引用本文： 冉江华, 张熙冰, 刘静, 张升宁, 李来邦, 陈奕明, 高杨, 李望, 李立. 恒河猴肝移植术后急性排斥反应时肝组织中转化生长因子-β1的表达. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(11): 1384-1390. doi: 10.7507/1007-9424.20140331 复制
肝移植已经成为治疗良性终末期肝病的最有效手段，但是，排斥反应仍然是影响移植物寿命的主要因素[1-2]。器官移植术后急性排斥反应时，机体转化生长因子-β1（TGF-β1）的改变对于早期发现、诊断急性排斥反应有重要的意义，虽然它在急性排斥反应中的机制现仍不清楚，但被认为在一定程度上指导临床尽早处理发挥着关键作用[3-6]。本实验旨在探讨恒河猴肝移植术后急性排斥反应发生时机体TGF-β1的变化。
1 材料与方法
1.1 实验动物
供、受体均为健康的恒河猴，共16只，年龄2～5岁，受体均为雄性，体质量7.2～11.5 kg，供体雌雄不限，体质量5.3～8.1 kg。实验动物均由昆明医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（滇）2009-0004，饲养于该中心动物房中，自由进食、水。供体术前不禁食、水，但控制其食物量；受体术前禁食12 h，禁水6 h，受体术前给予头孢唑林钠0.1 g/kg。实验过程中对动物的处置参照国家科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[7]。
1.2 恒河猴原位肝移植模型的建立及分组
采用二袖套法＋胆道支撑管建立恒河猴原位肝移植模型[8-9]。将建立原位肝移植模型成功的恒河猴用随机数字表法随机分为实验组和对照组2组，每组4只。实验组在肝移植成功后，不给予任何抗排斥处理。对照组在移植过程中给予甲基泼尼松龙250 mg静脉注射，并且在移植后给予他克莫司抗免疫排斥药物，剂量为0.1 mg /（kg•d）[10]，分2次给药。
1.3 标本采集
实验组和对照组分别在肝移植术后6 h、12 h、24 h和72 h四个时间点在麻醉下取标本，抽取静脉血3～5 mL，血样离心（4℃、3 000 r/min、r=5 cm、10 min），取上清液，入-80℃超低温冰箱保存待测，待标本齐备后，行肝功能、TGF-β1等检测。腹壁切开一小切口，取肝脏边缘约0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小肝组织4份（遇在各时点前后30 min内死亡的受体动物，亦取同样大小的肝组织及等量下腔静脉血列入该时点样本），用10%中性甲醛固定，用于苏木精-伊红（HE）染色及免疫组织化学检测。
1.4 肝功能检测
取-80℃保存待测血清标本行肝功能检测。全自动生化分析仪，用直接活力测定法测定血清丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）及血清总胆红素（total bilirubin，TBIL）的表达变化情况。
1.5 应用HE染色法检测肝组织病理学改变
将固定于甲醛中的肝组织制成石蜡切片，HE染色，光镜下观察急性排斥反应，并根据目前国际公认的Banff系统评估标准，将急性排斥反应根据排斥活动指数（RAI）评分（总分为9分）分为4级[11-12]：0级（不明确，RAI2～3分）：汇管区三体（肝动脉、门静脉和胆管）炎性细胞浸润程度未达到急性排斥的诊断标准；Ⅰ级（轻度，RAI 3～5分）：排斥性炎性细胞浸润汇管区少数的胆管和血管，炎性细胞数量较少，仅局限在汇管区间隙中；Ⅱ级（中度，RAI 5～7分）：排斥性炎性细胞浸及多数或全部汇管区的胆管和血管；Ⅲ级（重度，RAI 7～9分）：在中度的基础上，炎性细胞浸润汇管区周围，伴有中至重度静脉炎并扩展到肝实质，引起静脉周围肝细胞坏死。
1.6 应用免疫组织化学方法检测肝组织中TGF-β1蛋白表达
