引用本文： 刘乔飞, 廖泉, 宗毅, 牛哲禹, 王梦一, 李媛, 卢朝辉, 赵玉沛. 免疫健全小鼠Panc02胰腺癌发展过程中免疫细胞群的动态变化. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(11): 1366-1371. doi: 10.7507/1007-9424.20140328 复制
胰腺癌恶性程度极高，发病率呈上升趋势[1]。多种免疫细胞对胰腺癌的发生发展有重要影响[2-3]。在胰腺癌发生发展过程中，外周血及肿瘤组织中免疫细胞群的详细动态变化趋势尚不清楚。本研究通过皮下接种C57BL6/J小鼠同源Panc02胰腺癌细胞建立种植瘤模型。根据肿瘤大小将其分为T1～T4期，详细了解各免疫细胞群的动态变化过程，为更深入研究胰腺癌的免疫调控过程提供一定的新线索。
1 材料与方法
1.1 实验动物
成年雄性C57BL6/J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，4～6周龄，体质量25～30 g。小鼠胰腺导管腺癌Panc02细胞株由本实验室保种传代。实验动物饲养于SPF级环境。动物实验均通过中国医学科学院北京协和医院动物伦理委员会审查。
1.2 试剂及抗体
抗小鼠单克隆或多克隆荧光标记抗体见表 1。
表1
实验所用抗体
Table1.
List of antibodies
1.3 肿瘤模型建立及分期定义
将1×106个Panc02胰腺癌细胞接种于C57BL6/J小鼠腋下。游标卡尺测量并参考公式“肿瘤体积=1/2长径×短径×短径”计算肿瘤体积。当皮下结节小于50 mm3时，很难明确其是肿瘤结节还是由于注射引起的炎性结节，故将肿瘤体积≥50 mm3定义为成瘤。当肿瘤体积≥1 500 mm3时，肿瘤生长缓慢且荷瘤小鼠开始死亡，将其定义为T4期；然后按肿瘤体积大小平均分期：50 mm3≤T1期＜500 mm3、500 mm3≤T2期＜1 000 mm3、1 000 mm3≤T3期＜1 500 mm3。选用4～6周龄C57BL6/J小鼠作为正常对照组。
1.4 流式细胞染色计数
毛细管经内眦取血后，红细胞裂解液裂解红细胞。获取肿瘤组织后，机械研磨联合胰蛋白酶消化的方法制备单细胞悬液。对组织和细胞行常规流式细胞染色方法染色。利用Accuri C6四通道流式细胞仪（BD，USA）检测各种免疫细胞群荧光标记表面分子表达，包括炎细胞（CD45+）、粒细胞（CD11b+）、辅助T（Th）淋巴细胞（CD3+CD4+）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL，CD3+CD8+）、B淋巴细胞（CD19+）、巨噬细胞（F4/80+）、树突细胞（CD11c+）、自然杀伤（NK）细胞（NKp46+）及NKT细胞（CD3+NK1.1+）。
1.5 统计学方法
采用GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software Inc.）软件进行统计分析。数据采用均数±标准差（
2 结果
2.1 胰腺癌进展过程中外周血中免疫细胞群的动态变化趋势
2.1.1 外周血中淋巴细胞逐渐减少
正常对照组外周血中淋巴细胞占所有CD45+炎细胞比例约为80%。①Th淋巴细胞比例呈逐渐减少趋势。T1期较正常对照组明显减少（P＜0.05）；T2期与T1期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T2期较正常对照组明显减少（P＜0.05）；T3期明显少于T2期及T1期（P＜0.05）；T4期明显少于T3期（P＜0.05）。②CTL比例亦呈减少趋势。T1期与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T2期与T1期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T2期明显少于正常对照组（P＜0.05）；T3期明显少于T2期及T1期（P＜0.05）；T4期与T3期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T4期明显低于T2期（P＜0.05）。③B淋巴细胞比例亦呈减少趋势，T1期与正常对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；T2期比T1期明显减少（P＜0.05）；T3期明显少于T2期及T1期（P＜0.05）；T4期明显少于T3期（P＜0.05）。见表 2。
