引用本文： 文艺, 祁巧, 刘丹青, 黄尚清, 林宁, 石力, 陈涛, 汤礼军. Roux-en-Y胃旁路术对2型糖尿病大鼠肾脏早期损害的保护作用. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(4): 404-411. doi: 10.7507/1007-9424.20150109 复制
2型糖尿病（T2DM）是一种常见的慢性代谢性疾病，相较于传统治疗，Roux-en-Y胃旁路术能明显而持久地改善80%～100% T2DM患者的血糖、胰岛素和糖化血红蛋白，同时也可纠正糖耐量异常和胰岛素抵抗[1]。糖尿病肾病是糖尿病主要的微血管并发症，是引起T2DM患者死亡的主要原因之一。近年来的临床观察[2-3]表明，T2DM患者经胃转流术治疗后其受损的肾脏功能有一定改善，但尚缺乏进一步的研究。本实验拟采用高脂饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素建立大鼠T2DM模型，观察胃转流术后对大鼠肾脏组织病理形态学、炎性因子及细胞因子的影响，探讨胃转流术对糖尿病大鼠肾脏保护的可能作用机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物及饲料
8周龄SPF级SD大鼠40只，雄性，体质量170～190 g，由简阳达硕动物科技有限公司提供，许可证号：SCXK（川）2004。实验动物基础饲料由简阳达硕动物科技有限公司提供，高脂饲料由基础鼠饲料（72%）加炼猪油（15%）、蔗糖（10%）和蛋黄（3%）按比搭配制成高脂高糖饲料。
1.2 主要试剂
链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自Sigma公司，柠檬酸缓冲液及稳步型血糖仪购自美国雅培公司。PAS染色试剂盒和Masson染色试剂盒购自南京建成科技有限公司。尿8-羟基脱氧鸟酐（8-OhdG）Elisa试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.3 糖尿病动物模型复制、分组及处理
雄性SD大鼠40只，按随机数字表法随机分为正常对照组（NC组）8只和糖尿病建模动物32只，NC组动物给予基础饲料，建模动物给予高脂饲料。建模动物喂养4周后，禁食12 h，于左下腹腔一次性注射STZ 35 mg/kg（用0.1 mol/L、pH 4.4的柠檬酸缓冲液在避光和冰浴下配制成浓度为1% STZ溶液，现配现用）。1周后行口服糖耐量试验（OGTT）试验（禁食12 h，葡萄糖1.5 g/kg灌胃，测2 h血糖），筛选血糖值大于11.1 mmol /L的大鼠确定为糖尿病大鼠（成模30只，成模率为93.8%）[4]。模型稳定1周后，将成模的30只糖尿病大鼠按随机数字表法随机分为3组，即糖尿病模型对照组8只、假手术组8只和Roux-en-Y胃旁路手术组14只。假手术组行胃窦十二指肠离断原位吻合术，Roux-en-Y胃旁路手术组行胃转流术：大鼠术前禁食12 h，不限饮水，0.5％戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔内注射麻醉后固定于手术台，无菌条件下取上腹部正中切口长3 cm切开进腹，闭合胃远端，距Treitz韧带10 cm切断空肠，远端肠襻行胃空肠吻合，距胃肠吻合口远端10 cm行空肠侧侧吻合，完成吻合后用甲硝唑溶液5 mL冲洗腹腔后关腹。手术14只，术后8周存活6只，存活率为42.9%。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 血糖测定
分别于术前及术后8周，大鼠尾尖取血0.1 mL，用雅培Optium Xceed血糖仪检测各组各时间点大鼠的空腹血糖值
1.4.2 血清总胆固醇（Tch）、甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（FFA）、尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）测定
分别于术前及术后8周获取大鼠眶静脉血1.5 mL，采用全自动生化分析仪测定各组大鼠的Tch、TG、BUN及Cr，用ELISA法测定FFA。
1.4.3 尿微量白蛋白及尿8-OhdG的测定
分别与术前及术后8周，搜集各组大鼠24 h尿液，采用全自动生化分析仪测定各组大鼠24 h尿微量白蛋白，用ELISA法测定尿8-OhdG水平。
1.4.4 肾脏病理组织学观察及肾重指数、肾小球平均截面积（MGA）和肾小球平均体积（MGV）的测定
于术后8周将大鼠麻醉开腹行肾脏灌注后取下双侧肾脏并称重，计算肾重指数，肾重指数（mg/g）=双侧肾重/体质量；然后将大鼠左侧肾脏沿纵轴切开后分别用10%中性甲醛溶液和Carrnoy固定液固定24 h后，脱水透明，石蜡包埋，切割制备4μm厚的组织切片，分别进行HE染色、Masson染色和PAS染色，于光镜下观察各组大鼠肾组织的形态学变化；应用Image-ProPlus图像分析软件对病理染色切片（×400）进行图像分析，每张切片随机选择10个正切的肾小球，测定其截面积，取其平均值作为每个标本的MGA，根据公式MGV=1.25×（MGA）3/2计算MGV。