TGF-β1免疫组织化学检测试剂盒购于美国R & D公司。采用免疫组织化学SP法[13]检测肝组织中TGF-β1蛋白表达。切片制备完成后，在光镜下统一观察染色情况并进行摄片分析。每张切片随机选取8个视野（×100），输入计算机图像分析系统内分析TGF-β1蛋白表达阳性面积，并与视野测试面积相比求出阳性面积的百分率。
1.7 应用Western blot法检测肝组织中TGF-β1蛋白表达
TGF-β1多肽抗体购自美国Millipore。采用Western blot方法[14]检测肝组织TGF-β1蛋白表达。利用图像分析软件Image-Pro Plus 6测定目标显影条带灰度值，半定量结果以目标条带灰度值与相应β-actin条带灰度值比值表示。
1.8 统计学方法
所有数据分析均采用SPSS 17.0统计软件进行。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 实验动物数量分析
实验组和对照组分别建立恒河猴同种异体原位肝移植模型各4只，其中实验组术后缺失2只，对照组术后缺失1只，主要原因为移植后腹腔出血和呼吸循环功能衰竭所致，缺失恒河猴均及时予以补齐。
2.2 恒河猴肝移植术后肝功能的变化
2组术后ALT、AST和TBIL水平均随着时间的延长呈上升趋势，并且同一组内与前一时相比较差异有统计学意义（P＜0.05）。在移植术后6 h和12 h，2组间ALT、AST和TBIL水平比较接近，差异无统计学意义（P＞0.05）；在移植术后24 h和72 h，实验组ALT、AST和TBIL水平均较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1、2。
表1
肝移植术后不同时相实验组和对照组血清ALT和AST的变化（U/L，
表2
肝移植术后实验组和对照组血清TBIL的变化（μmol/L，2.3 恒河猴肝移植术后肝组织病理学改变结果
实验组和对照组在移植术后不同时相的病理改变结果见图 1A～1H。移植术后6 h，2组肝组织基本正常，未见排斥反应，见图 1A、1E。移植术后12 h，实验组有轻度急性排斥反应，镜下可见肝小叶结构基本正常，汇管区有中等量以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润，其中可见较多的淋巴细胞浸润，小叶间静脉内膜水肿明显增厚，内膜下可见中等量中性粒细胞浸润，胆管、血管均存在，但胆管上皮未见明显损伤，Banff评分Ⅰ～Ⅱ级；而对照组可见肝实质内有中等量的中性粒细胞浸润，汇管区仅见有少量的中性粒细胞浸润，排斥反应的分级不明确，Banff评分0～Ⅰ级，见图 1B、1F。移植术后24 h，实验组有中度至重度急性排斥反应，镜下可见汇管区大量单个核细胞浸润，并累及胆管、血管，肝小叶结构消失，伴有局灶性出血、坏死，Banff评分Ⅱ～Ⅲ级；而对照组有轻度急性排斥反应，镜下可见汇管区出现少量的单核细胞浸润，但侵入肝实质、胆管和血管的炎性细胞浸润程度达到轻型诊断标准，Banff评分0～Ⅰ级，见图 1C、1G。移植术后72 h，实验组有重度排斥反应，镜下可见汇管区大量单个核细胞浸润，并累及胆管、血管，肝小叶结构消失明显，且伴有明显的局灶性出血、坏死，Banff评分Ⅲ级的标本达到3个，见图 1D；而对照组有轻度急性排斥反应，镜下可见汇管区出现少量的单核细胞浸润，Banff评分Ⅰ～Ⅱ级，见图 1H。且该时点2组Banff评分比较，实验组排斥反应程度重于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 3。
图1
原位肝移植后肝组织病理学结果（HE ×100）。1A～1D为实验组；1E～1H为对照组。1A和1E为移植术后6 h；1B和1F为移植术后12 h；1C和1G为移植术后24 h；1D和1H为移植术后72 h 图 2 原位肝移植后肝组织中TGF-β1蛋白表达的免疫组织化学染色结果（SP ×100）。2A～2D为实验组，2E～2H为对照组。2A和2E为移植术后6 h，2B和2F为移植术后12 h，2C和2G为移植术后24 h，2D和2H为移植术后72 h
Figure1.
