引用本文： 李之令, 张东, 刘江伟, 王皓, 李瑞, 李建英. 姜黄素对大鼠重症急性胰腺炎肾脏iNOS表达的影响及其保护机理研究. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(4): 412-417. doi: 10.7507/1007-9424.20150110 复制
临床上发现，重症急性胰腺炎（severe acute pan-creatitis，SAP）常可导致肾脏、心血管、肝、肺等机体重要器官损伤，而且急性胰腺炎的严重程度常与肾脏器官的损伤程度呈正相关[1]。在SAP相关性肾损伤中，炎症反应在其肾损伤中起到了重要的作用。诱生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是炎症反应中重要的诱导酶，可以导致机体产生过量的NO，在SAP相关性肾损伤中起到直接的损伤作用。姜黄是我国一种传统中药，具有抗凝[2]、抗氧化[3-4]、抗肿瘤[5-6]等作用，而且毒性很低[7], 我国很早就应用于对急性胰腺炎的防治，但其治疗机理还未完全阐述清楚。本研究通过观察姜黄素对SAP相关性肾损伤肾脏组织iNOS表达以及细胞因子IL-1β、IL-6和IL-10的影响，旨在探讨姜黄素对SAP相关性肾损伤的治疗机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂和仪器
1.1.1 实验动物
8～10周龄SD大鼠，SPF级，24只，雌雄不限，平均体质量（320±25）g，购自新疆医科大学实验动物中心，室温〔（21±1）℃〕下自由进食水。
1.1.2 主要试剂
3%戊巴比妥钠（武汉人福科技），姜黄素（上海生工生物），生理盐水（四川科伦医药），SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所），IL-1β、IL-6和IL-10试剂盒（上海依科赛生物制品有限公司），原位末端标记（TUNEL）试剂盒（Roche，USA），DAB显色剂（北京中山金桥生物技术有限公司），TRIZOL（北京康为世纪生物技术有限公司），氯仿（天津福晨化学试剂厂），异丙醇（天津福晨化学试剂厂），无水乙醇（天津市化学三厂），反转录试剂盒（invtrogen，USA），SYBR Green Select Master Mix（Life Technologies Corporation），5×TBE（上海生工生物），琼脂糖（invitrogen，USA），核酸染料、Marker及Ladder（北京天根生物有限公司），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.1.3 主要仪器
全自动生化分析仪（迈瑞公司），奥林巴斯光学显微镜（日本），电泳仪（北京六一仪器厂），分光光度计（Bio-Rad，USA），PCR基因扩增（Bio-Rad，singapore），RT-PCR仪（Bio-Rad，USA）。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组
将健康SD大鼠24只根据窝别及体质量按随机数表法随机分为对照组、SAP相关性肾损伤组（简称损伤组）和姜黄素治疗组（简称治疗组），每组8只。
1.2.2 术前准备
实验动物术前12 h禁食，自由饮水。经3%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后固定、备皮、碘伏消毒手术区后常规铺巾。姜黄素生理盐水稀释液的配制：根据大鼠的体质量按200 mg/kg的量计算出治疗组每只大鼠所需的姜黄素量，再把姜黄素稀释成1.5 mL姜黄素生理盐水稀释液待用。对照组和损伤组大鼠在建模前3 h分别予以1.5 mL生理盐水灌胃，而治疗组大鼠在建模前3 h予以1.5 mL的姜黄素生理盐水稀释液灌胃。
1.2.3 SAP模型建立
损伤组和治疗组大鼠采用胰头夹闭法[8]建立SAP模型，对照组大鼠不做任何对胰腺有损害的处理。
1.2.4 术后处理