表2
外周血中免疫细胞群的动态变化（n=3，2.1.2 外周血中粒细胞逐渐增多
正常对照组外周血中粒细胞约为所有CD45+炎细胞的16%。随着胰腺癌进展，粒细胞比例逐渐增多。T1期与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T2期明显多于T1期（P＜0.05）；T3期明显多于T2期（P＜0.05）；T4期明显多于T3期（P＜0.05）。见表 2。
2.1.3 外周血中树突细胞、巨噬细胞、NK细胞及NKT细胞先增多后减少
正常对照组外周血中树突细胞、巨噬细胞及NK细胞比例约为所有CD45+炎细胞的5%～10%，NKT细胞仅为所有CD45+炎细胞的1%～2%。树突细胞、巨噬细胞、NK细胞及NKT细胞在胰腺癌发展过程中均呈先增多后减少趋势。①树突细胞在T1期及T2期与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T1期（P＜0.05）；T4期明显少于T3期（P＜0.05）。②巨噬细胞在T1期与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。T2期明显多于正常对照组（P＜0.05）；T3期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T1期（P＜0.05）；T4期明显少于T3期（P＜0.01）。③NK细胞在T1期与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T1期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T2期明显多于正常对照组（P＜0.05）；T3期与T2期差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于正常对照组（P＜0.05）；T4期明显少于T3期（P＜0.05）。④NKT细胞在T1期与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T2期明显多于T1期（P＜0.05）；T3期与T2期、T1期及正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T4期明显少于T3期及T2期（P＜0.05）。见表 2。
2.2 胰腺癌进展过程中肿瘤组织中免疫细胞群的动态变化趋势
2.2.1 肿瘤组织中炎细胞总数逐渐增多
随着胰腺癌进展，肿瘤组织中CD45+炎细胞总数呈逐渐增多趋势。T1与T2期差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T2期（P＜0.05）；T4期明显多于T3期（P＜0.05）。见表 3。
表3
肿瘤组织中免疫细胞群动态变化（n=3，2.2.2 肿瘤组织中淋巴细胞逐渐较少
随着胰腺癌进展，肿瘤组织中T淋巴细胞占所有CD45+炎细胞比例呈减少趋势。①Th淋巴细胞在T2期明显少于T1期（P＜0.01）；T3期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显少于T1期（P＜0.01）；T4期与T3期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T4期明显少于T1期（P＜0.01）。②CTL在T1期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显少于T2期（P＜0.01）；T4期与T3期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T4期与明显少于T2期（P＜0.01）。④B淋巴细胞在肿瘤组织中的变化趋势与外周血中不同，B淋巴细胞在肿瘤组织中占所有CD45+炎细胞比例小于10%，且在肿瘤发展过程中无明显变化（P＞0.05）。见表 3。
