引用本文： 张晔, 张连阳, 谭浩, 孙士锦, 李阳. 细胞骨架改构在LPS作用后VE-Cad胞吞途径转化中的作用. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(3): 269-273. doi: 10.7507/1007-9424.20150073 复制
血管通透性增高即血管渗漏表现为血管对液体、血浆蛋白及大分子物质的通透性增高，导致难以纠正的组织水肿和内环境紊乱加剧，引起腹腔积液、肠壁水肿、继发性腹内高压、腹腔间隙综合征、肠道细菌移位、多器官功能障碍等合并症发生，甚至导致患者死亡[1-5]。研究血管通透性增高的发生机理有助于维持体内液体平衡，改善疗效和提高生存率。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的血管通透性增高是严重腹部创伤后重要的病理学改变。本课题组前期对其发生机理进行了系列研究，发现血管内皮细胞钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cad）在质膜上的表达下调是LPS诱导的血管通透性增高的重要原因；在LPS处理的不同时期，VE-cad的胞吞由不同的途径介导，在早期（1 h）由网格蛋白介导，在后期（4 h后）由微囊介导，两者共同调节LPS诱导的血管通透性增高。然而，为什么LPS处理后会出现这两种胞吞方式？它们是如何进行转化的？目前尚不清楚。基础研究[6-9]提示，细胞骨架的改构可能在胞吞方式的变化中起重要作用。因此，本实验采用免疫共沉淀和单层细胞通透性检测技术，观察LPS作用后细胞骨架形态的变化，细胞骨架解聚剂和稳定剂对LPS作用后网格蛋白/微囊介导的VE-Cad胞吞、VE-Cad膜表达和血管通透性的影响，以期从细胞骨架改构方面来探讨LPS作用后胞吞途径转化的原因。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和设备
本实验所采用的细胞为CRL-2922人血管内皮细胞株，购自美国标准菌库（ATCC）。主要试剂：VE-cad、网格蛋白及小窝蛋白1（caveolin-1，Cav1，微囊主要的蛋白成分）抗体均购自Santa Cruz Biotechnology公司，异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）、FITC-次毒蕈环肽、蛋白G-琼脂糖和LPS均购自Sigma公司，15%胎牛血清购自Gibco公司，培养小室购自Corning公司，DMEM培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s培养基）购自HyClone公司，质膜蛋白提取试剂盒购自Abcam公司，细胞骨架解聚剂细胞松弛素D（cytochalasin D，Cyt D）和细胞骨架稳定剂Jasplakinolide（Jasp）均购自Enzo公司。设备：Leica TCS-SP共聚焦显微镜（Wetzlar公司，德国）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养以及接种
将CRL-2922细胞置于含有15%胎牛血清、4 500 mg/L葡萄糖、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中进行培养，当细胞生长至融合时进行实验。用于免疫共沉淀和免疫印迹的细胞接种在25 mL培养瓶中，用于单层细胞通透性检测的细胞接种在培养小室的半透膜上[10-11]。
1.2.2 LPS作用后细胞骨架形态的变化
实验分为空白对照组、LPS-1 h组及LPS-4 h组，LPS-1 h组及LPS-4 h组用终浓度为10 μg/mL的LPS分别作用1 h和4 h后观察细胞骨架形态，空白对照组任何时刻检测皆可。检测方法：取生长至融合的细胞，先用4%多聚甲醛固定30 min（37 ℃），再用0.3% Triton X-100和1% BSA透化30 min；再加入FITC-次毒蕈环肽孵育30 min（37 ℃）；最后以PBS缓冲液洗涤3次[12-13]。在Leica TCS-SP共聚焦显微镜下观察细胞骨架形态变化。