造模后放回饲养箱，4 h后可进食水。造模后12 h，对照组和损伤组大鼠予以1.5 mL生理盐水灌胃，治疗组则予以1.5 mL姜黄素生理盐水稀释液灌胃。
1.2.5 标本采集
各组大鼠于造模完成后18 h经3%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，常规消毒、铺巾、拆线，进入腹腔观察腹腔内各脏器的大体情况，然后寻找出下腔静脉用促凝管2只各抽取3 mL静脉血，一只行血淀粉酶、肌酐及尿素氮检测，另一只经3 000 r/min (r=13.5 cm)离心10 min后，小心吸取上层血清保存于-70℃备测IL-1β、IL-6和IL-10含量。取左肾约1 cm见方的组织块用10%甲醛液固定后石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色（HE），进行肾脏组织病理学观察。取右肾用无菌盐水纱布擦净血迹后放入冻存管中密封编号、液氮冷冻保存备检。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 肾脏细胞凋亡的检测
取处理好的石蜡切片固定在防脱片上后采用TUNEL法标记凋亡细胞（按试剂盒说明操作），DAB显色，在光镜下分析结果。每张切片观察5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计算每100个细胞中阳性细胞数，即凋亡指数，取其均值。
1.3.2 血清淀粉酶、肌酐及尿素氮水平检测
把已经离心好的待测血清严格按操作规范及流程使用迈瑞公司的全自动生化分析仪进行检测，检测前把生化分析仪均进行校准，保证质控数据均在质控范围内。
1.3.3 血清IL-1β、IL-6及IL-10含量测定
采用双抗体夹心ELISA法检测，具体步骤严格按试剂盒使用说明书进行操作。通过绘制标准曲线得出样品中相应细胞因子含量，该法检测IL-1β、IL-6及IL-10的灵敏度为15 pg/mL。
1.3.4 肾组织中iNOS mRNA表达的检测
采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测。从冻存管中取0.1 g肾组织放入加有液氮的研钵中，不断加入液氮转动杵子直至肾组织研磨成粉末状后加入1 mL TRIZOL，按说明书提取肾组织RNA。通过分光光度计测定其RNA的浓度，并根据分光光度计所测260 nm/280 nm处的吸光度比值来判定其纯度，满意后取样品的RNA 5μg进行反转录合成cDNA。再取待测样品的cDNA按说明书配制成总体积为20μL的RT-PCR反应体系。iNOS PCR上游引物序列为5′-GTGCTAATGCGGAAGGTCATG-3′，下游引物序列为3′-GCTTCCGACTTTCCTGTCTCAGTA-5′；β-actin PCR上游引物序列为5′-GCCAGGATAGAGCCA-CCAATC-3′，下游引物序列为3′-ACTGCCCTGGCT-CCTAGCA-5′。β-actin反应条件：95℃3 min，95℃10 s，60℃30 s，40循环；65℃10 s，61循环。iNOS反应条件：95℃3 min，95℃10 s，56℃30 s，40循环；65℃10 s，61循环。各PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳回收后稀释8个浓度梯度制作DNA标准曲线，各样本的基因浓度结果直接由机器生成。每个样本的iNOS基因的浓度与其β-actin基因浓度的比值即为iNOS mRNA的相对表达量。
1.4 统计学方法
应用SPSS 17.0软件包进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 胰腺大体观察结果及病理学改变