2.2.3 肿瘤组织中粒细胞逐渐增多
T1期肿瘤组织中粒细胞约占CD45+炎细胞总数的30%。T4期肿瘤组织中粒细胞约占CD45+炎细胞总数的53%。在肿瘤发展过程中，粒细胞比例呈上升趋势。T1期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T1期（P＜0.05）；T4期明显多于T3期（P＜0.05）。见表 3。
2.2.4 肿瘤组织中树突细胞及巨噬细胞逐渐增多
T1期肿瘤组织中树突细胞约占所有炎细胞的6%，而巨噬细胞约为10%。随着肿瘤进展，树突细胞及巨噬细胞均呈增多趋势。①树突细胞在T1期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T1期（P＜0.05）；T4期明显多于T3期（P＜0.05）。②巨噬细胞在T1期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T1期（P＜0.05）；T4期明显多于T3期（P＜0.05）。见表 3。
2.2.5 肿瘤组织中NK细胞及NKT细胞先增多后减少
T1期胰腺癌组织中NK细胞及NKT细胞极少。随着肿瘤进展，NK细胞及NKT细胞均逐渐增多，在T3期达到高峰，而在T4期又骤然减少。①NK细胞在T1期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T2期（P＜0.05）；T4期明显少于T3期（P＜0.05）。②NKT细胞在T2期明显多于T1期（P＜0.01）；T3期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T1期（P＜0.01）；T4期明显少于T3期（P＜0.01）。见表 3。
3 讨论
胰腺癌微环境中炎细胞扮演重要角色，故深入研究胰腺癌和免疫细胞群相互作用的动态关系具有重要意义[4]。目前尚缺乏对免疫健全小鼠胰腺癌发展过程中各免疫细胞群动态变化的详细描述。
本研究利用C57BL6/J小鼠Panc02同源胰腺癌细胞株建立皮下种植瘤模型，详细描述了各免疫细胞群的动态变化过程，在研究中发现，肿瘤组织中CD45+炎细胞总数与胰腺癌肿瘤负荷呈正向性。但也有文献[5]报道，小细胞肺癌组织中CD45+炎细胞浸润与肿瘤的分化级别有关，分化级别越高肿瘤组织中CD45+炎细胞越多，分化级别越低则CD45+炎细胞越少。尚无文献报道CD45+炎细胞与胰腺癌分化级别的关系，而本研究也仅基于单株胰腺癌细胞系，故其临床意义有待进一步证实。
肿瘤免疫主要以T淋巴细胞介导的细胞免疫为主，然而肿瘤细胞可以通过分泌如转化生长因子-β、血管内皮生长因子、白细胞介素-10等细胞因子诱导产生局部及全身的免疫抑制效应，促进粒细胞异常增生，抑制T淋巴细胞的增殖与活化，最终逃过免疫监视，进而生长转移[6-7]。已有文献[8-12]报道，外周血粒细胞/淋巴细胞比值与胰腺癌、胃癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤预后相关，比值越高预后越差。本研究结果也发现，随着胰腺癌进展外周血粒细胞比例逐渐增多，而Th淋巴细胞、CTL以及B淋巴细胞比例均逐渐减少。与外周血变化趋势一致，随着胰腺癌进展，肿瘤组织中粒细胞比例逐渐增多，Th淋巴细胞及CTL逐渐减少。但与外周血变化趋势不同，肿瘤组织中B淋巴细胞占所有CD45+炎细胞比例小于10%，且并不随肿瘤进展而变化。既往认为，肿瘤细胞缺乏刺激B淋巴细胞产生特异性抗体的能力，故B淋巴细胞在肿瘤免疫中的作用甚微。但近年来有文献报道，肿瘤组织中浸润的B淋巴细胞与肿瘤预后相关。Pavoli等[13]发现，肿瘤组织中浸润的B淋巴细胞可产生针对乳腺癌的特异性抗体。Shi等[14]发现，肿瘤组织边缘B淋巴细胞与肝癌预后呈正相关。Xu等[15]也发现，鼻咽癌患者外周血中B淋巴细胞比例下降提示预后不佳。本研究发现，随着胰腺癌进展，外周血B淋巴细胞比例明显下降，提示外周血B淋巴细胞与胰腺癌肿瘤负荷有一定的相关性。但随着胰腺癌进展，肿瘤组织中B淋巴细胞比例并未有显著变化，原因不明，有待进一步深入探讨。