1.4.5 免疫组化染色检测纤连蛋白(FN)、Ⅳ型胶原（CoⅣ）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶4（NOX4）和Bcl-2蛋白表达
取已制备的各组大鼠肾脏组织石蜡切片，采用PV两步法检测，其操作步骤参照试剂盒说明书进行，用PBS代替一抗作为阴性对照，含有以上蛋白抗原的肝脏组织石蜡切片作为阳性对照。兔抗大鼠TGF-β1、FN、CoⅣ、ICAM-1、NOX4及Bcl-2多克隆抗体（购自武汉博士德）按1∶100稀释，每张切片在Olympus显微镜400倍下，用Image-ProPlus图像采集系统随机选取10个含肾小球的视野, 用Image-ProPlus图像分析软件测量免疫组化染色的积分光密度值（integral optical density，IOD）[5]，计算各组大鼠目标蛋白平均IOD值，IOD值越高则蛋白表达量越高。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 4组大鼠血糖和肾重指数检测结果
结果见表 1。由表 1可见，与正常对照组相比，糖尿病对照组和假手组的肾重指数明显升高（P < 0.05）；Roux-en-Y胃旁路手术组的肾重指数与糖尿病对照组和假手组相比有一定程度降低，其差异具有统计学意义（P < 0.05），但与正常对照组相比，其差异无统计学意义（P > 0.05）。与正常对照组相比，术前糖尿病对照组、假手术组和Roux-en-Y胃旁路手术组的血糖均明显升高（P < 0.05)；术后8周，Roux-en-Y胃旁路手术组的血糖明显下降，接近正常对照组，而糖尿病对照组和假手术组的血糖则进一步升高，其差异有统计学意义（P < 0.05)。提示胃转流术具有明显的降糖作用。
表1
各组大鼠血糖和肾重指数检测结果（2.2 4组大鼠血清BUN及Cr检测结果
结果见表 2。由表 2可见，术前各组的血清BUN和Cr水平接近，其差异均无统计学意义（P > 0.05）。与正常对照组相比，术后4周及8周糖尿病对照组和假手组的血清BUN和Cr均有不同程度升高，肾功能逐渐恶化，其差异具有统计学意义（P < 0.05）；Roux-en-Y胃旁路手术组的血清BUN及Cr在术后4周和8周的变化不大，接近术前水平，明显低于糖尿病对照组和假手组，其差异具有统计学意义（P < 0.05）。
表2
各组大鼠血清BUN及Cr检测结果（2.3 4组大鼠血清TC、TG及FFA检测结果
结果见表 3。由表 3可见，与正常对照组相比，糖尿病模型组血清TC、TG、FFA均升高明显，差异具有统计学意义（P < 0.001）；术后8周，与糖尿病对照组及假手组相比，Roux-en-Y胃旁路手术组血清TC、TG及FFA均有不同程度降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。提示Roux-en-Y胃旁路手术能在一定程度上改善糖尿病大鼠的血脂水平。
表3
各组大鼠血清TC、TG及FFA检测结果（2.4 4组大鼠的MGA及MGV检测结果
结果见表 4。如表 4所示，术后8周，与正常对照组相比，糖尿病对照组及假手术组的MGA和MGV均明显增大，其差异具有统计学意义（P < 0.05）；与糖尿病对照组及假手术组相比，Roux-en-Y胃旁路手术组的MGA及MGV明显减小，其差异具有统计学意义（P < 0.05），并接近正常对照组。
表4
各组大鼠的MGA和MGV检测结果（2.5 4组大鼠24 h尿微量白蛋白及尿8-OhdG测定结果
结果见表 5。如表 5所示，术前，与正常对照组相比，糖尿病对照组24 h尿微量白蛋白轻度升高，差异具有统计学意义（P < 0.05），尿8-OHdG升高不明显，差异无统计学意义（P > 0.05）；术后8周，Roux-en-Y胃旁路手术组较糖尿病对照组和假手术组24 h尿微量白蛋白和尿8-OHdG均明显降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。
表5
各组大鼠24 h尿微量白蛋白及尿8-OHdG检测结果比较（2.6 4组大鼠肾脏组织病理形态学的改变
肾脏组织HE染色结果显示，与正常对照组比较，糖尿病对照组的肾小球体积明显增大，系膜区增宽，系膜细胞增生，肾小囊腔受压缩小，而Roux-en-Y胃旁路手术组较糖尿病对照组肾小球体积明显减小，系膜增生有一定改善（图 1A～图 1D）。肾脏组织PAS染色结果显示，与正常对照组比较，糖尿病对照组的肾小球体积增大，系膜区基质明显增多，系膜区扩大，肾小球毛细血管袢受压，基底膜增厚，而Roux-en-Y胃旁路手术组的上述改变较糖尿病对照组有明显的改善（图 2A～图 2D）。肾脏组织Masson染色蓝染区主要为胶原成分，通过观察可见正常对照组大鼠的肾小球结构清晰，仅在肾小球基底膜和系膜基质可见少许蓝染的胶原纤维；糖尿病对照组大鼠在肾小球中可见蓝染的胶原纤维区域明显增大，基底膜增厚，系膜区胶原沉积；而Roux-en-Y胃旁路手术组的肾小球胶原沉积明显减少（图 3A～图 3D）。
图1