对照组在建模完成时及造模完成后18 h，胰腺无明显变化；损伤组和治疗组在造模完成时大体可见胰腺组织轻度肿胀，造模完成后18 h见腹腔有血性腹水，胰腺出现出血、坏死及皂化斑形成，但治疗组较损伤组其胰腺损伤减轻，胰腺出血坏死不如损伤组明显，仅有少量的皂化斑出现，腹腔血性腹水也较损伤组减少。光镜下见：对照组胰腺无明显充血水肿，胰腺间质和腺小叶未见炎性细胞浸润，无出血及坏死点（图 1A）；损伤组胰腺充血肿胀，胰腺间质和腺小叶大量炎性细胞浸润，部分胰腺组织呈弥漫性出血及坏死，胰周脂肪坏死，部分腺泡细胞溶解，只剩下解体细胞残留（图 1B）；治疗组见胰腺仍充血肿胀，但胰腺间质只有少量炎性细胞浸润，血管充血不如损伤组明显，仅有片状出血与坏死（图 1C）。
图1
示3组大鼠胰腺组织病理变化情况(HE×400)。1A:对照组; 1B:损伤组; 1C:治疗组 图 2示3组大鼠肾脏组织病理变化情况(HE×400)。2A:对照组; 2B:损伤组; 2C:治疗组 图 3示3组大鼠肾脏组织细胞凋亡情况(TUNEL×400)。3A:对照组; 3B:损伤组; 3C:治疗组
2.2 肾脏大体观察结果及病理学改变
3组大鼠在造模完成时其肾脏体积和外观均无明显变化。造模完成后18 h，对照组见肾组织大体未见明显变化；损伤组见肾脏体积略增大，外观呈暗紫色；而治疗组肾脏体积增大不明显，外观颜色改变不明显。光镜下见对照组肾小球及肾小管结构正常，细胞无充血水肿及坏死（图 2A）；而损伤组肾小管上皮细胞水肿、个别细胞坏死脱落进入管腔，管腔变窄、肾小球中度淤血（图 2B）；治疗组见肾小管上皮细胞水肿不如损伤组明显，管腔轻度变窄，肾小球轻度淤血（图 2C）。
2.3 肾脏细胞凋亡情况检测结果
在高倍镜下见对照组肾小球及肾小管结构完整，未见到凋亡细胞（图 3A）；损伤组有大量凋亡细胞，沿肾小管分布为主，肾小球偶见少许凋亡细胞（图 3B）；治疗组的肾小管凋亡细胞明显减少，肾小球未见凋亡细胞（图 3C）。对照组、损伤组及治疗组的肾脏细胞凋亡指数分别为0、（42.0±7.4）%和（25.4±5.4）%，3组间两两比较其差异均有统计学意义（P < 0.05）。
2.4 血清淀粉酶、肌酐及尿素氮检测结果
损伤组及治疗组较对照组血清淀粉酶、肌酐及尿素氮水平均明显升高（P < 0.05），而治疗组上述3项指标的升高不如损伤组明显，均较损伤组明显下降（P < 0.05），见表 1。
表1
3组大鼠血清淀粉酶、肌酐及尿素氮检测结果（2.5 血清IL-1β、IL-6及IL-10含量检测结果
损伤组及治疗组较对照组血清IL-1β、IL-6及IL-10水平均明显升高（P < 0.05）；但治疗组血清IL-1β和IL-6水平低于损伤组（P < 0.05），而IL-10水平则高于损伤组（P < 0.05）。见表 2。
表2
3组大鼠血清细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10含量检测结果（2.6 肾组织中iNOS mRNA表达检测结果
mRNA表达（相对表达量为0），损伤组和治疗组肾组织中iNOS mRNA相对表达量分别为（8.3±1.2）×10-1和（6.0±1.0）×10-1，明显高于对照组（P < 0.05），但治疗组又明显低于损伤组（P < 0.05）。
3 讨论
肾损伤是SAP时严重的相关靶器官损伤之一，其中炎性因子在其损伤中起到了主要的作用。NO、IL-1及IL-6是机体的主要炎性因子，参与机体很多重要器官的损伤[9-11]；而IL-10在炎性反应中主要起拮抗作用[12]。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）是机体内NO生成的主要限速酶[13]，NO产生量的多少主要受NOS的调控。由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）提供电子，黄素腺嘌呤二核苷酸、四氢生物蝶呤、黄素单核苷酸及Fe2+传递电子和在1个氧分子的参与下，NOS催化L-精氨酸（L-Arg）降解为胍氨酸并释放出NO。