树突细胞作为最重要的抗原呈递细胞，在肿瘤免疫中发挥重要作用。树突细胞疫苗可以提高胰腺癌的化疗疗效[16-17]。本研究发现，在胰腺癌发展中外周血树突细胞比例增多，但在T4期其比例骤然下降，而在肿瘤组织中树突细胞持续增多，提示胰腺癌可以刺激树突细胞增殖以及诱导其向肿瘤组织中趋化。虽然肿瘤组织中树突细胞持续增多，但我们以前的研究[18]发现，肿瘤组织中树突细胞在肿瘤细胞的诱导下绝大多数处于无能状态，并不能有效呈递肿瘤抗原介导有效的抗肿瘤效应。
固有免疫细胞群增殖活化速度快，通常在肿瘤发生发展早期即可被激活，发挥抗肿瘤效应[19]。本研究结果也发现，在肿瘤发展过程中外周血巨噬细胞、NK细胞及NKT细胞比例迅速增多，但T4期胰腺癌中，由于肿瘤细胞诱导的严重的免疫抑制效应，外周血巨噬细胞、NK细胞及NKT细胞比例又迅速减少。与外周血变化一致，肿瘤组织中NK细胞及NKT细胞先反应性升高，后又骤然下降，而巨噬细胞在肿瘤组织中随胰腺癌进展持续增多。在本研究中T4期胰腺癌组织中巨噬细胞比例甚至超过T淋巴细胞及B淋巴细胞比例总和。T4期外周血巨噬细胞骤然减少，而肿瘤组织中巨噬细胞持续增多，提示肿瘤组织对巨噬细胞具有较强的趋化能力。Deschênes-Simard等[20]也发现，胰腺癌组织中巨噬细胞越多，患者预后越差。近年的研究[21]发现，在肿瘤细胞诱导下巨噬细胞可以由经典的M1型向M2型转变，促进肿瘤生长及转移。NK细胞及NKT细胞也均可在肿瘤诱导下向不同的免疫抑制细胞亚群转化，反而促进肿瘤生长转移[22-23]。故有必要进一步探索不同免疫表型及功能的免疫细胞抑制亚群的动态变化过程。
综上，小鼠胰腺癌进展过程中外周血及肿瘤组织中粒细胞持续增多，T淋巴细胞持续减少，外周血B淋巴细胞持续减少，提示胰腺癌诱导产生全身或局部的免疫抑制效应；而肿瘤组织中B淋巴细胞无明显变化，提示肿瘤诱导的局部免疫抑制效应可能主要通过促进粒细胞增生及抑制T淋巴细胞实现；外周血及肿瘤组织NK及NKT细胞等固有免疫细胞在胰腺癌发展过程中快速增多，提示肿瘤发展早中期可以快速激活固有免疫系统，但由于终末期肿瘤诱发的强烈免疫抑制效应，该些细胞群又骤然减少；外周血树突细胞及巨噬细胞在胰腺癌发展过程中迅速增多，提示胰腺癌发展早中期可激活抗原呈递系统，而T4期胰腺癌外周血中树突细胞及巨噬细胞又骤然减少，而在肿瘤组织中却持续增多，提示晚期肿瘤在诱发免疫抑制效应时，对外周血中树突细胞及巨噬细胞均有较强的趋化能力。肿瘤细胞可以诱导产生不同的肿瘤免疫抑制亚群，故进一步分析在胰腺癌发展过程中各免疫细胞抑制亚群表型及功能变化及机制对于更准确预测胰腺癌患者预后和发现新的治疗靶点具有重要意义。
胰腺癌恶性程度极高，发病率呈上升趋势[1]。多种免疫细胞对胰腺癌的发生发展有重要影响[2-3]。在胰腺癌发生发展过程中，外周血及肿瘤组织中免疫细胞群的详细动态变化趋势尚不清楚。本研究通过皮下接种C57BL6/J小鼠同源Panc02胰腺癌细胞建立种植瘤模型。根据肿瘤大小将其分为T1～T4期，详细了解各免疫细胞群的动态变化过程，为更深入研究胰腺癌的免疫调控过程提供一定的新线索。
1 材料与方法
1.1 实验动物
成年雄性C57BL6/J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，4～6周龄，体质量25～30 g。小鼠胰腺导管腺癌Panc02细胞株由本实验室保种传代。实验动物饲养于SPF级环境。动物实验均通过中国医学科学院北京协和医院动物伦理委员会审查。
1.2 试剂及抗体
抗小鼠单克隆或多克隆荧光标记抗体见表 1。
表1
实验所用抗体
Table1.
