环境；②提供一个血液或血浆与肝细胞相互作用的场所；③避免宿主免疫系统对肝细胞的损伤；④为肝细胞提供高通量的物质交换效能[41]。目前，生物型人工肝最常用的生物反应器是半透膜中空纤维型生物反应器。使用半透膜中空纤维型生物反应器时，一般将肝细胞种植于纤维管的外表面，血浆通过中空纤维毛细管柱对肝细胞进行灌注，肝细胞通过多孔质的中空纤维壁与血浆进行自由分子交换，从而达到吸收氧和营养物质的目的，并发挥解毒功能和代谢产物的功能[42]。
6 小结
对于供体的选择要根据不同的实验目的采取不同的细胞来源。在对肝细胞进行分离的过程中，单纯的机械分离和胰酶/胶原酶消化法可以同时使用，以达到协同作用的目的。但是，即使同时使用机械分离和胰酶/胶原酶消化，也会造成肝细胞的存活率较低，肝细胞的纯度较差。现在应用较多的是胶原酶灌注的方法，虽然此种方法较为繁琐，对实验者的要求较高，因实验者要根据具体情况略微调整浓度、灌流时间、培养基种类等，但该方法极大地改善了肝细胞的存活率和肝细胞的纯度，对于接下来的肝细胞培养奠定了基础。在肝细胞的培养过程中，各研究者经过不断的探索，从传统的单层胶原培养到三明治双层胶原培养，再到微载体培养，不断地在体外寻找能更好地模拟体内、更适合肝细胞生长的环境。肝细胞的分离和培养还需要更多的研究者进行不断探索，且各种方法均存在着各种各样的不足，这些不足等待着更多的研究者去克服和改善。对生物反应器的不断探索，将对生物型人工肝的广泛临床应用起到关键的作用。