NOS可分为结构型（cNOS）和诱导型（iNOS）。iNOS为一种机体内重要的促炎性酶，在正常生理条件下不表达，当机体受到损伤时表达于多种细胞，诱导机体产生过量的NO，发挥病理损伤作用[14]。一般认为，iNOS是一种NADPH依赖性酶，主要分布在巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞[15]。当机体处于应激状态时，葡萄糖的糖代谢磷酸戊糖途径加强，产生NADPH的量相应增加，激活机体合成更多的iNOS酶，促使内皮细胞产生大量的NO。高浓度的NO是一种具有较强细胞毒性的效应分子[16]，可以强烈的舒张肾皮质和肾髓质的微小血管导致微小血管的内皮细胞间间隙增宽, 血管通透性改变，促进大量炎性因子通过微小血管的内皮细胞间间隙进入血液且随血液循环损伤机体远处的靶器官，导致全身多器官功能障碍，进一步加重机体的损伤。而且高浓度的NO还可以通过诱导机体内皮细胞形态结构改变，致使血管屏障功能受到损害，大量炎性损害因子进入血管并与内皮细胞相互作用，促使大量活性氧弹性蛋白酶和溶酶体酶释放、激活补体, 再次对肾小球及肾小管血管内皮细胞直接产生损伤作用，大量炎性细胞及血小板聚集在受损伤的血管处导致肾脏内血管出现淤血及出血, 肾小球及肾小管细胞出现充血水肿以及坏死。NO过度生成与呼吸链复合体Ⅲ所释放的超氧化物结合形成过氧化亚硝酸盐，可以阻断线粒体的呼吸作用，造成线粒体损伤[17]；而且局部过量的NO与氧自由基相互作用后对肾组织细胞起直接毒性作用[18]，导致肾脏的细胞出现大量的凋亡。NO与亚铁血红素具有很强的亲和力，可以与血红蛋白结合形成亚硝酸盐血红蛋白使血红蛋白失去携带氧气的能力，进一步加重机体的缺氧。本研究中，损伤组肾脏组织中iNOS mRNA的相对表达量明显升高，而治疗组iNOS mRNA的相对表达量相对于损伤组则明显下降（P < 0.05），提示姜黄素对SAP相关性肾损伤中iNOS mRNA的表达具有明显的抑制作用；同时观察到，治疗组肾脏细胞的凋亡指数明显低于损伤组（P < 0.05），其肌酐和尿素氮水平也明显低于损伤组（P < 0.05）。该结果提示，姜黄素可能通过下调肾组织中iNOS mRNA的表达，以减少机体产生大量的NO，从而减轻对肾脏细胞的破坏作用，因此肾脏的结构和功能得到了很好的保护。
有文献[19]证实, 姜黄素含有一种热稳定蛋白-抗氧化蛋白（TAP）, 具有清除氧自由基从而发挥抗氧化活性。TAP还可以稳定肾脏组织的细胞膜，对提高超氧化物歧化酶（SOD）活性也可能起到一定作用[20]。SOD可以很好地清除机体内的氧自由基, 减轻氧自由基对肾脏细胞的损害作用从而对肾脏细胞起到很好的保护作用。姜黄素可能通过抑制脂多糖引起的肾小管上皮细胞炎性因子的释放[21]以及促进抗炎性因子的表达，减少机体的炎性反应，从而对肾脏起到保护作用。当SAP病情不断加重时，大量活化的胰蛋白酶可以将前弹力酶、羧基肽酶原及非活性型磷脂酶A2激活释放进入血液，其中磷脂酶A2（PLA2）使细胞膜的磷脂和卵磷脂分解激发机体产生大量的内毒素及促炎性因子如TNF-α、IL-1、IL-6等，机体的单核巨噬细胞释放刺激粒细胞的活化，粒细胞与内皮细胞的黏附，刺激吞噬细胞功能的激活，释放活性自由基以及蛋白酶和水解酶。大量炎性介质的活化和氧自由基产生以及溶酶体对细胞膜造成损伤；而且活化了的炎性细胞黏附在肾脏血管内皮，肾毛细血管壁严重受损。同时机体还伴有血小板活化因子（PAF）、血栓素A2（TXA2）的促凝物质的释放，血液黏度明显增加，促进微循环血栓的形成，加之机体的低血容量造成肾血容量灌注不足，进一步加重肾损伤[22]。随着肾损伤的不断加重，抗炎性因子IL-10在刺激因素的不断作用下表达不断增强。抗炎性因子IL-10不但可以抑制炎性因子的表达，而且还可以诱导合成促炎性因子拮抗剂来发挥对炎性因子的抵抗作用[23]。本研究的姜黄素治疗组中，促炎性细胞因子IL-1β及IL-6水平明显下降，而抑炎症因子IL-10水平则明显升高（P < 0.01）, 表明姜黄素能抑制炎性介质的释放[24]，具有很好的抗炎能力[25]。
综上，本研究观察到姜黄素治疗SAP肾损伤的大鼠模型取得了较好的实验效果，其可能的治疗机理是：姜黄素可能通过抑制促炎性因子IL-1β及IL-6的表达，促进抗炎性因子IL-10表达，下调iNOS mRNA的表达来抑制大量NO的产生，从而减少氧自由基的生成以及溶酶体对细胞膜的损害，保护完整的肾脏细胞功能，维持正常的肾脏功能，对肾脏起到很好的保护作用。但姜黄素治疗SAP肾损伤有无其他治疗机理的参与，还需要我们做进一步的研究来证实。