示胃转流术对糖尿病大鼠肾脏组织病理学变化的影响(HE×400)。1A:正常组; 1B:糖尿病对照组, 见肾小球体积增大, 肾小囊腔受压缩小; 1C:假手术组; 1D:Roux-en-Y胃旁路手术组, 见肾小球体积明显减小 图 2示胃转流术对糖尿病大鼠肾脏组织病理学变化的影响(PAS×400)。2A:正常组; 2B:糖尿病对照组, 见肾小球体积增大, 肾小球毛细血管袢受压, 基底膜增厚; 2C:假手术组; 2D:Roux-en-Y胃旁路手术组, 见肾小球体积明显减小 图 3示胃转流术对糖尿病大鼠肾脏组织病理学变化的影响(Masson×400)。3A:正常组; 3B:糖尿病对照组, 见肾小球中可见蓝染的胶原纤维区域明显增大, 系膜区胶原沉积; 3C:假手术组; 3D:Roux-en-Y胃旁路手术组, 见肾小球胶原沉积明显减少 图 4示各组大鼠肾脏组织的FN(4A~4D)及CoⅣ(4E~4H)的表达(PV×400)。4A及4E:正常对照组; 4B及4F:糖尿病对照组; 4C及4G:假手术组; 4D及4H:Roux-en-Y胃旁路手术组
2.7 4组大鼠肾脏皮质纤连蛋白（FN）、Ⅳ型胶原（CoⅣ）的检测结果
图 4A～4D示4组大鼠肾小球及肾小管间质FN的表达，术后8周时糖尿病对照组、假手术组和Roux-en-Y胃旁路手术组肾小球及肾小管间质的FN表达均明显高于正常对照组（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手术组FN的表达则较糖尿病对照组和假手术组明显降低（P < 0.05）；图 4E～4H示4组大鼠肾小球的CoⅣ的表达，术后8周时糖尿病对照组、假手术组和Roux-en-Y胃旁路手术组肾小球CoⅣ的表达均明显高于正常对照组（P < 0.05），Roux-en-Y胃旁路手术组CoⅣ的表达则较糖尿病对照组和假手术组明显降低（P < 0.05）。具体见表 6。
表6
各组大鼠肾脏皮质FN、CoⅣ、TGF-β1、NOX4、Bcl-2和ICAM-1表达检测结果（IOD值，2.8 4组大鼠肾脏皮质TGF-β1、NOX4、Bcl-2及ICAM-1表达检测结果
图 5A~5D示4组大鼠肾脏皮质TGF-β1的表达，术后8周时糖尿病对照组、假手术组和Roux-en-Y胃旁路手术组肾小球及肾小管中TGF-β1的表达均明显高于正常对照组（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手术组TGF-β1的表达则较糖尿病对照组和假手术组明显降低（P < 0.05）；图 5E～5H示4组大鼠肾脏皮质NOX4的表达，术后8周时糖尿病对照组、假手术组和Roux-en-Y胃旁路手术组肾小球及肾小管NOX4的表达均明显高于正常对照组（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手术组NOX4的表达则较糖尿病对照组和假手术组明显降低（P < 0.05），见表 6。图 6A～6D示4组大鼠肾脏皮质Bcl-2的表达，术后8周时糖尿病对照组、假手术组和Roux-en-Y胃旁路手术组肾小管Bcl-2的表达均明显低于正常对照组（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手术组Bcl-2的表达则较糖尿病对照组和假手术组明显增高（P < 0.05）；图 6E～6H示4组大鼠肾脏皮质ICAM-1的表达，术后8周时糖尿病对照组和假手术组肾小球及肾小管ICAM-1的表达均明显高于正常对照组（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手术组ICAM-1的表达则较糖尿病对照组和假手术组明显降低（P < 0.05），见表 6。
图5
示各组大鼠肾脏组织TGF-β1(5A~5D)及NOX4(5E~5H)的表达(PV×400)。5A及5E:正常对照组; 5B及5F:糖尿病对照组; 5C及5G:假手术组; 5D及5H:Roux-en-Y胃旁路手术组 图 6示各组大鼠肾脏组织Bcl-2(6A~6D)及ICAM-1(6E~6H)的表达(PV×100)。6A及6E:正常对照组; 6B及6F:糖尿病对照组; 6C及6G:假手术组; 6D及6H:Roux-en-Y胃旁路手术组
3 讨论
糖尿病肾病是糖尿病主要的微血管并发症之一，糖尿病患者中糖尿病肾病的发病率为20%～40%。在我国，随着糖尿病患者人数的增加及寿命的延长，糖尿病肾病的发病率呈逐年攀升的趋势。T2DM肾脏呈缓慢进行性损害，在出现临床症状前，肾脏即已存在肾小球内高灌注和高滤过[6]，肾小球毛细血管袢基底膜增厚和系膜基质增多、肾小球硬化[7]等。本研究采用高脂饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素的方法建立T2DM大鼠模型，病理学观察结果表明，糖尿病模型动物出现肾小球系膜细胞和系膜基质轻至中度增生，肾小球毛细血管袢受压，基底膜增厚，与糖尿病肾病早期病变基本一致。
近年一些回顾性研究发现，代谢综合征以及肥胖型T2DM患者经胃旁路术治疗后其尿微量白蛋白和尿白蛋白/肌酐比值显著降低[2-3]，对已存在肾功能损害及慢性肾功能衰竭的患者实施胃旁路术后，其尿蛋白、血肌酐及肾脏病理改变都较术前有所降低和改善[8-9]。本实验也发现，行胃转流手术后糖尿病大鼠血BUN、Cr及24 h尿微量白蛋白都明显降低。因其具体机理目前尚不十分清楚，因此本研究拟初步探讨胃旁路术对肾脏保护的可能作用机理。
3.1 胃转流术对T2DM大鼠肾脏纤维化的影响
