引用本文： 孙孝国, 李力, 王金华. 肝细胞癌术后复发相关机理研究以及潜在治疗药物预测. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(10): 1245-1249. doi: 10.7507/1007-9424.20140298 复制
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是临床上常见的恶性程度极高的一类肝脏肿瘤，发病率以肝炎病毒流行的亚洲最高，近年来在欧美的发病率也不断攀升，每年因HCC致死者达66万[1-5]。目前，外科手术切除可以有效延长患者的生存期，然而大约66%的患者会在术后几年之内复发[6-7]。因此，在HCC尚未出现复发转移之前，及早的预测、诊断，并及时采取有效的措施进行防治就成为能否进一步提高HCC治疗效果的关键。尽管基因芯片技术及新一代测序技术的应用，已经帮助我们揭示了很多与HCC术后复发相关的分子以及调控关系，不过其中大部分结果对临床实践的指导意义有限。因此，如何将这些发现应用于临床实践仍需要探索。此外，由于HCC复杂的基因异质性和小样本量的患者数目都使得对HCC术后复发机理的研究进展缓慢。
本研究通过分析35例HCC术后2年内复发患者及41例未复发患者的基因表达谱数据，挖掘与HCC术后复发相关的基因及其分子机理；通过基因本体论（gene ontology，GO）与生物学通路（pathway）富集分析，发现一些与术后复发相关基因可能涉及的相关生物学功能以及通路，并通过Connectivity Map（cmap）数据库寻找可能对HCC术后复发相关的小分子药物，以期能对HCC患者提供一个新的治疗切入点和潜在的新型治疗药物。
1 资料和方法
1.1 基因表达谱数据以及癌基因数据来源
基因表达谱数据（E-MEXP-84与E-TABM-292）来自欧洲分子生物学实验数据库（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/）。该数据包含76个HCC患者的基因表达谱数据（实验平台：Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133A与Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133B），包括35例术后2年内复发的HCC患者样本数据，41例未复发的HCC患者样本数据[
1.2 数据预处理以及差异表达基因筛选
为了得到HCC术后相关的显著差异表达基因，本研究使用基因表达控制台软件〔gene expression console software（RMA算法）〕对表达谱原始数据进行预处理，然后使用微阵列芯片显著性分析（significant analysis of microarray，SAM）算法筛选差异表达基因（基于EXCEL的SAM软件）。本研究筛选差异表达基因的阈值为：|差异倍数（fold change）|>2，q值<0.05。
1.3 GO与pathway富集分析
为了在分子水平上对HCC术后复发的代谢变化情况进行分析研究，本研究从京都基因与基因组百科全书生物通路数据库（KEGG）与GO数据库（KEGG数据库：http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html；GO数据库：http://geneontology.org/）中获得相关功能分类以及生物学通路数据，然后使用BiNGO软件[
1.4 cmap数据库分析
cmap数据库[12]收集了在各种生物活性小分子活性干预情况下人类细胞全基因组转录表达数据，其中包括6 100组小分子干预实验数据（包括小分子干预组和正常对照组数据）和7 056组基因表达谱。因此，利用Connectivity Map识别和整理体内细胞处于各种状态的基因组“识别标志”（signature），研究人员可以精确地预测一种新颖的治疗性化合物的分子活性，以及得到应用到癌症之类疾病治疗上的新药物的途径，也使得研究一个具体候选药物的研究人员可以将一个识别标志输入到数据库中，来发现该药物可能的新作用。本研究将HCC术后复发相关差异表达基因输入cmap数据库，并且对小分子干预引起的差异表达基因进行了比较分析，以期发现正常细胞中和肝癌细胞中类似的基因表达谱，或者确定小干预分子。其中差异表达基因被分为上调和下调两类。然后我们定义了一个富集值，用来表示cmap数据库中经过小分子干预后的差异表达基因数据与通过基因集富集分析结果之间的近似度，该数值在-1与1之间，该数值越接近1，表明小分子干预结果越能模拟正常细胞中的基因表达情况；该数值越接近-1，则表明小分子干预结果越能模拟肝癌细胞中的基因表达情况。
2 结果
2.1 对不同病理状态下的基因表达差异情况的识别
首先，本研究将76个样本的HCC表达谱芯片数据进行预处理，得到标准化的表达谱数据。而后，为了筛选可能与术后复发相关的基因，本研究应用SAM分析以寻找两组样本间差异表达基因（|差异倍数|>2，P < 0.05）。结果得到316个差异表达基因，这316个基因中有61个基因都属于已知癌基因（超几何分布P=0.034），其已知癌基因来源于癌症基因普查数据库（cancer gene census database）[9]。该结果提示，本研究得到的差异表达基因与肿瘤显著相关。
2.2 差异表达基因的GO与pathway富集分析结果
本研究针对316个差异表达基因，分别应用BiNGO软件[10]中Goslim数据库进行GO功能富集分析和KOBAS软件[11]进行KEGG通路富集分析。结果发现：差异表达基因大多富集到“蛋白绑定”、“信号转导”、“蛋白激酶活性”等GO功能以及“黏着斑信号通路”、“MAPK信号通路”等KEGG通路（表 1）。
表1
差异表达基因富集分析结果（FDR<0.05）
Table1.