临床上发现，重症急性胰腺炎（severe acute pan-creatitis，SAP）常可导致肾脏、心血管、肝、肺等机体重要器官损伤，而且急性胰腺炎的严重程度常与肾脏器官的损伤程度呈正相关[1]。在SAP相关性肾损伤中，炎症反应在其肾损伤中起到了重要的作用。诱生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是炎症反应中重要的诱导酶，可以导致机体产生过量的NO，在SAP相关性肾损伤中起到直接的损伤作用。姜黄是我国一种传统中药，具有抗凝[2]、抗氧化[3-4]、抗肿瘤[5-6]等作用，而且毒性很低[7], 我国很早就应用于对急性胰腺炎的防治，但其治疗机理还未完全阐述清楚。本研究通过观察姜黄素对SAP相关性肾损伤肾脏组织iNOS表达以及细胞因子IL-1β、IL-6和IL-10的影响，旨在探讨姜黄素对SAP相关性肾损伤的治疗机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂和仪器
1.1.1 实验动物
8～10周龄SD大鼠，SPF级，24只，雌雄不限，平均体质量（320±25）g，购自新疆医科大学实验动物中心，室温〔（21±1）℃〕下自由进食水。
1.1.2 主要试剂
3%戊巴比妥钠（武汉人福科技），姜黄素（上海生工生物），生理盐水（四川科伦医药），SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所），IL-1β、IL-6和IL-10试剂盒（上海依科赛生物制品有限公司），原位末端标记（TUNEL）试剂盒（Roche，USA），DAB显色剂（北京中山金桥生物技术有限公司），TRIZOL（北京康为世纪生物技术有限公司），氯仿（天津福晨化学试剂厂），异丙醇（天津福晨化学试剂厂），无水乙醇（天津市化学三厂），反转录试剂盒（invtrogen，USA），SYBR Green Select Master Mix（Life Technologies Corporation），5×TBE（上海生工生物），琼脂糖（invitrogen，USA），核酸染料、Marker及Ladder（北京天根生物有限公司），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.1.3 主要仪器
全自动生化分析仪（迈瑞公司），奥林巴斯光学显微镜（日本），电泳仪（北京六一仪器厂），分光光度计（Bio-Rad，USA），PCR基因扩增（Bio-Rad，singapore），RT-PCR仪（Bio-Rad，USA）。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组
将健康SD大鼠24只根据窝别及体质量按随机数表法随机分为对照组、SAP相关性肾损伤组（简称损伤组）和姜黄素治疗组（简称治疗组），每组8只。
1.2.2 术前准备
实验动物术前12 h禁食，自由饮水。经3%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后固定、备皮、碘伏消毒手术区后常规铺巾。姜黄素生理盐水稀释液的配制：根据大鼠的体质量按200 mg/kg的量计算出治疗组每只大鼠所需的姜黄素量，再把姜黄素稀释成1.5 mL姜黄素生理盐水稀释液待用。对照组和损伤组大鼠在建模前3 h分别予以1.5 mL生理盐水灌胃，而治疗组大鼠在建模前3 h予以1.5 mL的姜黄素生理盐水稀释液灌胃。
1.2.3 SAP模型建立
损伤组和治疗组大鼠采用胰头夹闭法[8]建立SAP模型，对照组大鼠不做任何对胰腺有损害的处理。
1.2.4 术后处理
造模后放回饲养箱，4 h后可进食水。造模后12 h，对照组和损伤组大鼠予以1.5 mL生理盐水灌胃，治疗组则予以1.5 mL姜黄素生理盐水稀释液灌胃。
1.2.5 标本采集