肾小球系膜基质的过度沉积及基底膜增厚是糖尿病肾病超微结构改变的主要标志之一。目前的研究[10]已经证实，TGF-β信号转导通路的异常激活是糖尿病肾脏纤维化的主要机理。TGF-β是一类调节细胞生长和分化的TGF-β超家族，其主要作用包括调节细胞增殖和分化、介导肾小管上皮细胞向间充质细胞转变分化、趋化和活化炎性细胞、促进细胞外基质的沉积、抑制免疫反应等。在肾脏以TGF-β1的表达为主, 主要在肾小球及肾小管上皮细胞表达，本研究也同样证实了这一点。TGF-β1可以通过自分泌和旁分泌的方式直接促使肾脏系膜细胞肥大，在细胞增殖及纤维化中发挥重要作用，是促进基质沉积和组织纤维化的关键细胞因子之一[11]。Petersen等[12]的研究发现，在给予TGF-β1Ⅰ型和Ⅱ型受体激酶抑制剂后能明显减轻肾脏系膜区增生及纤维化程度。TGF-β1的过度表达在糖尿病肾病的发展过程中是一个起重要作用的因素，TGF-β1的表达量是判断肾脏早期损害的敏感指标之一[13]。因此本研究检测TGF-β1在肾脏的表达以评估各组大鼠肾脏损害的进展情况。本研究术后8周，糖尿病大鼠肾脏皮质肾小球及肾小管可见TGF-β1大量表达，肾小球体积增大，PAS和Masson染色可见系膜增生、基底膜增厚，FN及CoⅣ在肾小球及肾小管间质大量沉积。TGF-β1的这种扩大化效应，可能是不断促进肾脏组织纤维化进程，加速糖尿病肾病发展的重要原因之一。然而，胃转流手术后大鼠TGF-β1的表达明显降低，细胞外基质的沉积明显减少，系膜细胞增生得到明显抑制，有效缓解了糖尿病早期肾脏损害的继续发展。推测手术可能通过降低肾脏TGF-β1表达从而实现对肾脏的保护作用，但手术与TGF-β1之间的直接作用关系尚不明确，仍需进一步研究。
3.2 胃转流术对T2DM大鼠肾脏氧化应激的影响
氧化应急在糖尿病肾病的发生发展中同样起着重要作用，氧化应急和炎性反应在糖尿病的发展中密切联系且相互影响，共同形成一恶性循环。糖尿病肾病时氧化应急水平的升高主要是活性氧簇（ROS）的产生增多，在ROS中，超氧阴离子（O-）是最主要的组分，NADPH氧化酶是产生O-的主要调控酶之一[14]，糖尿病氧化应激水平的升高与NADPH氧化酶的活化有关。Gorin等[15]的研究显示，STZ诱导的糖尿病大鼠肾病模型中，肾脏NADPH氧化酶，尤其是NADPH氧化酶4是加重肾脏氧化应激损伤的主要因素。NADPH氧化酶4主要由肾小球系膜细胞和内皮细胞产生[16-17]，在正常状态下处于低表达状态。本研究也证实NADPH氧化酶4能在肾小球系膜区表达，并糖尿病大鼠肾小球系膜区NADPH氧化酶4的表达明显高于正常大鼠，而胃转流手术后大鼠肾小球系膜区NADPH氧化酶4的表达明显降低，推测其可能和促炎细胞因子释放减少、超滤正常化及血糖血脂的改善有关。此外，Etoh等[17]发现，尿8-OHdG的降低与NADPH氧化酶4表达水平降低及表达范围的减小平行，故NADPH氧化酶4表达的降低可能是尿8-OHdG降低的一个重要原因。术后肾脏功能的改善可能与氧化应激状态的下调有关，从而改善肾脏相关的血管并发症。
3.3 胃转流术对T2DM大鼠肾脏细胞凋亡和炎性细胞浸润的影响
细胞凋亡在糖尿病肾病的发展过程中也起着重要作用。糖尿病状态下糖脂代谢的紊乱使细胞凋亡增加是发生糖尿病肾病的重要原因之一，细胞凋亡密切参与了糖尿病肾病的发病[18]。细胞凋亡的发生主要是由细胞内凋亡相关的分子介导，Bcl-2是目前公认的抗凋亡基因，是迄今研究最深入和广泛的凋亡调控基因之一，它是一类膜整合蛋白，通过广泛抑制各种刺激剂诱导的细胞凋亡, 延长细胞活力而发挥作用[19]。Ortiz等[20]发现，糖尿病大鼠肾小管上皮细胞抗凋亡基因Bcl-2表达明显降低，细胞凋亡数目增加，认为糖尿病状态下糖脂的代谢异常可能改变了凋亡基因的表达，从而使细胞凋亡增加，引起肾脏功能损害。本实验也发现，Bcl-2在正常大鼠肾小管上皮细胞大量表达，而糖尿病大鼠肾小管上皮细胞Bcl-2的表达明显减少；胃转流手术能显著改善糖尿病大鼠的血糖和血脂，术后8周手术组大鼠肾小管上皮细胞Bcl-2的表达明显高于糖尿病大鼠，推测手术对肾脏功能的保护作用可能与术后上调Bcl-2的表达有关。其次，手术后诸多胃肠道激素的改变是否对Bcl-2有直接作用尚需实验进一步证实。
单核/巨噬细胞在肾小球和肾间质的浸润也是糖尿病肾病的特征性表现之一。黏附分子（adhesion molecules，AMs）是一类调节细胞之间和细胞与细胞外基质间相互黏附结合的一类糖蛋白，在糖尿病肾病的发生发展中起重要作用。ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族的重要成员。有研究[21]证实，ICAM-1可导介单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞黏附，致炎性细胞浸润到肾脏组织，产生各种炎性因子和细胞因子，参与了糖尿病肾病的病程进展。Sugimoto等[22]的研究发现，在糖尿病动物模型中拮抗ICAM-1表达的同时，肾实质内巨噬细胞的浸润也相应减少，表明在糖尿病肾病的发展过程中ICAM-1是炎性细胞浸润的关键分子。本实验结果显示，糖尿病大鼠肾脏ICAM-1的表达明显高于正常对照组大鼠，广泛表达于肾小球及肾小管上皮细胞；术后8周，Roux-en-Y胃旁路手术组大鼠ICAM-1的表达则明显降低，肾脏功能得到改善。手术后ICAM-1的降低可能与术后肾脏微炎性反应状态、氧化应激、血糖血脂等的改善有关，但本实验并未检测肾脏炎性细胞的浸润情况，这也是本实验一个不足的地方。