List of antibodies
1.3 肿瘤模型建立及分期定义
将1×106个Panc02胰腺癌细胞接种于C57BL6/J小鼠腋下。游标卡尺测量并参考公式“肿瘤体积=1/2长径×短径×短径”计算肿瘤体积。当皮下结节小于50 mm3时，很难明确其是肿瘤结节还是由于注射引起的炎性结节，故将肿瘤体积≥50 mm3定义为成瘤。当肿瘤体积≥1 500 mm3时，肿瘤生长缓慢且荷瘤小鼠开始死亡，将其定义为T4期；然后按肿瘤体积大小平均分期：50 mm3≤T1期＜500 mm3、500 mm3≤T2期＜1 000 mm3、1 000 mm3≤T3期＜1 500 mm3。选用4～6周龄C57BL6/J小鼠作为正常对照组。
1.4 流式细胞染色计数
毛细管经内眦取血后，红细胞裂解液裂解红细胞。获取肿瘤组织后，机械研磨联合胰蛋白酶消化的方法制备单细胞悬液。对组织和细胞行常规流式细胞染色方法染色。利用Accuri C6四通道流式细胞仪（BD，USA）检测各种免疫细胞群荧光标记表面分子表达，包括炎细胞（CD45+）、粒细胞（CD11b+）、辅助T（Th）淋巴细胞（CD3+CD4+）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL，CD3+CD8+）、B淋巴细胞（CD19+）、巨噬细胞（F4/80+）、树突细胞（CD11c+）、自然杀伤（NK）细胞（NKp46+）及NKT细胞（CD3+NK1.1+）。
1.5 统计学方法
采用GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software Inc.）软件进行统计分析。数据采用均数±标准差（
2 结果
2.1 胰腺癌进展过程中外周血中免疫细胞群的动态变化趋势
2.1.1 外周血中淋巴细胞逐渐减少
正常对照组外周血中淋巴细胞占所有CD45+炎细胞比例约为80%。①Th淋巴细胞比例呈逐渐减少趋势。T1期较正常对照组明显减少（P＜0.05）；T2期与T1期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T2期较正常对照组明显减少（P＜0.05）；T3期明显少于T2期及T1期（P＜0.05）；T4期明显少于T3期（P＜0.05）。②CTL比例亦呈减少趋势。T1期与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T2期与T1期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T2期明显少于正常对照组（P＜0.05）；T3期明显少于T2期及T1期（P＜0.05）；T4期与T3期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T4期明显低于T2期（P＜0.05）。③B淋巴细胞比例亦呈减少趋势，T1期与正常对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；T2期比T1期明显减少（P＜0.05）；T3期明显少于T2期及T1期（P＜0.05）；T4期明显少于T3期（P＜0.05）。见表 2。
表2
外周血中免疫细胞群的动态变化（n=3，2.1.2 外周血中粒细胞逐渐增多
正常对照组外周血中粒细胞约为所有CD45+炎细胞的16%。随着胰腺癌进展，粒细胞比例逐渐增多。T1期与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T2期明显多于T1期（P＜0.05）；T3期明显多于T2期（P＜0.05）；T4期明显多于T3期（P＜0.05）。见表 2。
2.1.3 外周血中树突细胞、巨噬细胞、NK细胞及NKT细胞先增多后减少
正常对照组外周血中树突细胞、巨噬细胞及NK细胞比例约为所有CD45+炎细胞的5%～10%，NKT细胞仅为所有CD45+炎细胞的1%～2%。树突细胞、巨噬细胞、NK细胞及NKT细胞在胰腺癌发展过程中均呈先增多后减少趋势。①树突细胞在T1期及T2期与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T1期（P＜0.05）；T4期明显少于T3期（P＜0.05）。②巨噬细胞在T1期与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。T2期明显多于正常对照组（P＜0.05）；T3期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T1期（P＜0.05）；T4期明显少于T3期（P＜0.01）。