各组大鼠于造模完成后18 h经3%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，常规消毒、铺巾、拆线，进入腹腔观察腹腔内各脏器的大体情况，然后寻找出下腔静脉用促凝管2只各抽取3 mL静脉血，一只行血淀粉酶、肌酐及尿素氮检测，另一只经3 000 r/min (r=13.5 cm)离心10 min后，小心吸取上层血清保存于-70℃备测IL-1β、IL-6和IL-10含量。取左肾约1 cm见方的组织块用10%甲醛液固定后石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色（HE），进行肾脏组织病理学观察。取右肾用无菌盐水纱布擦净血迹后放入冻存管中密封编号、液氮冷冻保存备检。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 肾脏细胞凋亡的检测
取处理好的石蜡切片固定在防脱片上后采用TUNEL法标记凋亡细胞（按试剂盒说明操作），DAB显色，在光镜下分析结果。每张切片观察5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计算每100个细胞中阳性细胞数，即凋亡指数，取其均值。
1.3.2 血清淀粉酶、肌酐及尿素氮水平检测
把已经离心好的待测血清严格按操作规范及流程使用迈瑞公司的全自动生化分析仪进行检测，检测前把生化分析仪均进行校准，保证质控数据均在质控范围内。
1.3.3 血清IL-1β、IL-6及IL-10含量测定
采用双抗体夹心ELISA法检测，具体步骤严格按试剂盒使用说明书进行操作。通过绘制标准曲线得出样品中相应细胞因子含量，该法检测IL-1β、IL-6及IL-10的灵敏度为15 pg/mL。
1.3.4 肾组织中iNOS mRNA表达的检测
采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测。从冻存管中取0.1 g肾组织放入加有液氮的研钵中，不断加入液氮转动杵子直至肾组织研磨成粉末状后加入1 mL TRIZOL，按说明书提取肾组织RNA。通过分光光度计测定其RNA的浓度，并根据分光光度计所测260 nm/280 nm处的吸光度比值来判定其纯度，满意后取样品的RNA 5μg进行反转录合成cDNA。再取待测样品的cDNA按说明书配制成总体积为20μL的RT-PCR反应体系。iNOS PCR上游引物序列为5′-GTGCTAATGCGGAAGGTCATG-3′，下游引物序列为3′-GCTTCCGACTTTCCTGTCTCAGTA-5′；β-actin PCR上游引物序列为5′-GCCAGGATAGAGCCA-CCAATC-3′，下游引物序列为3′-ACTGCCCTGGCT-CCTAGCA-5′。β-actin反应条件：95℃3 min，95℃10 s，60℃30 s，40循环；65℃10 s，61循环。iNOS反应条件：95℃3 min，95℃10 s，56℃30 s，40循环；65℃10 s，61循环。各PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳回收后稀释8个浓度梯度制作DNA标准曲线，各样本的基因浓度结果直接由机器生成。每个样本的iNOS基因的浓度与其β-actin基因浓度的比值即为iNOS mRNA的相对表达量。
1.4 统计学方法
应用SPSS 17.0软件包进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 胰腺大体观察结果及病理学改变
对照组在建模完成时及造模完成后18 h，胰腺无明显变化；损伤组和治疗组在造模完成时大体可见胰腺组织轻度肿胀，造模完成后18 h见腹腔有血性腹水，胰腺出现出血、坏死及皂化斑形成，但治疗组较损伤组其胰腺损伤减轻，胰腺出血坏死不如损伤组明显，仅有少量的皂化斑出现，腹腔血性腹水也较损伤组减少。光镜下见：对照组胰腺无明显充血水肿，胰腺间质和腺小叶未见炎性细胞浸润，无出血及坏死点（图 1A）；损伤组胰腺充血肿胀，胰腺间质和腺小叶大量炎性细胞浸润，部分胰腺组织呈弥漫性出血及坏死，胰周脂肪坏死，部分腺泡细胞溶解，只剩下解体细胞残留（图 1B）；治疗组见胰腺仍充血肿胀，但胰腺间质只有少量炎性细胞浸润，血管充血不如损伤组明显，仅有片状出血与坏死（图 1C）。