1.2.3 细胞骨架解聚剂和稳定剂对LPS作用后网格
蛋白/微囊介导的VE-Cad胞吞和膜VE-Cad表达的影响 实验分为LPS-1 h组、Cyt D+LPS-1 h组、LPS-4 h组及Jasp+LPS-4 h组。Cyt D+LPS-1 h组加入Cyt D（终浓度为2 µmol/L），Jasp+LPS-4 h组加入Jasp（终浓度为1 µmol/L），LPS的终浓度同上。实验重复4次。分别于相应时点检测网格蛋白/Cav1与VE-Cad的共沉淀和膜VE-Cad的表达水平。①网格蛋白/Cav1与VE-Cad的共沉淀：按常规方法收集细胞和提取细胞总蛋白，蛋白裂解液中分别加入VE-cad抗体（1∶50稀释）和蛋白G-琼脂糖4 ℃过夜，洗涤沉淀并煮沸分离后，采用Western blot法检测网格蛋白/Cav1（1∶200稀释）的表达，洗膜后检测VE-cad的表达[14-15]，以网格蛋白或Cav1与VE-cad条带光密度值的比值反映共沉淀水平。②膜VE-Cad的表达：收集细胞，采用质膜蛋白提取试剂盒提取胞浆和质膜蛋白（操作按试剂盒说明书进行），以Western blot法检测质膜中VE-Cad的表达水平，以膜VE-Cad与β-actin光密度值的比值反映膜VE-Cad的表达水平。
1.2.4 细胞骨架解聚剂和稳定剂对LPS作用后血管通透性的影响
实验分为空白对照组、LPS-1 h组、Cyt D+LPS-1 h组、LPS-4 h组及Jasp+LPS-4 h组，各物质的终浓度同上。分别于相应时点检测单层细胞通透性（空白对照组任何时刻检测皆可），实验重复4次。检测方法：取细胞生长融合的培养小室，在培养小室的上腔液中加入FITC-BSA作为示踪剂后，在下腔液中取样检测荧光强度，每15分钟取样1次，共8次，以累积荧光透过率反映血管通透性，计算方法参考文献[16-17]。
1.3 统计学方法
采用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 LPS作用后细胞骨架形态的变化
空白对照组的CRL-2922细胞中肌动蛋白呈均匀散在分布，细胞骨架无明显的聚合；LPS作用1 h时，肌动蛋白聚集呈点片状，发生明显聚合，可见细胞中有细长的张力丝形成；LPS作用4 h时，肌动蛋白重新显示出散在分布的趋势，细胞骨架解聚，张力丝几近消失（图 1）。
图1
示3组CRL-2922细胞的细胞骨架形态观察结果（共聚焦显微镜）。1A：空白对照组；1B：LPS-1 h组；1C：LPS-4 h组 图 2 示
2.2 网格蛋白/Cav1与VE-Cad共沉淀和膜VE-Cad
的表达结果与LPS-1 h组比较，Cyt D+LPS-1 h组细胞网格蛋白和VE-Cad的共沉淀水平较低（P<0.05），Cav1与VE-Cad的共沉淀水平较高（P<0.05），且膜VE-Cad的表达水平降低（P<0.05）；与LPS-4 h组比较，Jasp+LPS-4 h组细胞网格蛋白和VE-Cad的共沉淀水平的差异无统计学意义（P>0.05），而Cav1与VE-Cad的共沉淀水平较低（P<0.05），且膜VE-Cad的表达水平升高（P<0.05），见图 2和图 3。提示在LPS作用前期（1 h时），Cyt D可抑制网格蛋白与VE-Cad的共定位，增高Cav1与VE-Cad的共定位，降低膜VE-Cad的表达；在LPS作用后期（4 h时），Jasp可抑制Cav1与VE-Cad的共定位，同时上调了膜VE-Cad的表达。
2.3 血管通透性检测结果
与空白对照组比较，LPS-1 h组和LPS-4 h组的累积荧光透过率均较高（P<0.05）；与LPS-1 h组比较，Cyt D+LPS-1 h组的累积荧光透过率较高（P<0.05）；与LPS-4 h组比较，Jasp+LPS-4 h组的累积荧光透过率较低（P<0.05），见图 4。提示在LPS作用前期（1 h时），Cyt D可增强血管通透性；在LPS作用后期（4 h时），Jasp可抑制血管通透性。
图2
示5组单层细胞的累积荧光透过率结果。与正常对照组比较，# P<0.05；与LPS-1 h组比较，* P<0.05；与LPS-4 h组比较，△P<0.05
3 讨论