③NK细胞在T1期与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T1期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T2期明显多于正常对照组（P＜0.05）；T3期与T2期差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于正常对照组（P＜0.05）；T4期明显少于T3期（P＜0.05）。④NKT细胞在T1期与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T2期明显多于T1期（P＜0.05）；T3期与T2期、T1期及正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T4期明显少于T3期及T2期（P＜0.05）。见表 2。
2.2 胰腺癌进展过程中肿瘤组织中免疫细胞群的动态变化趋势
2.2.1 肿瘤组织中炎细胞总数逐渐增多
随着胰腺癌进展，肿瘤组织中CD45+炎细胞总数呈逐渐增多趋势。T1与T2期差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T2期（P＜0.05）；T4期明显多于T3期（P＜0.05）。见表 3。
表3
肿瘤组织中免疫细胞群动态变化（n=3，2.2.2 肿瘤组织中淋巴细胞逐渐较少
随着胰腺癌进展，肿瘤组织中T淋巴细胞占所有CD45+炎细胞比例呈减少趋势。①Th淋巴细胞在T2期明显少于T1期（P＜0.01）；T3期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显少于T1期（P＜0.01）；T4期与T3期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T4期明显少于T1期（P＜0.01）。②CTL在T1期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显少于T2期（P＜0.01）；T4期与T3期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T4期与明显少于T2期（P＜0.01）。④B淋巴细胞在肿瘤组织中的变化趋势与外周血中不同，B淋巴细胞在肿瘤组织中占所有CD45+炎细胞比例小于10%，且在肿瘤发展过程中无明显变化（P＞0.05）。见表 3。
2.2.3 肿瘤组织中粒细胞逐渐增多
T1期肿瘤组织中粒细胞约占CD45+炎细胞总数的30%。T4期肿瘤组织中粒细胞约占CD45+炎细胞总数的53%。在肿瘤发展过程中，粒细胞比例呈上升趋势。T1期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T1期（P＜0.05）；T4期明显多于T3期（P＜0.05）。见表 3。
2.2.4 肿瘤组织中树突细胞及巨噬细胞逐渐增多
T1期肿瘤组织中树突细胞约占所有炎细胞的6%，而巨噬细胞约为10%。随着肿瘤进展，树突细胞及巨噬细胞均呈增多趋势。①树突细胞在T1期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T1期（P＜0.05）；T4期明显多于T3期（P＜0.05）。②巨噬细胞在T1期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T1期（P＜0.05）；T4期明显多于T3期（P＜0.05）。见表 3。
2.2.5 肿瘤组织中NK细胞及NKT细胞先增多后减少
T1期胰腺癌组织中NK细胞及NKT细胞极少。随着肿瘤进展，NK细胞及NKT细胞均逐渐增多，在T3期达到高峰，而在T4期又骤然减少。①NK细胞在T1期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T2期（P＜0.05）；T4期明显少于T3期（P＜0.05）。②NKT细胞在T2期明显多于T1期（P＜0.01）；T3期与T2期比较差异无统计学意义（P＞0.05）；T3期明显多于T1期（P＜0.01）；T4期明显少于T3期（P＜0.01）。见表 3。
3 讨论
胰腺癌微环境中炎细胞扮演重要角色，故深入研究胰腺癌和免疫细胞群相互作用的动态关系具有重要意义[4]。目前尚缺乏对免疫健全小鼠胰腺癌发展过程中各免疫细胞群动态变化的详细描述。