图1
示3组大鼠胰腺组织病理变化情况(HE×400)。1A:对照组; 1B:损伤组; 1C:治疗组 图 2示3组大鼠肾脏组织病理变化情况(HE×400)。2A:对照组; 2B:损伤组; 2C:治疗组 图 3示3组大鼠肾脏组织细胞凋亡情况(TUNEL×400)。3A:对照组; 3B:损伤组; 3C:治疗组
2.2 肾脏大体观察结果及病理学改变
3组大鼠在造模完成时其肾脏体积和外观均无明显变化。造模完成后18 h，对照组见肾组织大体未见明显变化；损伤组见肾脏体积略增大，外观呈暗紫色；而治疗组肾脏体积增大不明显，外观颜色改变不明显。光镜下见对照组肾小球及肾小管结构正常，细胞无充血水肿及坏死（图 2A）；而损伤组肾小管上皮细胞水肿、个别细胞坏死脱落进入管腔，管腔变窄、肾小球中度淤血（图 2B）；治疗组见肾小管上皮细胞水肿不如损伤组明显，管腔轻度变窄，肾小球轻度淤血（图 2C）。
2.3 肾脏细胞凋亡情况检测结果
在高倍镜下见对照组肾小球及肾小管结构完整，未见到凋亡细胞（图 3A）；损伤组有大量凋亡细胞，沿肾小管分布为主，肾小球偶见少许凋亡细胞（图 3B）；治疗组的肾小管凋亡细胞明显减少，肾小球未见凋亡细胞（图 3C）。对照组、损伤组及治疗组的肾脏细胞凋亡指数分别为0、（42.0±7.4）%和（25.4±5.4）%，3组间两两比较其差异均有统计学意义（P < 0.05）。
2.4 血清淀粉酶、肌酐及尿素氮检测结果
损伤组及治疗组较对照组血清淀粉酶、肌酐及尿素氮水平均明显升高（P < 0.05），而治疗组上述3项指标的升高不如损伤组明显，均较损伤组明显下降（P < 0.05），见表 1。
表1
3组大鼠血清淀粉酶、肌酐及尿素氮检测结果（2.5 血清IL-1β、IL-6及IL-10含量检测结果
损伤组及治疗组较对照组血清IL-1β、IL-6及IL-10水平均明显升高（P < 0.05）；但治疗组血清IL-1β和IL-6水平低于损伤组（P < 0.05），而IL-10水平则高于损伤组（P < 0.05）。见表 2。
表2
3组大鼠血清细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10含量检测结果（2.6 肾组织中iNOS mRNA表达检测结果
mRNA表达（相对表达量为0），损伤组和治疗组肾组织中iNOS mRNA相对表达量分别为（8.3±1.2）×10-1和（6.0±1.0）×10-1，明显高于对照组（P < 0.05），但治疗组又明显低于损伤组（P < 0.05）。
3 讨论
肾损伤是SAP时严重的相关靶器官损伤之一，其中炎性因子在其损伤中起到了主要的作用。NO、IL-1及IL-6是机体的主要炎性因子，参与机体很多重要器官的损伤[9-11]；而IL-10在炎性反应中主要起拮抗作用[12]。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）是机体内NO生成的主要限速酶[13]，NO产生量的多少主要受NOS的调控。由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）提供电子，黄素腺嘌呤二核苷酸、四氢生物蝶呤、黄素单核苷酸及Fe2+传递电子和在1个氧分子的参与下，NOS催化L-精氨酸（L-Arg）降解为胍氨酸并释放出NO。