Histopathology results of liver tissues after orthotopic liver transplantation (HE ×100). 1A-1D: Experimental group; 1E-1H: Control group. 1A and 1E: At 6 h after liver transplantation; 1B and 1F: At 12 h after liver transplantation; 1C and 1G: At 24 h after liver transplantation; 1D and 1H: At 72 h after liver transplantation Figure 2 Immunohistochemistry results of TGF-β1 protein expression in liver tissues after orthotopic liver transplantation (SP ×100). 2A-2D: Experimental group; 2E-2H: Control group. 2A and 2E: At 6 h after liver transplantation; 2B and 2F: At 12 h after liver transplantation; 2C and 2G: At 24 h after liver transplantation; 2D and 2H: At 72 h after liver transplantation
表3
肝移植后72 h 2组移植物病理切片的Banff评分比较（例）
Table3.
Comparison of 72 h graft biopsy score of Banff after liver transplantation between two groups(case)
2.4 恒河猴肝移植术后免疫组织化学方法检测TGF-β1蛋白表达结果
TGF-β1蛋白表达的免疫组织化学染色阳性呈棕黄色定位于细胞浆，见图 2A～2H。TGF-β1免疫组织化学染色阳性面积百分率见表 4，从表 4可见，移植术后6 h时2组无明显变化（图 2A、2E），2组比较差异无统计学意义（P=0.514）；移植术后12 h时2组均升高，实验组较对照组升高明显（图 2B、2F），2组比较差异有统计学意义（P=0.002）；移植术后24 h时2组继续有所升高，实验组升高较明显（图 2C、2G），2组比较差异有统计学意义（P=0.021）；移植术后72 h时2组继续有所升高，实验组仍然较对照组升高明显（图 2D、2H），2组比较差异有统计学意义（P=0.034）。
表4
肝移植术后TGF-β1的免疫组织化学染色阳性面积百分率（%，2.5 恒河猴肝移植术后Western blot法检测TGF-β1蛋白表达结果
TGF-β1蛋白表达的定性结果见图 3。半定量结果见图 4，从图 4可见整体变化趋势：实验组和对照组均在6 h即开始随着时间的延长呈现上调趋势，而实验组上调的幅度较对照组大，在6 h、12 h、24 h和72 h时实验组均分别明显高于对照组相应时相（P值分别为0.003、0.001、0.001、0.001）。
图3
原位肝移植后肝组织中TGF-β1蛋白表达的定性结果
Figure3.
Qualitation results of TGF-β1 protein expression in liver tissues after orthotopic liver transplantation
图4
原位肝移植后肝组织中TGF-β1蛋白表达的半定量结果。与对照组相应时相比较，* P＜0.05
Figure4.
Semi-quantitation results of TGF-β1 protein expression in liver tissues after orthotopic liver transplantation. Compared with control group at the same time, * P < 0.05
3 讨论
急性排斥反应是肝移植术后常见并发症，也是导致移植肝无功能的主要原因之一，影响受体的长期生存[15-17]。