基础研究[6-9]表明，细胞骨架的改构可能在胞吞方式的变化中起重要作用。Engqvist-Goldstein等[6]报道，通过遗传学或化学的方法破坏酵母皮质肌动蛋白细胞骨架后，可以抑制网格蛋白介导的胞吞功能。Yarar等[7]发现，细胞骨架解聚剂latrunculin A可使包被网格蛋白的小泡的形成数量降低80%。此外，latrunculin A可引起大量的微囊阳性的膜结构快速进入细胞[8]。Shen等[9]发现，在Madin-Darby犬肾细胞中，latrunculin A引起微囊胞吞紧密连接中的重要组成蛋白即咬合蛋白，最终导致紧密连接结构和功能的破坏。因此笔者推测，细胞骨架改构可能是LPS作用后胞吞途径转化的重要原因，并通过本实验进行验证。结果提示，与LPS-1 h组比较，Cyt D+LPS-1 h组细胞网格蛋白和VE-Cad的共沉淀水平较低，Cav1与VE-Cad的共沉淀水平较高，膜VE-Cad的表达水平降低，血管通透性升高；与LPS-4 h组比较，Cav1与VE-Cad的共沉淀水平较低，膜VE-Cad的表达水平升高，血管通透性下降。提示LPS作用后细胞骨架先发生聚合，然后解聚，这种改构促使VE-Cad胞吞途径从由网格蛋白介导转化为由微囊介导。
目前认为，LPS引起血管通透性增高的途径主要有两种：细胞间途径和跨细胞途径。①细胞间途径：LPS通过刺激内皮细胞张力丝形成并收缩，导致细胞间黏附连接破坏、细胞间隙增大和血管通透性增高[18]；②跨细胞途径：LPS通过微囊对大分子物质的直接胞吞，导致血管通透性增高[19]。最近的研究[20]认为，细胞间途径开放是血管通透性增高的主要原因，而细胞间途径开放主要由内皮细胞张力丝形成并收缩引起[21]。结合本实验结果和前期结果，可以认为，在LPS作用后期（4 h后），尽管此时已发生细胞骨架的解聚，通过张力丝收缩而导致的细胞间途径开放作用减弱，但其可以通过促使微囊介导的VE-cad胞吞，加重膜VE-cad的表达丢失，从而维持细胞间隙增大和细胞间途径开放，导致持续的血管通透性增高。但是，细胞骨架引起网格蛋白和微囊介导这两种胞吞方式转化的机理如何，尚不清楚。可能与细胞骨架的结构（调节胞吞装置在质膜中的定位）及其机械功能（操控囊泡从质膜分离、内陷和进入胞浆）有关[22-25]，尚待进一步研究。
血管通透性增高即血管渗漏表现为血管对液体、血浆蛋白及大分子物质的通透性增高，导致难以纠正的组织水肿和内环境紊乱加剧，引起腹腔积液、肠壁水肿、继发性腹内高压、腹腔间隙综合征、肠道细菌移位、多器官功能障碍等合并症发生，甚至导致患者死亡[1-5]。研究血管通透性增高的发生机理有助于维持体内液体平衡，改善疗效和提高生存率。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的血管通透性增高是严重腹部创伤后重要的病理学改变。本课题组前期对其发生机理进行了系列研究，发现血管内皮细胞钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cad）在质膜上的表达下调是LPS诱导的血管通透性增高的重要原因；在LPS处理的不同时期，VE-cad的胞吞由不同的途径介导，在早期（1 h）由网格蛋白介导，在后期（4 h后）由微囊介导，两者共同调节LPS诱导的血管通透性增高。然而，为什么LPS处理后会出现这两种胞吞方式？它们是如何进行转化的？目前尚不清楚。基础研究[6-9]提示，细胞骨架的改构可能在胞吞方式的变化中起重要作用。因此，本实验采用免疫共沉淀和单层细胞通透性检测技术，观察LPS作用后细胞骨架形态的变化，细胞骨架解聚剂和稳定剂对LPS作用后网格蛋白/微囊介导的VE-Cad胞吞、VE-Cad膜表达和血管通透性的影响，以期从细胞骨架改构方面来探讨LPS作用后胞吞途径转化的原因。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和设备