Results of gene enrichment analysis of differently expressed genes(FDR < 0.05)
2.3 cmap数据库分析结果
本研究使用基因集富集分析方法对cmap数据库中的差异表达基因进行比较研究，结果获得了9个可能与HCC显著相关的生物活性小分子（P<0.05），其中“富集度”表示小分子与HCC术后复发的相关性，靠近+1表示对HCC术后复发有治疗作用，而靠近-1则表示该小分子有致癌作用。结果见表 2。由表 2可见，一些小分子可能有防治HCC术后复发的功能，如班布特罗（富集值=0.667）和洛伐他汀（富集值=0.658）；同时也发现了一些具有强致癌作用的小分子，如恩波吡维铵（富集值=-0.818）和替卡西林（富集值=-0.846）。
表2
HCC术后复发相关生物活性小分子（cmap数据库）
Table2.
Candidate bioactive small molecules related to postoperative recurrence of HCC(cmap database)
3 讨论
HCC是一种男性易发的常见癌症，其发病率与性别、年龄以及肝脏疾病的持续时间有关。然而无论其病因如何，肝硬变始终是HCC发病的最重要的因素[13]，而长期酗酒是造成肝硬变的重要原因[14-15]；另外，对于慢性乙肝患者而言，黄曲霉素的摄入也是引起HCC的重要因素之一[16]。尽管外科手术已经成为HCC治疗的重要方法，但术后肿瘤复发依旧成为HCC患者临床治疗的重大挑战[17]。
本研究收集35例术后复发与41例术后未复发HCC患者的基因表达谱数据，通过差异基因分析得到316个与HCC术后复发相关的基因，其中大量的基因与肿瘤相关，如昼夜节律蛋白（PER2）、信号传导子、转录激活子（STAT3）以及AKT3都是与肿瘤细胞有关的分子[18-20]。然后，针对这些术后复发相关基因进行功能以及通路富集分析，结果发现：差异表达基因大多富集到“蛋白绑定”、“信号转导”、“蛋白激酶活性”等GO功能以及“黏着斑信号通路”、“MAPK信号通路”等KEGG通路。其相关功能都与HCC的发生发展有重要关系[21]。进一步探讨差异表达基因功能富集分析得到的相关功能与通路，可以发现这些功能都是HCC细胞的一些共性特征。当HCC发生时，细胞最显著的变化发生在细胞膜和细胞核上。另外，细胞内的一些激酶活性、蛋白质结合能力等也发生了改变，而这些分子在细胞信号转导转化中发挥重要作用。所有这些分子引起的变化均与癌症紧密相关，同时有关细胞进程、增殖、凋亡等功能也显著的聚集。KEGG通路富集的结果发现一些与肿瘤转移相关的通路如“黏着斑通路”以及“MAPK信号通路”，HCC细胞中黏着斑通路发生了较大的变化。黏着斑主要起着细胞在基质中的链接作用，在细胞的运动性、增殖和分化中发挥着重要的作用。一些黏着斑是细胞膜表面信号受体和细胞内肌动蛋白纤维的链接机构，甚至直接作为信号分子在例如蛋白激酶、磷酸酶等系统中发挥作用。因此这些通路发生的变化可以直接阻塞细胞中正常的信号转导途径，从而使得肝细胞有序地进入癌变过程。由于信号转导途径被阻塞，许多重要的信号转导通路都发生变化。而MAPK信号通路是细胞内一条重要的信号转导通路，它对基因表达、细胞的增殖、分化和运动起着重要的调节作用。