TGF-β是一组以多肽形式存在的细胞因子。机体的多种细胞均可分泌非活性状态的TGF-β，如血小板、T细胞、单核细胞、B细胞和成骨细胞，其中血小板中的TGF-β含量最高，T细胞或B细胞被激活后产生TGF-β的水平比静止期细胞明显高。TGF-β参与机体免疫反应的多个环节，并且对机体免疫功能起负向调节的作用，可抑制T、B细胞的活化和增殖，同时还可以抑制自然杀伤细胞和巨噬细胞的功能等，而且TGF-β通过下调白细胞介素-1受体的表达而阻断白细胞介素-1的作用[18-20]。TGF-β在炎症过程中也起着重要作用[18-22]。在炎症早期，富含TGF-β的血小板通过在损伤部位脱颗粒释放TGF-β进入损伤周围组织，此时，无活性的TGF-β与局部暴露的细胞外基质层结合后被激活，有活性的TGF-β对白细胞、单核细胞、T细胞等具有很强的化学趋化作用，这样，炎性细胞聚集导致组织损伤处大量炎症介质分泌，从而引起局部的一系列炎症过程。TGF-β属于一个结构相关的调节蛋白超家族，哺乳动物有3个TGF-β亚型表达，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 [23-24]。其中TGF-β1是一种多效性、多功能的细胞因子，参与免疫排斥反应的重要环节，它与同种异体移植免疫排斥反应密切相关，已成为器官移植及相关领域的一个研究热点[4, 25]。在本研究中，对实验组和对照组中不同时点的肝组织中TGF-β1蛋白定量以及免疫组织化学的细胞定位和微观形态学进行了检测，肝组织中TGF-β1蛋白定量检测则反映了局部的免疫变化，而肝组织的TGF-β1免疫组织化学结果则是揭示了TGF-β1的细胞定位和微观形态学的改变；本实验结果的整体变化趋势：实验组和对照组TGF-β1均在6 h即开始随着时间的延长呈现上调趋势，而实验组上调的幅度相对对照组大，且在24 h和72 h时间点差异有统计学意义（P＜0.05）。其原因可能是，急性排斥反应发生时，肝组织受到炎性细胞的浸润，引起TGF-β1在局部聚集，从而对组织细胞起到免疫保护作用，但是TGF-β1可能在局部被激活，从而可以趋化炎性细胞的聚集，引起更多的炎性细胞的浸润。
肝移植术后ALT、AST和TBIL水平是临床监测早期移植肝功能的常用指标，在临床用药和治疗中起到非常重要的指导作用。本研究结果显示，实验组和对照组移植后24 h、72 h时ALT、AST和TBIL指标均明显高于对照组（P＜0.05）。
目前，确诊急性排斥反应的金标准依然是病理学组织活检。本研究结果显示，实验组在术后72 h时肝组织的急性排斥反应病理学表现明显重于对照组，其Banff分级明显高于对照组（P＜0.05）。
从本研究实验结果初步得出，恒河猴肝移植急性排斥反应早期TGF-β表达明显上调，并且早于同时点肝功能、病理组织学的改变，可以为预测急性排斥反应发生后的早期诊断提供理论依据。但是，肝移植术后急性排斥反应是一个多因素调控、多环节参与且随移植术后时间的延长而发生变化的复杂过程，不能从单一指标来判断术后是否发生了排斥反应及排斥反应的严重程度，需要综合各项指标及临床表现来判断，从而为临床治疗提供一定的理论依据。
肝移植已经成为治疗良性终末期肝病的最有效手段，但是，排斥反应仍然是影响移植物寿命的主要因素[1-2]。器官移植术后急性排斥反应时，机体转化生长因子-β1（TGF-β1）的改变对于早期发现、诊断急性排斥反应有重要的意义，虽然它在急性排斥反应中的机制现仍不清楚，但被认为在一定程度上指导临床尽早处理发挥着关键作用[3-6]。本实验旨在探讨恒河猴肝移植术后急性排斥反应发生时机体TGF-β1的变化。
1 材料与方法
1.1 实验动物
供、受体均为健康的恒河猴，共16只，年龄2～5岁，受体均为雄性，体质量7.2～11.5 kg，供体雌雄不限，体质量5.3～8.1 kg。实验动物均由昆明医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（滇）2009-0004，饲养于该中心动物房中，自由进食、水。供体术前不禁食、水，但控制其食物量；受体术前禁食12 h，禁水6 h，受体术前给予头孢唑林钠0.1 g/kg。实验过程中对动物的处置参照国家科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[7]。
1.2 恒河猴原位肝移植模型的建立及分组
采用二袖套法＋胆道支撑管建立恒河猴原位肝移植模型[8-9]。将建立原位肝移植模型成功的恒河猴用随机数字表法随机分为实验组和对照组2组，每组4只。实验组在肝移植成功后，不给予任何抗排斥处理。对照组在移植过程中给予甲基泼尼松龙250 mg静脉注射，并且在移植后给予他克莫司抗免疫排斥药物，剂量为0.1 mg /（kg•d）[10]，分2次给药。
1.3 标本采集