本实验所采用的细胞为CRL-2922人血管内皮细胞株，购自美国标准菌库（ATCC）。主要试剂：VE-cad、网格蛋白及小窝蛋白1（caveolin-1，Cav1，微囊主要的蛋白成分）抗体均购自Santa Cruz Biotechnology公司，异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）、FITC-次毒蕈环肽、蛋白G-琼脂糖和LPS均购自Sigma公司，15%胎牛血清购自Gibco公司，培养小室购自Corning公司，DMEM培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s培养基）购自HyClone公司，质膜蛋白提取试剂盒购自Abcam公司，细胞骨架解聚剂细胞松弛素D（cytochalasin D，Cyt D）和细胞骨架稳定剂Jasplakinolide（Jasp）均购自Enzo公司。设备：Leica TCS-SP共聚焦显微镜（Wetzlar公司，德国）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养以及接种
将CRL-2922细胞置于含有15%胎牛血清、4 500 mg/L葡萄糖、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中进行培养，当细胞生长至融合时进行实验。用于免疫共沉淀和免疫印迹的细胞接种在25 mL培养瓶中，用于单层细胞通透性检测的细胞接种在培养小室的半透膜上[10-11]。
1.2.2 LPS作用后细胞骨架形态的变化
实验分为空白对照组、LPS-1 h组及LPS-4 h组，LPS-1 h组及LPS-4 h组用终浓度为10 μg/mL的LPS分别作用1 h和4 h后观察细胞骨架形态，空白对照组任何时刻检测皆可。检测方法：取生长至融合的细胞，先用4%多聚甲醛固定30 min（37 ℃），再用0.3% Triton X-100和1% BSA透化30 min；再加入FITC-次毒蕈环肽孵育30 min（37 ℃）；最后以PBS缓冲液洗涤3次[12-13]。在Leica TCS-SP共聚焦显微镜下观察细胞骨架形态变化。
1.2.3 细胞骨架解聚剂和稳定剂对LPS作用后网格
蛋白/微囊介导的VE-Cad胞吞和膜VE-Cad表达的影响 实验分为LPS-1 h组、Cyt D+LPS-1 h组、LPS-4 h组及Jasp+LPS-4 h组。Cyt D+LPS-1 h组加入Cyt D（终浓度为2 µmol/L），Jasp+LPS-4 h组加入Jasp（终浓度为1 µmol/L），LPS的终浓度同上。实验重复4次。分别于相应时点检测网格蛋白/Cav1与VE-Cad的共沉淀和膜VE-Cad的表达水平。①网格蛋白/Cav1与VE-Cad的共沉淀：按常规方法收集细胞和提取细胞总蛋白，蛋白裂解液中分别加入VE-cad抗体（1∶50稀释）和蛋白G-琼脂糖4 ℃过夜，洗涤沉淀并煮沸分离后，采用Western blot法检测网格蛋白/Cav1（1∶200稀释）的表达，洗膜后检测VE-cad的表达[14-15]，以网格蛋白或Cav1与VE-cad条带光密度值的比值反映共沉淀水平。②膜VE-Cad的表达：收集细胞，采用质膜蛋白提取试剂盒提取胞浆和质膜蛋白（操作按试剂盒说明书进行），以Western blot法检测质膜中VE-Cad的表达水平，以膜VE-Cad与β-actin光密度值的比值反映膜VE-Cad的表达水平。
1.2.4 细胞骨架解聚剂和稳定剂对LPS作用后血管通透性的影响
实验分为空白对照组、LPS-1 h组、Cyt D+LPS-1 h组、LPS-4 h组及Jasp+LPS-4 h组，各物质的终浓度同上。分别于相应时点检测单层细胞通透性（空白对照组任何时刻检测皆可），实验重复4次。检测方法：取细胞生长融合的培养小室，在培养小室的上腔液中加入FITC-BSA作为示踪剂后，在下腔液中取样检测荧光强度，每15分钟取样1次，共8次，以累积荧光透过率反映血管通透性，计算方法参考文献[16-17]。
1.3 统计学方法
采用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 LPS作用后细胞骨架形态的变化
空白对照组的CRL-2922细胞中肌动蛋白呈均匀散在分布，细胞骨架无明显的聚合；LPS作用1 h时，肌动蛋白聚集呈点片状，发生明显聚合，可见细胞中有细长的张力丝形成；LPS作用4 h时，肌动蛋白重新显示出散在分布的趋势，细胞骨架解聚，张力丝几近消失（图 1）。