综上所述，胃旁路术后能改善糖尿病大鼠的肾脏功能和病理损害，对肾脏具有保护作用, 其作用机理是多方面的，可能通过降低TGF-β1、NADPH氧化酶4、Bcl-2、ICAM-1等的表达，从而改善糖尿病状态下肾脏的微炎性反应状态、氧化应激等，预防和延缓糖尿病肾病的发生和发展。
2型糖尿病（T2DM）是一种常见的慢性代谢性疾病，相较于传统治疗，Roux-en-Y胃旁路术能明显而持久地改善80%～100% T2DM患者的血糖、胰岛素和糖化血红蛋白，同时也可纠正糖耐量异常和胰岛素抵抗[1]。糖尿病肾病是糖尿病主要的微血管并发症，是引起T2DM患者死亡的主要原因之一。近年来的临床观察[2-3]表明，T2DM患者经胃转流术治疗后其受损的肾脏功能有一定改善，但尚缺乏进一步的研究。本实验拟采用高脂饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素建立大鼠T2DM模型，观察胃转流术后对大鼠肾脏组织病理形态学、炎性因子及细胞因子的影响，探讨胃转流术对糖尿病大鼠肾脏保护的可能作用机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物及饲料
8周龄SPF级SD大鼠40只，雄性，体质量170～190 g，由简阳达硕动物科技有限公司提供，许可证号：SCXK（川）2004。实验动物基础饲料由简阳达硕动物科技有限公司提供，高脂饲料由基础鼠饲料（72%）加炼猪油（15%）、蔗糖（10%）和蛋黄（3%）按比搭配制成高脂高糖饲料。
1.2 主要试剂
链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自Sigma公司，柠檬酸缓冲液及稳步型血糖仪购自美国雅培公司。PAS染色试剂盒和Masson染色试剂盒购自南京建成科技有限公司。尿8-羟基脱氧鸟酐（8-OhdG）Elisa试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.3 糖尿病动物模型复制、分组及处理
雄性SD大鼠40只，按随机数字表法随机分为正常对照组（NC组）8只和糖尿病建模动物32只，NC组动物给予基础饲料，建模动物给予高脂饲料。建模动物喂养4周后，禁食12 h，于左下腹腔一次性注射STZ 35 mg/kg（用0.1 mol/L、pH 4.4的柠檬酸缓冲液在避光和冰浴下配制成浓度为1% STZ溶液，现配现用）。1周后行口服糖耐量试验（OGTT）试验（禁食12 h，葡萄糖1.5 g/kg灌胃，测2 h血糖），筛选血糖值大于11.1 mmol /L的大鼠确定为糖尿病大鼠（成模30只，成模率为93.8%）[4]。模型稳定1周后，将成模的30只糖尿病大鼠按随机数字表法随机分为3组，即糖尿病模型对照组8只、假手术组8只和Roux-en-Y胃旁路手术组14只。假手术组行胃窦十二指肠离断原位吻合术，Roux-en-Y胃旁路手术组行胃转流术：大鼠术前禁食12 h，不限饮水，0.5％戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔内注射麻醉后固定于手术台，无菌条件下取上腹部正中切口长3 cm切开进腹，闭合胃远端，距Treitz韧带10 cm切断空肠，远端肠襻行胃空肠吻合，距胃肠吻合口远端10 cm行空肠侧侧吻合，完成吻合后用甲硝唑溶液5 mL冲洗腹腔后关腹。手术14只，术后8周存活6只，存活率为42.9%。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 血糖测定
分别于术前及术后8周，大鼠尾尖取血0.1 mL，用雅培Optium Xceed血糖仪检测各组各时间点大鼠的空腹血糖值
1.4.2 血清总胆固醇（Tch）、甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（FFA）、尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）测定
分别于术前及术后8周获取大鼠眶静脉血1.5 mL，采用全自动生化分析仪测定各组大鼠的Tch、TG、BUN及Cr，用ELISA法测定FFA。
1.4.3 尿微量白蛋白及尿8-OhdG的测定
分别与术前及术后8周，搜集各组大鼠24 h尿液，采用全自动生化分析仪测定各组大鼠24 h尿微量白蛋白，用ELISA法测定尿8-OhdG水平。
1.4.4 肾脏病理组织学观察及肾重指数、肾小球平均截面积（MGA）和肾小球平均体积（MGV）的测定
于术后8周将大鼠麻醉开腹行肾脏灌注后取下双侧肾脏并称重，计算肾重指数，肾重指数（mg/g）=双侧肾重/体质量；然后将大鼠左侧肾脏沿纵轴切开后分别用10%中性甲醛溶液和Carrnoy固定液固定24 h后，脱水透明，石蜡包埋，切割制备4μm厚的组织切片，分别进行HE染色、Masson染色和PAS染色，于光镜下观察各组大鼠肾组织的形态学变化；应用Image-ProPlus图像分析软件对病理染色切片（×400）进行图像分析，每张切片随机选择10个正切的肾小球，测定其截面积，取其平均值作为每个标本的MGA，根据公式MGV=1.25×（MGA）3/2计算MGV。
1.4.5 免疫组化染色检测纤连蛋白(FN)、Ⅳ型胶原（CoⅣ）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶4（NOX4）和Bcl-2蛋白表达