本研究利用C57BL6/J小鼠Panc02同源胰腺癌细胞株建立皮下种植瘤模型，详细描述了各免疫细胞群的动态变化过程，在研究中发现，肿瘤组织中CD45+炎细胞总数与胰腺癌肿瘤负荷呈正向性。但也有文献[5]报道，小细胞肺癌组织中CD45+炎细胞浸润与肿瘤的分化级别有关，分化级别越高肿瘤组织中CD45+炎细胞越多，分化级别越低则CD45+炎细胞越少。尚无文献报道CD45+炎细胞与胰腺癌分化级别的关系，而本研究也仅基于单株胰腺癌细胞系，故其临床意义有待进一步证实。
肿瘤免疫主要以T淋巴细胞介导的细胞免疫为主，然而肿瘤细胞可以通过分泌如转化生长因子-β、血管内皮生长因子、白细胞介素-10等细胞因子诱导产生局部及全身的免疫抑制效应，促进粒细胞异常增生，抑制T淋巴细胞的增殖与活化，最终逃过免疫监视，进而生长转移[6-7]。已有文献[8-12]报道，外周血粒细胞/淋巴细胞比值与胰腺癌、胃癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤预后相关，比值越高预后越差。本研究结果也发现，随着胰腺癌进展外周血粒细胞比例逐渐增多，而Th淋巴细胞、CTL以及B淋巴细胞比例均逐渐减少。与外周血变化趋势一致，随着胰腺癌进展，肿瘤组织中粒细胞比例逐渐增多，Th淋巴细胞及CTL逐渐减少。但与外周血变化趋势不同，肿瘤组织中B淋巴细胞占所有CD45+炎细胞比例小于10%，且并不随肿瘤进展而变化。既往认为，肿瘤细胞缺乏刺激B淋巴细胞产生特异性抗体的能力，故B淋巴细胞在肿瘤免疫中的作用甚微。但近年来有文献报道，肿瘤组织中浸润的B淋巴细胞与肿瘤预后相关。Pavoli等[13]发现，肿瘤组织中浸润的B淋巴细胞可产生针对乳腺癌的特异性抗体。Shi等[14]发现，肿瘤组织边缘B淋巴细胞与肝癌预后呈正相关。Xu等[15]也发现，鼻咽癌患者外周血中B淋巴细胞比例下降提示预后不佳。本研究发现，随着胰腺癌进展，外周血B淋巴细胞比例明显下降，提示外周血B淋巴细胞与胰腺癌肿瘤负荷有一定的相关性。但随着胰腺癌进展，肿瘤组织中B淋巴细胞比例并未有显著变化，原因不明，有待进一步深入探讨。
树突细胞作为最重要的抗原呈递细胞，在肿瘤免疫中发挥重要作用。树突细胞疫苗可以提高胰腺癌的化疗疗效[16-17]。本研究发现，在胰腺癌发展中外周血树突细胞比例增多，但在T4期其比例骤然下降，而在肿瘤组织中树突细胞持续增多，提示胰腺癌可以刺激树突细胞增殖以及诱导其向肿瘤组织中趋化。虽然肿瘤组织中树突细胞持续增多，但我们以前的研究[18]发现，肿瘤组织中树突细胞在肿瘤细胞的诱导下绝大多数处于无能状态，并不能有效呈递肿瘤抗原介导有效的抗肿瘤效应。
固有免疫细胞群增殖活化速度快，通常在肿瘤发生发展早期即可被激活，发挥抗肿瘤效应[19]。本研究结果也发现，在肿瘤发展过程中外周血巨噬细胞、NK细胞及NKT细胞比例迅速增多，但T4期胰腺癌中，由于肿瘤细胞诱导的严重的免疫抑制效应，外周血巨噬细胞、NK细胞及NKT细胞比例又迅速减少。与外周血变化一致，肿瘤组织中NK细胞及NKT细胞先反应性升高，后又骤然下降，而巨噬细胞在肿瘤组织中随胰腺癌进展持续增多。在本研究中T4期胰腺癌组织中巨噬细胞比例甚至超过T淋巴细胞及B淋巴细胞比例总和。T4期外周血巨噬细胞骤然减少，而肿瘤组织中巨噬细胞持续增多，提示肿瘤组织对巨噬细胞具有较强的趋化能力。Deschênes-Simard等[20]也发现，胰腺癌组织中巨噬细胞越多，患者预后越差。近年的研究[21]发现，在肿瘤细胞诱导下巨噬细胞可以由经典的M1型向M2型转变，促进肿瘤生长及转移。NK细胞及NKT细胞也均可在肿瘤诱导下向不同的免疫抑制细胞亚群转化，反而促进肿瘤生长转移[22-23]。故有必要进一步探索不同免疫表型及功能的免疫细胞抑制亚群的动态变化过程。
综上，小鼠胰腺癌进展过程中外周血及肿瘤组织中粒细胞持续增多，T淋巴细胞持续减少，外周血B淋巴细胞持续减少，提示胰腺癌诱导产生全身或局部的免疫抑制效应；而肿瘤组织中B淋巴细胞无明显变化，提示肿瘤诱导的局部免疫抑制效应可能主要通过促进粒细胞增生及抑制T淋巴细胞实现；外周血及肿瘤组织NK及NKT细胞等固有免疫细胞在胰腺癌发展过程中快速增多，提示肿瘤发展早中期可以快速激活固有免疫系统，但由于终末期肿瘤诱发的强烈免疫抑制效应，该些细胞群又骤然减少；外周血树突细胞及巨噬细胞在胰腺癌发展过程中迅速增多，提示胰腺癌发展早中期可激活抗原呈递系统，而T4期胰腺癌外周血中树突细胞及巨噬细胞又骤然减少，而在肿瘤组织中却持续增多，提示晚期肿瘤在诱发免疫抑制效应时，对外周血中树突细胞及巨噬细胞均有较强的趋化能力。肿瘤细胞可以诱导产生不同的肿瘤免疫抑制亚群，故进一步分析在胰腺癌发展过程中各免疫细胞抑制亚群表型及功能变化及机制对于更准确预测胰腺癌患者预后和发现新的治疗靶点具有重要意义。