NOS可分为结构型（cNOS）和诱导型（iNOS）。iNOS为一种机体内重要的促炎性酶，在正常生理条件下不表达，当机体受到损伤时表达于多种细胞，诱导机体产生过量的NO，发挥病理损伤作用[14]。一般认为，iNOS是一种NADPH依赖性酶，主要分布在巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞[15]。当机体处于应激状态时，葡萄糖的糖代谢磷酸戊糖途径加强，产生NADPH的量相应增加，激活机体合成更多的iNOS酶，促使内皮细胞产生大量的NO。高浓度的NO是一种具有较强细胞毒性的效应分子[16]，可以强烈的舒张肾皮质和肾髓质的微小血管导致微小血管的内皮细胞间间隙增宽, 血管通透性改变，促进大量炎性因子通过微小血管的内皮细胞间间隙进入血液且随血液循环损伤机体远处的靶器官，导致全身多器官功能障碍，进一步加重机体的损伤。而且高浓度的NO还可以通过诱导机体内皮细胞形态结构改变，致使血管屏障功能受到损害，大量炎性损害因子进入血管并与内皮细胞相互作用，促使大量活性氧弹性蛋白酶和溶酶体酶释放、激活补体, 再次对肾小球及肾小管血管内皮细胞直接产生损伤作用，大量炎性细胞及血小板聚集在受损伤的血管处导致肾脏内血管出现淤血及出血, 肾小球及肾小管细胞出现充血水肿以及坏死。NO过度生成与呼吸链复合体Ⅲ所释放的超氧化物结合形成过氧化亚硝酸盐，可以阻断线粒体的呼吸作用，造成线粒体损伤[17]；而且局部过量的NO与氧自由基相互作用后对肾组织细胞起直接毒性作用[18]，导致肾脏的细胞出现大量的凋亡。NO与亚铁血红素具有很强的亲和力，可以与血红蛋白结合形成亚硝酸盐血红蛋白使血红蛋白失去携带氧气的能力，进一步加重机体的缺氧。本研究中，损伤组肾脏组织中iNOS mRNA的相对表达量明显升高，而治疗组iNOS mRNA的相对表达量相对于损伤组则明显下降（P < 0.05），提示姜黄素对SAP相关性肾损伤中iNOS mRNA的表达具有明显的抑制作用；同时观察到，治疗组肾脏细胞的凋亡指数明显低于损伤组（P < 0.05），其肌酐和尿素氮水平也明显低于损伤组（P < 0.05）。该结果提示，姜黄素可能通过下调肾组织中iNOS mRNA的表达，以减少机体产生大量的NO，从而减轻对肾脏细胞的破坏作用，因此肾脏的结构和功能得到了很好的保护。
有文献[19]证实, 姜黄素含有一种热稳定蛋白-抗氧化蛋白（TAP）, 具有清除氧自由基从而发挥抗氧化活性。TAP还可以稳定肾脏组织的细胞膜，对提高超氧化物歧化酶（SOD）活性也可能起到一定作用[20]。SOD可以很好地清除机体内的氧自由基, 减轻氧自由基对肾脏细胞的损害作用从而对肾脏细胞起到很好的保护作用。姜黄素可能通过抑制脂多糖引起的肾小管上皮细胞炎性因子的释放[21]以及促进抗炎性因子的表达，减少机体的炎性反应，从而对肾脏起到保护作用。当SAP病情不断加重时，大量活化的胰蛋白酶可以将前弹力酶、羧基肽酶原及非活性型磷脂酶A2激活释放进入血液，其中磷脂酶A2（PLA2）使细胞膜的磷脂和卵磷脂分解激发机体产生大量的内毒素及促炎性因子如TNF-α、IL-1、IL-6等，机体的单核巨噬细胞释放刺激粒细胞的活化，粒细胞与内皮细胞的黏附，刺激吞噬细胞功能的激活，释放活性自由基以及蛋白酶和水解酶。大量炎性介质的活化和氧自由基产生以及溶酶体对细胞膜造成损伤；而且活化了的炎性细胞黏附在肾脏血管内皮，肾毛细血管壁严重受损。同时机体还伴有血小板活化因子（PAF）、血栓素A2（TXA2）的促凝物质的释放，血液黏度明显增加，促进微循环血栓的形成，加之机体的低血容量造成肾血容量灌注不足，进一步加重肾损伤[22]。随着肾损伤的不断加重，抗炎性因子IL-10在刺激因素的不断作用下表达不断增强。抗炎性因子IL-10不但可以抑制炎性因子的表达，而且还可以诱导合成促炎性因子拮抗剂来发挥对炎性因子的抵抗作用[23]。本研究的姜黄素治疗组中，促炎性细胞因子IL-1β及IL-6水平明显下降，而抑炎症因子IL-10水平则明显升高（P < 0.01）, 表明姜黄素能抑制炎性介质的释放[24]，具有很好的抗炎能力[25]。
综上，本研究观察到姜黄素治疗SAP肾损伤的大鼠模型取得了较好的实验效果，其可能的治疗机理是：姜黄素可能通过抑制促炎性因子IL-1β及IL-6的表达，促进抗炎性因子IL-10表达，下调iNOS mRNA的表达来抑制大量NO的产生，从而减少氧自由基的生成以及溶酶体对细胞膜的损害，保护完整的肾脏细胞功能，维持正常的肾脏功能，对肾脏起到很好的保护作用。但姜黄素治疗SAP肾损伤有无其他治疗机理的参与，还需要我们做进一步的研究来证实。
