引用本文： 杨剑, 娜日苏, 郭春良. X射线损伤修复交叉互补基因1Arg399Gln、Arg280His和Arg194Trp位点多态性与胃癌易感性的相关性分析. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(2): 208-211. doi: 10.7507/1007-9424.20150056 复制
胃癌是一种最常见的消化系统肿瘤，大部分胃癌被发现于进展期，其5年生存率仅约为15%～20%[1]。对胃癌的病因至今尚未完全清楚，多认为饮食因素、感染因素、慢性炎症刺激以及遗传因素起着重要作用[2]。X射线损伤修复交叉互补基因1（XRCC1）是一种重要的DNA损伤修复基因，其包括Arg339Gln、Arg280His和Arg194Trp 3个常见的多态性位点，其多态性改变可能影响XRCC1蛋白的正常功能，从而降低DNA的修复能力，影响肿瘤的易感性和生物学行为[3]。目前，针对XRCC1基因多态性与胃癌的相关性研究并未达成共识[4-5]。本研究拟采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法检测Arg399Gln、Arg280His和Arg194Trp基因多态性与胃癌易感性的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选择2009年1月至2014年1月期间在我院住院的胃癌患者（胃癌组）120例，均经手术活组织病理检查证实为胃癌。选取120例健康体检人员且无消化系统疾病病史及肿瘤家族史的自愿者作为对照组，2组资料采用流行病学病例对照研究方法。
1.2 PCR-RFLP方法检测Arg399Gln、Arg280His和Arg194Trp基因多态性
1.2.1 外周血基因组DNA提取
采用酚/氯仿法提取外周血DNA。提取出的DNA在紫外线分光光度计下读取吸光度（A）260和A280值以鉴定其纯度和浓度。用无菌EP管分装，-80℃保存。
1.2.2 多态性位点引物设计
根据Arg399Gln位点对应的基因序列，设计PCR扩增引物，上游引物为5’-TTGTGCTTTCTCTGTGTCCA-3’, 下游引物为5’-TC-CTCCAGCCTTTTCTGATA-3’，扩增片段长度为595 bp；根据Arg280His位点对应的基因序列，设计PCR扩增引物，上游引物为5’-CCAGTGGTGCTAACCTAA-TC-3’，下游引物为5’-CACTCAGCACCACTACCAC-A-3’，扩增片段长度为181 bp；Arg194Trp位点对应的基因序列，设计PCR扩增引物，上游引物为5’-GCCAGGGCCCCTCCTFCAA-3’，下游引物为5’-TACCCTCAGACCCACGAGT-3’，扩增片段长度为396 bp。
1.2.3 PCR反应体系及反应条件程序
PCR反应体系为25μL，取2～10 ng基因组DNA，每种引物0.4μmol/mL，10×PCR缓冲液2.7μL，1.5 mmol/mL MgCl2，1.5 U Tag酶，100μmol/mL dNTP，采用Bio-Rad热循环仪。反应条件为94℃预变性4 min，94℃变性40 s，63℃复性55 s，72℃延伸40 s，35个循环，最后再72℃延伸7 min。
1.2.4 限制性酶切
酶切反应体系为20μL，其中PCR产物5μL，10×PCR缓冲液3.5μL，限制性内切酶MspⅠ(MBI) 5 U，37℃水浴过夜，酶切产物于2%琼脂糖凝胶电泳（电压120 V，30 min），根据电泳条带数判断基因型。
1.3 统计学方法
使用SPSS 16.0软件处理数据。采用Mann-Whitney检验比较2组之间年龄分布差异，采用卡方检验比较性别、吸烟、饮酒以及各基因型分布的差异，计量资料用t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 胃癌组与对照组的基本特征
2组在性别、年龄、有无吸烟史、饮酒史、饮食特点等常见暴露因素比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），见表 1。
表1
胃癌组与对照组的一般资料比较
2.2 胃癌组与对照组XRCC1基因194、280及399位点基因型分布
①胃癌组患者的XRCC1基因194位点Arg/Arg多态基因型出现频率低于对照组（P < 0.05），Arg/Trp、Trp/Trp多态基因型出现频率均明显高于对照组（P < 0.05），Arg/Trp+Trp/Trp变异型基因出现频率也明显高于对照组（P < 0.05）。②胃癌组患者的XRCC1基因280位点Arg/Arg、Arg/His、His/His多态基因型及Arg/His+His/His变异基因型与对照组比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。③胃癌组患者的XRCC1基因399位点Arg/Arg、Arg/Gln、Gln/Gln多态基因型及Arg/Gln+Gln/Gln变异基因型出现频率与对照组比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 2