图1
示3组CRL-2922细胞的细胞骨架形态观察结果（共聚焦显微镜）。1A：空白对照组；1B：LPS-1 h组；1C：LPS-4 h组 图 2 示
2.2 网格蛋白/Cav1与VE-Cad共沉淀和膜VE-Cad
的表达结果与LPS-1 h组比较，Cyt D+LPS-1 h组细胞网格蛋白和VE-Cad的共沉淀水平较低（P<0.05），Cav1与VE-Cad的共沉淀水平较高（P<0.05），且膜VE-Cad的表达水平降低（P<0.05）；与LPS-4 h组比较，Jasp+LPS-4 h组细胞网格蛋白和VE-Cad的共沉淀水平的差异无统计学意义（P>0.05），而Cav1与VE-Cad的共沉淀水平较低（P<0.05），且膜VE-Cad的表达水平升高（P<0.05），见图 2和图 3。提示在LPS作用前期（1 h时），Cyt D可抑制网格蛋白与VE-Cad的共定位，增高Cav1与VE-Cad的共定位，降低膜VE-Cad的表达；在LPS作用后期（4 h时），Jasp可抑制Cav1与VE-Cad的共定位，同时上调了膜VE-Cad的表达。
2.3 血管通透性检测结果
与空白对照组比较，LPS-1 h组和LPS-4 h组的累积荧光透过率均较高（P<0.05）；与LPS-1 h组比较，Cyt D+LPS-1 h组的累积荧光透过率较高（P<0.05）；与LPS-4 h组比较，Jasp+LPS-4 h组的累积荧光透过率较低（P<0.05），见图 4。提示在LPS作用前期（1 h时），Cyt D可增强血管通透性；在LPS作用后期（4 h时），Jasp可抑制血管通透性。
图2
示5组单层细胞的累积荧光透过率结果。与正常对照组比较，# P<0.05；与LPS-1 h组比较，* P<0.05；与LPS-4 h组比较，△P<0.05
3 讨论
基础研究[6-9]表明，细胞骨架的改构可能在胞吞方式的变化中起重要作用。Engqvist-Goldstein等[6]报道，通过遗传学或化学的方法破坏酵母皮质肌动蛋白细胞骨架后，可以抑制网格蛋白介导的胞吞功能。Yarar等[7]发现，细胞骨架解聚剂latrunculin A可使包被网格蛋白的小泡的形成数量降低80%。此外，latrunculin A可引起大量的微囊阳性的膜结构快速进入细胞[8]。Shen等[9]发现，在Madin-Darby犬肾细胞中，latrunculin A引起微囊胞吞紧密连接中的重要组成蛋白即咬合蛋白，最终导致紧密连接结构和功能的破坏。因此笔者推测，细胞骨架改构可能是LPS作用后胞吞途径转化的重要原因，并通过本实验进行验证。结果提示，与LPS-1 h组比较，Cyt D+LPS-1 h组细胞网格蛋白和VE-Cad的共沉淀水平较低，Cav1与VE-Cad的共沉淀水平较高，膜VE-Cad的表达水平降低，血管通透性升高；与LPS-4 h组比较，Cav1与VE-Cad的共沉淀水平较低，膜VE-Cad的表达水平升高，血管通透性下降。提示LPS作用后细胞骨架先发生聚合，然后解聚，这种改构促使VE-Cad胞吞途径从由网格蛋白介导转化为由微囊介导。
目前认为，LPS引起血管通透性增高的途径主要有两种：细胞间途径和跨细胞途径。①细胞间途径：LPS通过刺激内皮细胞张力丝形成并收缩，导致细胞间黏附连接破坏、细胞间隙增大和血管通透性增高[18]；②跨细胞途径：LPS通过微囊对大分子物质的直接胞吞，导致血管通透性增高[19]。最近的研究[20]认为，细胞间途径开放是血管通透性增高的主要原因，而细胞间途径开放主要由内皮细胞张力丝形成并收缩引起[21]。结合本实验结果和前期结果，可以认为，在LPS作用后期（4 h后），尽管此时已发生细胞骨架的解聚，通过张力丝收缩而导致的细胞间途径开放作用减弱，但其可以通过促使微囊介导的VE-cad胞吞，加重膜VE-cad的表达丢失，从而维持细胞间隙增大和细胞间途径开放，导致持续的血管通透性增高。但是，细胞骨架引起网格蛋白和微囊介导这两种胞吞方式转化的机理如何，尚不清楚。可能与细胞骨架的结构（调节胞吞装置在质膜中的定位）及其机械功能（操控囊泡从质膜分离、内陷和进入胞浆）有关[22-25]，尚待进一步研究。