实验组和对照组分别在肝移植术后6 h、12 h、24 h和72 h四个时间点在麻醉下取标本，抽取静脉血3～5 mL，血样离心（4℃、3 000 r/min、r=5 cm、10 min），取上清液，入-80℃超低温冰箱保存待测，待标本齐备后，行肝功能、TGF-β1等检测。腹壁切开一小切口，取肝脏边缘约0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小肝组织4份（遇在各时点前后30 min内死亡的受体动物，亦取同样大小的肝组织及等量下腔静脉血列入该时点样本），用10%中性甲醛固定，用于苏木精-伊红（HE）染色及免疫组织化学检测。
1.4 肝功能检测
取-80℃保存待测血清标本行肝功能检测。全自动生化分析仪，用直接活力测定法测定血清丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）及血清总胆红素（total bilirubin，TBIL）的表达变化情况。
1.5 应用HE染色法检测肝组织病理学改变
将固定于甲醛中的肝组织制成石蜡切片，HE染色，光镜下观察急性排斥反应，并根据目前国际公认的Banff系统评估标准，将急性排斥反应根据排斥活动指数（RAI）评分（总分为9分）分为4级[11-12]：0级（不明确，RAI2～3分）：汇管区三体（肝动脉、门静脉和胆管）炎性细胞浸润程度未达到急性排斥的诊断标准；Ⅰ级（轻度，RAI 3～5分）：排斥性炎性细胞浸润汇管区少数的胆管和血管，炎性细胞数量较少，仅局限在汇管区间隙中；Ⅱ级（中度，RAI 5～7分）：排斥性炎性细胞浸及多数或全部汇管区的胆管和血管；Ⅲ级（重度，RAI 7～9分）：在中度的基础上，炎性细胞浸润汇管区周围，伴有中至重度静脉炎并扩展到肝实质，引起静脉周围肝细胞坏死。
1.6 应用免疫组织化学方法检测肝组织中TGF-β1蛋白表达
TGF-β1免疫组织化学检测试剂盒购于美国R & D公司。采用免疫组织化学SP法[13]检测肝组织中TGF-β1蛋白表达。切片制备完成后，在光镜下统一观察染色情况并进行摄片分析。每张切片随机选取8个视野（×100），输入计算机图像分析系统内分析TGF-β1蛋白表达阳性面积，并与视野测试面积相比求出阳性面积的百分率。
1.7 应用Western blot法检测肝组织中TGF-β1蛋白表达
TGF-β1多肽抗体购自美国Millipore。采用Western blot方法[14]检测肝组织TGF-β1蛋白表达。利用图像分析软件Image-Pro Plus 6测定目标显影条带灰度值，半定量结果以目标条带灰度值与相应β-actin条带灰度值比值表示。
1.8 统计学方法
所有数据分析均采用SPSS 17.0统计软件进行。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 实验动物数量分析
实验组和对照组分别建立恒河猴同种异体原位肝移植模型各4只，其中实验组术后缺失2只，对照组术后缺失1只，主要原因为移植后腹腔出血和呼吸循环功能衰竭所致，缺失恒河猴均及时予以补齐。
2.2 恒河猴肝移植术后肝功能的变化
2组术后ALT、AST和TBIL水平均随着时间的延长呈上升趋势，并且同一组内与前一时相比较差异有统计学意义（P＜0.05）。在移植术后6 h和12 h，2组间ALT、AST和TBIL水平比较接近，差异无统计学意义（P＞0.05）；在移植术后24 h和72 h，实验组ALT、AST和TBIL水平均较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1、2。
表1
肝移植术后不同时相实验组和对照组血清ALT和AST的变化（U/L，
表2
肝移植术后实验组和对照组血清TBIL的变化（μmol/L，2.3 恒河猴肝移植术后肝组织病理学改变结果
实验组和对照组在移植术后不同时相的病理改变结果见图 1A～1H。移植术后6 h，2组肝组织基本正常，未见排斥反应，见图 1A、1E。移植术后12 h，实验组有轻度急性排斥反应，镜下可见肝小叶结构基本正常，汇管区有中等量以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润，其中可见较多的淋巴细胞浸润，小叶间静脉内膜水肿明显增厚，内膜下可见中等量中性粒细胞浸润，胆管、血管均存在，但胆管上皮未见明显损伤，Banff评分Ⅰ～Ⅱ级；而对照组可见肝实质内有中等量的中性粒细胞浸润，汇管区仅见有少量的中性粒细胞浸润，排斥反应的分级不明确，Banff评分0～Ⅰ级，见图 1B、1F。移植术后24 h，实验组有中度至重度急性排斥反应，镜下可见汇管区大量单个核细胞浸润，并累及胆管、血管，肝小叶结构消失，伴有局灶性出血、坏死，Banff评分Ⅱ～Ⅲ级；而对照组有轻度急性排斥反应，镜下可见汇管区出现少量的单核细胞浸润，但侵入肝实质、胆管和血管的炎性细胞浸润程度达到轻型诊断标准，Banff评分0～Ⅰ级，见图 1C、1G。移植术后72 h，实验组有重度排斥反应，镜下可见汇管区大量单个核细胞浸润，并累及胆管、血管，肝小叶结构消失明显，且伴有明显的局灶性出血、坏死，Banff评分Ⅲ级的标本达到3个，见图 1D；而对照组有轻度急性排斥反应，镜下可见汇管区出现少量的单核细胞浸润，Banff评分Ⅰ～Ⅱ级，见图 1H。且该时点2组Banff评分比较，实验组排斥反应程度重于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 3。