表2
各位点基因多态型在2组中的分布情况〔例（%）〕
3 讨论
在我国，胃癌的发病率约为29.9/10万，是仅次于肺癌的第二高发肿瘤，其死亡率约为22.3/10万[6-7]，其中早期胃癌患者约仅占总胃癌患者的10%左右，这与早期胃癌的诊断水平和高危人群的筛查水平较低有着密切关系[8]。流行病学研究[9-12]表明，基因易感性在胃癌的发生、发展过程中扮演着重要的角色。因此，探索基因多态性与胃癌的相关性对胃癌的早期诊断具有重要的意义。
XRCC1是一种参与DNA损伤修复的重要基因。目前研究发现，XRCC1基因主要存在3个常见的多态性位点，它们分别是第10外显子G28152A（Arg399Gln）、第9外显子C27466A（Arg280His）及第6外显子C26304T（Arg194Trp）。碱基损伤、无碱基位点和单链断裂可以由内源性活性物质和DNA错配复制持续产生[3]。XRCC1改变可能改变基因组的稳定性，进而导致疾病或癌症[13-14]。目前已有研究[15-17]发现，XRCC1与乳腺癌、食管癌、结直肠癌等多种癌症的发生存在着相关性。然而，循证医学及流行病学证据至今仍没有确定XRCC1变异与癌症发生的确切关系，这与研究中人群的基因差异有关[4, 18-19]，如观察到亚洲人群突变纯合子Arg280His与乳腺癌有关，但在高加索人群中却没有被发现[20]。突变纯合子Arg194Trp在亚洲人群中能增加罹患肺癌的风险，但在高加索人群中能降低这种风险[21]。本研究中在胃癌组中Arg399Gln与Arg280His基因位点的变异基因型出现频率与对照组相比差异均无统计学意义（P > 0.05），结果提示，Arg399Gln与Arg280His位点多态性与胃癌的易感性无关；而Arg194Trp变异基因型在胃癌组出现的频率显著高于对照组，Arg194Trp纯合基因型在胃癌组出现的频率显著低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），结果提示，Arg194Trp位点变异基因型能增加胃癌的易感性，而Arg194Trp位点纯合基因型可能对胃癌的发生具有潜在的保护作用。然而，因纳入样本量有限，这一结果并不能说明整个地区、中国及亚洲人群的整体情况，因为不同人种的基因多态性也存在着一定差异[22]。
总之，XRCC1作为一种DNA损伤修复基因，其多态性与多种肿瘤的发生有关。XRCC1三种不同位点基因多态性与胃癌易感性的关系仍存在很大争议。从本研究的初步研究结果提示，XRCC1 Arg194Trp位点基因多态性与胃癌易感性有关，这可能为基因诊断胃癌提供了一定的理论依据。然而非随机抽样、有限的样本量及肿瘤诱发因素的多样性均会影响结果的准确性与代表性，因此仍需大样本高质量研究来验证这一结果。
胃癌是一种最常见的消化系统肿瘤，大部分胃癌被发现于进展期，其5年生存率仅约为15%～20%[1]。对胃癌的病因至今尚未完全清楚，多认为饮食因素、感染因素、慢性炎症刺激以及遗传因素起着重要作用[2]。X射线损伤修复交叉互补基因1（XRCC1）是一种重要的DNA损伤修复基因，其包括Arg339Gln、Arg280His和Arg194Trp 3个常见的多态性位点，其多态性改变可能影响XRCC1蛋白的正常功能，从而降低DNA的修复能力，影响肿瘤的易感性和生物学行为[3]。目前，针对XRCC1基因多态性与胃癌的相关性研究并未达成共识[4-5]。本研究拟采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法检测Arg399Gln、Arg280His和Arg194Trp基因多态性与胃癌易感性的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选择2009年1月至2014年1月期间在我院住院的胃癌患者（胃癌组）120例，均经手术活组织病理检查证实为胃癌。选取120例健康体检人员且无消化系统疾病病史及肿瘤家族史的自愿者作为对照组，2组资料采用流行病学病例对照研究方法。
1.2 PCR-RFLP方法检测Arg399Gln、Arg280His和Arg194Trp基因多态性
1.2.1 外周血基因组DNA提取
采用酚/氯仿法提取外周血DNA。提取出的DNA在紫外线分光光度计下读取吸光度（A）260和A280值以鉴定其纯度和浓度。用无菌EP管分装，-80℃保存。
1.2.2 多态性位点引物设计
根据Arg399Gln位点对应的基因序列，设计PCR扩增引物，上游引物为5’-TTGTGCTTTCTCTGTGTCCA-3’, 下游引物为5’-TC-CTCCAGCCTTTTCTGATA-3’，扩增片段长度为595 bp；根据Arg280His位点对应的基因序列，设计PCR扩增引物，上游引物为5’-CCAGTGGTGCTAACCTAA-TC-3’，下游引物为5’-CACTCAGCACCACTACCAC-A-3’，扩增片段长度为181 bp；Arg194Trp位点对应的基因序列，设计PCR扩增引物，上游引物为5’-GCCAGGGCCCCTCCTFCAA-3’，下游引物为5’-TACCCTCAGACCCACGAGT-3’，扩增片段长度为396 bp。