取已制备的各组大鼠肾脏组织石蜡切片，采用PV两步法检测，其操作步骤参照试剂盒说明书进行，用PBS代替一抗作为阴性对照，含有以上蛋白抗原的肝脏组织石蜡切片作为阳性对照。兔抗大鼠TGF-β1、FN、CoⅣ、ICAM-1、NOX4及Bcl-2多克隆抗体（购自武汉博士德）按1∶100稀释，每张切片在Olympus显微镜400倍下，用Image-ProPlus图像采集系统随机选取10个含肾小球的视野, 用Image-ProPlus图像分析软件测量免疫组化染色的积分光密度值（integral optical density，IOD）[5]，计算各组大鼠目标蛋白平均IOD值，IOD值越高则蛋白表达量越高。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 4组大鼠血糖和肾重指数检测结果
结果见表 1。由表 1可见，与正常对照组相比，糖尿病对照组和假手组的肾重指数明显升高（P < 0.05）；Roux-en-Y胃旁路手术组的肾重指数与糖尿病对照组和假手组相比有一定程度降低，其差异具有统计学意义（P < 0.05），但与正常对照组相比，其差异无统计学意义（P > 0.05）。与正常对照组相比，术前糖尿病对照组、假手术组和Roux-en-Y胃旁路手术组的血糖均明显升高（P < 0.05)；术后8周，Roux-en-Y胃旁路手术组的血糖明显下降，接近正常对照组，而糖尿病对照组和假手术组的血糖则进一步升高，其差异有统计学意义（P < 0.05)。提示胃转流术具有明显的降糖作用。
表1
各组大鼠血糖和肾重指数检测结果（2.2 4组大鼠血清BUN及Cr检测结果
结果见表 2。由表 2可见，术前各组的血清BUN和Cr水平接近，其差异均无统计学意义（P > 0.05）。与正常对照组相比，术后4周及8周糖尿病对照组和假手组的血清BUN和Cr均有不同程度升高，肾功能逐渐恶化，其差异具有统计学意义（P < 0.05）；Roux-en-Y胃旁路手术组的血清BUN及Cr在术后4周和8周的变化不大，接近术前水平，明显低于糖尿病对照组和假手组，其差异具有统计学意义（P < 0.05）。
表2
各组大鼠血清BUN及Cr检测结果（2.3 4组大鼠血清TC、TG及FFA检测结果
结果见表 3。由表 3可见，与正常对照组相比，糖尿病模型组血清TC、TG、FFA均升高明显，差异具有统计学意义（P < 0.001）；术后8周，与糖尿病对照组及假手组相比，Roux-en-Y胃旁路手术组血清TC、TG及FFA均有不同程度降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。提示Roux-en-Y胃旁路手术能在一定程度上改善糖尿病大鼠的血脂水平。
表3
各组大鼠血清TC、TG及FFA检测结果（2.4 4组大鼠的MGA及MGV检测结果
结果见表 4。如表 4所示，术后8周，与正常对照组相比，糖尿病对照组及假手术组的MGA和MGV均明显增大，其差异具有统计学意义（P < 0.05）；与糖尿病对照组及假手术组相比，Roux-en-Y胃旁路手术组的MGA及MGV明显减小，其差异具有统计学意义（P < 0.05），并接近正常对照组。
表4
各组大鼠的MGA和MGV检测结果（2.5 4组大鼠24 h尿微量白蛋白及尿8-OhdG测定结果
结果见表 5。如表 5所示，术前，与正常对照组相比，糖尿病对照组24 h尿微量白蛋白轻度升高，差异具有统计学意义（P < 0.05），尿8-OHdG升高不明显，差异无统计学意义（P > 0.05）；术后8周，Roux-en-Y胃旁路手术组较糖尿病对照组和假手术组24 h尿微量白蛋白和尿8-OHdG均明显降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。
表5
各组大鼠24 h尿微量白蛋白及尿8-OHdG检测结果比较（2.6 4组大鼠肾脏组织病理形态学的改变
肾脏组织HE染色结果显示，与正常对照组比较，糖尿病对照组的肾小球体积明显增大，系膜区增宽，系膜细胞增生，肾小囊腔受压缩小，而Roux-en-Y胃旁路手术组较糖尿病对照组肾小球体积明显减小，系膜增生有一定改善（图 1A～图 1D）。肾脏组织PAS染色结果显示，与正常对照组比较，糖尿病对照组的肾小球体积增大，系膜区基质明显增多，系膜区扩大，肾小球毛细血管袢受压，基底膜增厚，而Roux-en-Y胃旁路手术组的上述改变较糖尿病对照组有明显的改善（图 2A～图 2D）。肾脏组织Masson染色蓝染区主要为胶原成分，通过观察可见正常对照组大鼠的肾小球结构清晰，仅在肾小球基底膜和系膜基质可见少许蓝染的胶原纤维；糖尿病对照组大鼠在肾小球中可见蓝染的胶原纤维区域明显增大，基底膜增厚，系膜区胶原沉积；而Roux-en-Y胃旁路手术组的肾小球胶原沉积明显减少（图 3A～图 3D）。
图1
示胃转流术对糖尿病大鼠肾脏组织病理学变化的影响(HE×400)。1A:正常组; 1B:糖尿病对照组, 见肾小球体积增大, 肾小囊腔受压缩小; 1C:假手术组; 1D:Roux-en-Y胃旁路手术组, 见肾小球体积明显减小 图 2示胃转流术对糖尿病大鼠肾脏组织病理学变化的影响(PAS×400)。2A:正常组; 2B:糖尿病对照组, 见肾小球体积增大, 肾小球毛细血管袢受压, 基底膜增厚; 2C:假手术组; 2D:Roux-en-Y胃旁路手术组, 见肾小球体积明显减小 图 3示胃转流术对糖尿病大鼠肾脏组织病理学变化的影响(Masson×400)。3A:正常组; 3B:糖尿病对照组, 见肾小球中可见蓝染的胶原纤维区域明显增大, 系膜区胶原沉积; 3C:假手术组; 3D:Roux-en-Y胃旁路手术组, 见肾小球胶原沉积明显减少 图 4示各组大鼠肾脏组织的FN(4A~4D)及CoⅣ(4E~4H)的表达(PV×400)。4A及4E:正常对照组; 4B及4F:糖尿病对照组; 4C及4G:假手术组; 4D及4H:Roux-en-Y胃旁路手术组