图1
原位肝移植后肝组织病理学结果（HE ×100）。1A～1D为实验组；1E～1H为对照组。1A和1E为移植术后6 h；1B和1F为移植术后12 h；1C和1G为移植术后24 h；1D和1H为移植术后72 h 图 2 原位肝移植后肝组织中TGF-β1蛋白表达的免疫组织化学染色结果（SP ×100）。2A～2D为实验组，2E～2H为对照组。2A和2E为移植术后6 h，2B和2F为移植术后12 h，2C和2G为移植术后24 h，2D和2H为移植术后72 h
Figure1.
Histopathology results of liver tissues after orthotopic liver transplantation (HE ×100). 1A-1D: Experimental group; 1E-1H: Control group. 1A and 1E: At 6 h after liver transplantation; 1B and 1F: At 12 h after liver transplantation; 1C and 1G: At 24 h after liver transplantation; 1D and 1H: At 72 h after liver transplantation Figure 2 Immunohistochemistry results of TGF-β1 protein expression in liver tissues after orthotopic liver transplantation (SP ×100). 2A-2D: Experimental group; 2E-2H: Control group. 2A and 2E: At 6 h after liver transplantation; 2B and 2F: At 12 h after liver transplantation; 2C and 2G: At 24 h after liver transplantation; 2D and 2H: At 72 h after liver transplantation
表3
肝移植后72 h 2组移植物病理切片的Banff评分比较（例）
Table3.
Comparison of 72 h graft biopsy score of Banff after liver transplantation between two groups(case)
2.4 恒河猴肝移植术后免疫组织化学方法检测TGF-β1蛋白表达结果
TGF-β1蛋白表达的免疫组织化学染色阳性呈棕黄色定位于细胞浆，见图 2A～2H。TGF-β1免疫组织化学染色阳性面积百分率见表 4，从表 4可见，移植术后6 h时2组无明显变化（图 2A、2E），2组比较差异无统计学意义（P=0.514）；移植术后12 h时2组均升高，实验组较对照组升高明显（图 2B、2F），2组比较差异有统计学意义（P=0.002）；移植术后24 h时2组继续有所升高，实验组升高较明显（图 2C、2G），2组比较差异有统计学意义（P=0.021）；移植术后72 h时2组继续有所升高，实验组仍然较对照组升高明显（图 2D、2H），2组比较差异有统计学意义（P=0.034）。
表4
肝移植术后TGF-β1的免疫组织化学染色阳性面积百分率（%，2.5 恒河猴肝移植术后Western blot法检测TGF-β1蛋白表达结果
TGF-β1蛋白表达的定性结果见图 3。半定量结果见图 4，从图 4可见整体变化趋势：实验组和对照组均在6 h即开始随着时间的延长呈现上调趋势，而实验组上调的幅度较对照组大，在6 h、12 h、24 h和72 h时实验组均分别明显高于对照组相应时相（P值分别为0.003、0.001、0.001、0.001）。
图3
原位肝移植后肝组织中TGF-β1蛋白表达的定性结果
Figure3.