1.2.3 PCR反应体系及反应条件程序
PCR反应体系为25μL，取2～10 ng基因组DNA，每种引物0.4μmol/mL，10×PCR缓冲液2.7μL，1.5 mmol/mL MgCl2，1.5 U Tag酶，100μmol/mL dNTP，采用Bio-Rad热循环仪。反应条件为94℃预变性4 min，94℃变性40 s，63℃复性55 s，72℃延伸40 s，35个循环，最后再72℃延伸7 min。
1.2.4 限制性酶切
酶切反应体系为20μL，其中PCR产物5μL，10×PCR缓冲液3.5μL，限制性内切酶MspⅠ(MBI) 5 U，37℃水浴过夜，酶切产物于2%琼脂糖凝胶电泳（电压120 V，30 min），根据电泳条带数判断基因型。
1.3 统计学方法
使用SPSS 16.0软件处理数据。采用Mann-Whitney检验比较2组之间年龄分布差异，采用卡方检验比较性别、吸烟、饮酒以及各基因型分布的差异，计量资料用t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 胃癌组与对照组的基本特征
2组在性别、年龄、有无吸烟史、饮酒史、饮食特点等常见暴露因素比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），见表 1。
表1
胃癌组与对照组的一般资料比较
2.2 胃癌组与对照组XRCC1基因194、280及399位点基因型分布
①胃癌组患者的XRCC1基因194位点Arg/Arg多态基因型出现频率低于对照组（P < 0.05），Arg/Trp、Trp/Trp多态基因型出现频率均明显高于对照组（P < 0.05），Arg/Trp+Trp/Trp变异型基因出现频率也明显高于对照组（P < 0.05）。②胃癌组患者的XRCC1基因280位点Arg/Arg、Arg/His、His/His多态基因型及Arg/His+His/His变异基因型与对照组比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。③胃癌组患者的XRCC1基因399位点Arg/Arg、Arg/Gln、Gln/Gln多态基因型及Arg/Gln+Gln/Gln变异基因型出现频率与对照组比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 2
表2
各位点基因多态型在2组中的分布情况〔例（%）〕
3 讨论
在我国，胃癌的发病率约为29.9/10万，是仅次于肺癌的第二高发肿瘤，其死亡率约为22.3/10万[6-7]，其中早期胃癌患者约仅占总胃癌患者的10%左右，这与早期胃癌的诊断水平和高危人群的筛查水平较低有着密切关系[8]。流行病学研究[9-12]表明，基因易感性在胃癌的发生、发展过程中扮演着重要的角色。因此，探索基因多态性与胃癌的相关性对胃癌的早期诊断具有重要的意义。
XRCC1是一种参与DNA损伤修复的重要基因。目前研究发现，XRCC1基因主要存在3个常见的多态性位点，它们分别是第10外显子G28152A（Arg399Gln）、第9外显子C27466A（Arg280His）及第6外显子C26304T（Arg194Trp）。碱基损伤、无碱基位点和单链断裂可以由内源性活性物质和DNA错配复制持续产生[3]。XRCC1改变可能改变基因组的稳定性，进而导致疾病或癌症[13-14]。目前已有研究[15-17]发现，XRCC1与乳腺癌、食管癌、结直肠癌等多种癌症的发生存在着相关性。然而，循证医学及流行病学证据至今仍没有确定XRCC1变异与癌症发生的确切关系，这与研究中人群的基因差异有关[4, 18-19]，如观察到亚洲人群突变纯合子Arg280His与乳腺癌有关，但在高加索人群中却没有被发现[20]。突变纯合子Arg194Trp在亚洲人群中能增加罹患肺癌的风险，但在高加索人群中能降低这种风险[21]。本研究中在胃癌组中Arg399Gln与Arg280His基因位点的变异基因型出现频率与对照组相比差异均无统计学意义（P > 0.05），结果提示，Arg399Gln与Arg280His位点多态性与胃癌的易感性无关；而Arg194Trp变异基因型在胃癌组出现的频率显著高于对照组，Arg194Trp纯合基因型在胃癌组出现的频率显著低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），结果提示，Arg194Trp位点变异基因型能增加胃癌的易感性，而Arg194Trp位点纯合基因型可能对胃癌的发生具有潜在的保护作用。然而，因纳入样本量有限，这一结果并不能说明整个地区、中国及亚洲人群的整体情况，因为不同人种的基因多态性也存在着一定差异[22]。
总之，XRCC1作为一种DNA损伤修复基因，其多态性与多种肿瘤的发生有关。XRCC1三种不同位点基因多态性与胃癌易感性的关系仍存在很大争议。从本研究的初步研究结果提示，XRCC1 Arg194Trp位点基因多态性与胃癌易感性有关，这可能为基因诊断胃癌提供了一定的理论依据。然而非随机抽样、有限的样本量及肿瘤诱发因素的多样性均会影响结果的准确性与代表性，因此仍需大样本高质量研究来验证这一结果。