2.7 4组大鼠肾脏皮质纤连蛋白（FN）、Ⅳ型胶原（CoⅣ）的检测结果
图 4A～4D示4组大鼠肾小球及肾小管间质FN的表达，术后8周时糖尿病对照组、假手术组和Roux-en-Y胃旁路手术组肾小球及肾小管间质的FN表达均明显高于正常对照组（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手术组FN的表达则较糖尿病对照组和假手术组明显降低（P < 0.05）；图 4E～4H示4组大鼠肾小球的CoⅣ的表达，术后8周时糖尿病对照组、假手术组和Roux-en-Y胃旁路手术组肾小球CoⅣ的表达均明显高于正常对照组（P < 0.05），Roux-en-Y胃旁路手术组CoⅣ的表达则较糖尿病对照组和假手术组明显降低（P < 0.05）。具体见表 6。
表6
各组大鼠肾脏皮质FN、CoⅣ、TGF-β1、NOX4、Bcl-2和ICAM-1表达检测结果（IOD值，2.8 4组大鼠肾脏皮质TGF-β1、NOX4、Bcl-2及ICAM-1表达检测结果
图 5A~5D示4组大鼠肾脏皮质TGF-β1的表达，术后8周时糖尿病对照组、假手术组和Roux-en-Y胃旁路手术组肾小球及肾小管中TGF-β1的表达均明显高于正常对照组（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手术组TGF-β1的表达则较糖尿病对照组和假手术组明显降低（P < 0.05）；图 5E～5H示4组大鼠肾脏皮质NOX4的表达，术后8周时糖尿病对照组、假手术组和Roux-en-Y胃旁路手术组肾小球及肾小管NOX4的表达均明显高于正常对照组（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手术组NOX4的表达则较糖尿病对照组和假手术组明显降低（P < 0.05），见表 6。图 6A～6D示4组大鼠肾脏皮质Bcl-2的表达，术后8周时糖尿病对照组、假手术组和Roux-en-Y胃旁路手术组肾小管Bcl-2的表达均明显低于正常对照组（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手术组Bcl-2的表达则较糖尿病对照组和假手术组明显增高（P < 0.05）；图 6E～6H示4组大鼠肾脏皮质ICAM-1的表达，术后8周时糖尿病对照组和假手术组肾小球及肾小管ICAM-1的表达均明显高于正常对照组（P < 0.05），而Roux-en-Y胃旁路手术组ICAM-1的表达则较糖尿病对照组和假手术组明显降低（P < 0.05），见表 6。
图5
示各组大鼠肾脏组织TGF-β1(5A~5D)及NOX4(5E~5H)的表达(PV×400)。5A及5E:正常对照组; 5B及5F:糖尿病对照组; 5C及5G:假手术组; 5D及5H:Roux-en-Y胃旁路手术组 图 6示各组大鼠肾脏组织Bcl-2(6A~6D)及ICAM-1(6E~6H)的表达(PV×100)。6A及6E:正常对照组; 6B及6F:糖尿病对照组; 6C及6G:假手术组; 6D及6H:Roux-en-Y胃旁路手术组
3 讨论
糖尿病肾病是糖尿病主要的微血管并发症之一，糖尿病患者中糖尿病肾病的发病率为20%～40%。在我国，随着糖尿病患者人数的增加及寿命的延长，糖尿病肾病的发病率呈逐年攀升的趋势。T2DM肾脏呈缓慢进行性损害，在出现临床症状前，肾脏即已存在肾小球内高灌注和高滤过[6]，肾小球毛细血管袢基底膜增厚和系膜基质增多、肾小球硬化[7]等。本研究采用高脂饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素的方法建立T2DM大鼠模型，病理学观察结果表明，糖尿病模型动物出现肾小球系膜细胞和系膜基质轻至中度增生，肾小球毛细血管袢受压，基底膜增厚，与糖尿病肾病早期病变基本一致。
近年一些回顾性研究发现，代谢综合征以及肥胖型T2DM患者经胃旁路术治疗后其尿微量白蛋白和尿白蛋白/肌酐比值显著降低[2-3]，对已存在肾功能损害及慢性肾功能衰竭的患者实施胃旁路术后，其尿蛋白、血肌酐及肾脏病理改变都较术前有所降低和改善[8-9]。本实验也发现，行胃转流手术后糖尿病大鼠血BUN、Cr及24 h尿微量白蛋白都明显降低。因其具体机理目前尚不十分清楚，因此本研究拟初步探讨胃旁路术对肾脏保护的可能作用机理。
3.1 胃转流术对T2DM大鼠肾脏纤维化的影响