Qualitation results of TGF-β1 protein expression in liver tissues after orthotopic liver transplantation
图4
原位肝移植后肝组织中TGF-β1蛋白表达的半定量结果。与对照组相应时相比较，* P＜0.05
Figure4.
Semi-quantitation results of TGF-β1 protein expression in liver tissues after orthotopic liver transplantation. Compared with control group at the same time, * P < 0.05
3 讨论
急性排斥反应是肝移植术后常见并发症，也是导致移植肝无功能的主要原因之一，影响受体的长期生存[15-17]。
TGF-β是一组以多肽形式存在的细胞因子。机体的多种细胞均可分泌非活性状态的TGF-β，如血小板、T细胞、单核细胞、B细胞和成骨细胞，其中血小板中的TGF-β含量最高，T细胞或B细胞被激活后产生TGF-β的水平比静止期细胞明显高。TGF-β参与机体免疫反应的多个环节，并且对机体免疫功能起负向调节的作用，可抑制T、B细胞的活化和增殖，同时还可以抑制自然杀伤细胞和巨噬细胞的功能等，而且TGF-β通过下调白细胞介素-1受体的表达而阻断白细胞介素-1的作用[18-20]。TGF-β在炎症过程中也起着重要作用[18-22]。在炎症早期，富含TGF-β的血小板通过在损伤部位脱颗粒释放TGF-β进入损伤周围组织，此时，无活性的TGF-β与局部暴露的细胞外基质层结合后被激活，有活性的TGF-β对白细胞、单核细胞、T细胞等具有很强的化学趋化作用，这样，炎性细胞聚集导致组织损伤处大量炎症介质分泌，从而引起局部的一系列炎症过程。TGF-β属于一个结构相关的调节蛋白超家族，哺乳动物有3个TGF-β亚型表达，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 [23-24]。其中TGF-β1是一种多效性、多功能的细胞因子，参与免疫排斥反应的重要环节，它与同种异体移植免疫排斥反应密切相关，已成为器官移植及相关领域的一个研究热点[4, 25]。在本研究中，对实验组和对照组中不同时点的肝组织中TGF-β1蛋白定量以及免疫组织化学的细胞定位和微观形态学进行了检测，肝组织中TGF-β1蛋白定量检测则反映了局部的免疫变化，而肝组织的TGF-β1免疫组织化学结果则是揭示了TGF-β1的细胞定位和微观形态学的改变；本实验结果的整体变化趋势：实验组和对照组TGF-β1均在6 h即开始随着时间的延长呈现上调趋势，而实验组上调的幅度相对对照组大，且在24 h和72 h时间点差异有统计学意义（P＜0.05）。其原因可能是，急性排斥反应发生时，肝组织受到炎性细胞的浸润，引起TGF-β1在局部聚集，从而对组织细胞起到免疫保护作用，但是TGF-β1可能在局部被激活，从而可以趋化炎性细胞的聚集，引起更多的炎性细胞的浸润。
肝移植术后ALT、AST和TBIL水平是临床监测早期移植肝功能的常用指标，在临床用药和治疗中起到非常重要的指导作用。本研究结果显示，实验组和对照组移植后24 h、72 h时ALT、AST和TBIL指标均明显高于对照组（P＜0.05）。
目前，确诊急性排斥反应的金标准依然是病理学组织活检。本研究结果显示，实验组在术后72 h时肝组织的急性排斥反应病理学表现明显重于对照组，其Banff分级明显高于对照组（P＜0.05）。
从本研究实验结果初步得出，恒河猴肝移植急性排斥反应早期TGF-β表达明显上调，并且早于同时点肝功能、病理组织学的改变，可以为预测急性排斥反应发生后的早期诊断提供理论依据。但是，肝移植术后急性排斥反应是一个多因素调控、多环节参与且随移植术后时间的延长而发生变化的复杂过程，不能从单一指标来判断术后是否发生了排斥反应及排斥反应的严重程度，需要综合各项指标及临床表现来判断，从而为临床治疗提供一定的理论依据。