肾小球系膜基质的过度沉积及基底膜增厚是糖尿病肾病超微结构改变的主要标志之一。目前的研究[10]已经证实，TGF-β信号转导通路的异常激活是糖尿病肾脏纤维化的主要机理。TGF-β是一类调节细胞生长和分化的TGF-β超家族，其主要作用包括调节细胞增殖和分化、介导肾小管上皮细胞向间充质细胞转变分化、趋化和活化炎性细胞、促进细胞外基质的沉积、抑制免疫反应等。在肾脏以TGF-β1的表达为主, 主要在肾小球及肾小管上皮细胞表达，本研究也同样证实了这一点。TGF-β1可以通过自分泌和旁分泌的方式直接促使肾脏系膜细胞肥大，在细胞增殖及纤维化中发挥重要作用，是促进基质沉积和组织纤维化的关键细胞因子之一[11]。Petersen等[12]的研究发现，在给予TGF-β1Ⅰ型和Ⅱ型受体激酶抑制剂后能明显减轻肾脏系膜区增生及纤维化程度。TGF-β1的过度表达在糖尿病肾病的发展过程中是一个起重要作用的因素，TGF-β1的表达量是判断肾脏早期损害的敏感指标之一[13]。因此本研究检测TGF-β1在肾脏的表达以评估各组大鼠肾脏损害的进展情况。本研究术后8周，糖尿病大鼠肾脏皮质肾小球及肾小管可见TGF-β1大量表达，肾小球体积增大，PAS和Masson染色可见系膜增生、基底膜增厚，FN及CoⅣ在肾小球及肾小管间质大量沉积。TGF-β1的这种扩大化效应，可能是不断促进肾脏组织纤维化进程，加速糖尿病肾病发展的重要原因之一。然而，胃转流手术后大鼠TGF-β1的表达明显降低，细胞外基质的沉积明显减少，系膜细胞增生得到明显抑制，有效缓解了糖尿病早期肾脏损害的继续发展。推测手术可能通过降低肾脏TGF-β1表达从而实现对肾脏的保护作用，但手术与TGF-β1之间的直接作用关系尚不明确，仍需进一步研究。
3.2 胃转流术对T2DM大鼠肾脏氧化应激的影响
氧化应急在糖尿病肾病的发生发展中同样起着重要作用，氧化应急和炎性反应在糖尿病的发展中密切联系且相互影响，共同形成一恶性循环。糖尿病肾病时氧化应急水平的升高主要是活性氧簇（ROS）的产生增多，在ROS中，超氧阴离子（O-）是最主要的组分，NADPH氧化酶是产生O-的主要调控酶之一[14]，糖尿病氧化应激水平的升高与NADPH氧化酶的活化有关。Gorin等[15]的研究显示，STZ诱导的糖尿病大鼠肾病模型中，肾脏NADPH氧化酶，尤其是NADPH氧化酶4是加重肾脏氧化应激损伤的主要因素。NADPH氧化酶4主要由肾小球系膜细胞和内皮细胞产生[16-17]，在正常状态下处于低表达状态。本研究也证实NADPH氧化酶4能在肾小球系膜区表达，并糖尿病大鼠肾小球系膜区NADPH氧化酶4的表达明显高于正常大鼠，而胃转流手术后大鼠肾小球系膜区NADPH氧化酶4的表达明显降低，推测其可能和促炎细胞因子释放减少、超滤正常化及血糖血脂的改善有关。此外，Etoh等[17]发现，尿8-OHdG的降低与NADPH氧化酶4表达水平降低及表达范围的减小平行，故NADPH氧化酶4表达的降低可能是尿8-OHdG降低的一个重要原因。术后肾脏功能的改善可能与氧化应激状态的下调有关，从而改善肾脏相关的血管并发症。
3.3 胃转流术对T2DM大鼠肾脏细胞凋亡和炎性细胞浸润的影响
细胞凋亡在糖尿病肾病的发展过程中也起着重要作用。糖尿病状态下糖脂代谢的紊乱使细胞凋亡增加是发生糖尿病肾病的重要原因之一，细胞凋亡密切参与了糖尿病肾病的发病[18]。细胞凋亡的发生主要是由细胞内凋亡相关的分子介导，Bcl-2是目前公认的抗凋亡基因，是迄今研究最深入和广泛的凋亡调控基因之一，它是一类膜整合蛋白，通过广泛抑制各种刺激剂诱导的细胞凋亡, 延长细胞活力而发挥作用[19]。Ortiz等[20]发现，糖尿病大鼠肾小管上皮细胞抗凋亡基因Bcl-2表达明显降低，细胞凋亡数目增加，认为糖尿病状态下糖脂的代谢异常可能改变了凋亡基因的表达，从而使细胞凋亡增加，引起肾脏功能损害。本实验也发现，Bcl-2在正常大鼠肾小管上皮细胞大量表达，而糖尿病大鼠肾小管上皮细胞Bcl-2的表达明显减少；胃转流手术能显著改善糖尿病大鼠的血糖和血脂，术后8周手术组大鼠肾小管上皮细胞Bcl-2的表达明显高于糖尿病大鼠，推测手术对肾脏功能的保护作用可能与术后上调Bcl-2的表达有关。其次，手术后诸多胃肠道激素的改变是否对Bcl-2有直接作用尚需实验进一步证实。
单核/巨噬细胞在肾小球和肾间质的浸润也是糖尿病肾病的特征性表现之一。黏附分子（adhesion molecules，AMs）是一类调节细胞之间和细胞与细胞外基质间相互黏附结合的一类糖蛋白，在糖尿病肾病的发生发展中起重要作用。ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族的重要成员。有研究[21]证实，ICAM-1可导介单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞黏附，致炎性细胞浸润到肾脏组织，产生各种炎性因子和细胞因子，参与了糖尿病肾病的病程进展。Sugimoto等[22]的研究发现，在糖尿病动物模型中拮抗ICAM-1表达的同时，肾实质内巨噬细胞的浸润也相应减少，表明在糖尿病肾病的发展过程中ICAM-1是炎性细胞浸润的关键分子。本实验结果显示，糖尿病大鼠肾脏ICAM-1的表达明显高于正常对照组大鼠，广泛表达于肾小球及肾小管上皮细胞；术后8周，Roux-en-Y胃旁路手术组大鼠ICAM-1的表达则明显降低，肾脏功能得到改善。手术后ICAM-1的降低可能与术后肾脏微炎性反应状态、氧化应激、血糖血脂等的改善有关，但本实验并未检测肾脏炎性细胞的浸润情况，这也是本实验一个不足的地方。
综上所述，胃旁路术后能改善糖尿病大鼠的肾脏功能和病理损害，对肾脏具有保护作用, 其作用机理是多方面的，可能通过降低TGF-β1、NADPH氧化酶4、Bcl-2、ICAM-1等的表达，从而改善糖尿病状态下肾脏的微炎性反应状态、氧化应激等，预防和延缓糖尿病肾病的发生和发展。