总之，HCC细胞通过黏着斑对细胞内和细胞间的信号转导通路进行影响，从而引起细胞内重要的信号转导通路的非正常表达（MARK信号通路、TGF-beta信号通路和神经营养因子信号通路）。一方面，HCC细胞阻止了人体免疫系统的响应，影响了正常细胞的增殖和凋亡；另一方面，HCC细胞改变了正常细胞的形态和行为特征，引导其转化为癌症细胞从而最终导致HCC的发生。因此，对HCC的临床病例特征及分子机理的研究，以及对不同病理程度的HCC患者的评估和分层诊断，以及对HCC的临床治疗管理都有着很大的帮助。研究中发现的基因集可以作为重要的基因库，为新型诊断和生物治疗标志物的确定和研究提供重要参考，为部分肝切除手术后的HCC患者的临床管理发挥重要作用。
目前，HCC治疗的新药研究相对紧缺。根据差异表达基因的情况以及从cmap数据库中获得的小分子的信息，我们发现一系列的小分子，这些小分子可以在一定程度上模拟与正常细胞相比的HCC细胞的不同状况，这就意味着这些小分子可能具有修复因HCC引起的肝代谢的失调的作用。其中洛伐他汀已被发现对多种癌症具有治疗作用，例如，Martirosyan等[22]研究发现，洛伐他汀有促进卵巢癌细胞的凋亡，并切可以与阿霉素联合用药，达到治疗的效果。Sanli等[23]发现，洛伐他汀可以增加肺癌细胞对电离辐射的敏感性，增强放疗作用。本研究同时也发现了一些具有强致癌作用的小分子，如恩波吡维铵（富集值=-0.818）和替卡西林（富集值=-0.846）。值得一提的是目前有一些报道发现这两种可能的致癌分子反而具有一定的肿瘤治疗作用[24-26]。
总之，本研究通过分析一套HCC术后复发与未复发的全基因组表达谱数据，解析了与复发相关的差异表达基因主要涉及的生物学功能以及通路，同时预测了可能对HCC术后复发具有治疗作用的一些潜在小分子，对防治HCC术后复发具有积极的意义。但这些潜在的小分子是否具有治疗作用且具体治疗靶点以及机理还需要进一步的实验去研究。
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是临床上常见的恶性程度极高的一类肝脏肿瘤，发病率以肝炎病毒流行的亚洲最高，近年来在欧美的发病率也不断攀升，每年因HCC致死者达66万[1-5]。目前，外科手术切除可以有效延长患者的生存期，然而大约66%的患者会在术后几年之内复发[6-7]。因此，在HCC尚未出现复发转移之前，及早的预测、诊断，并及时采取有效的措施进行防治就成为能否进一步提高HCC治疗效果的关键。尽管基因芯片技术及新一代测序技术的应用，已经帮助我们揭示了很多与HCC术后复发相关的分子以及调控关系，不过其中大部分结果对临床实践的指导意义有限。因此，如何将这些发现应用于临床实践仍需要探索。此外，由于HCC复杂的基因异质性和小样本量的患者数目都使得对HCC术后复发机理的研究进展缓慢。
本研究通过分析35例HCC术后2年内复发患者及41例未复发患者的基因表达谱数据，挖掘与HCC术后复发相关的基因及其分子机理；通过基因本体论（gene ontology，GO）与生物学通路（pathway）富集分析，发现一些与术后复发相关基因可能涉及的相关生物学功能以及通路，并通过Connectivity Map（cmap）数据库寻找可能对HCC术后复发相关的小分子药物，以期能对HCC患者提供一个新的治疗切入点和潜在的新型治疗药物。
1 资料和方法
1.1 基因表达谱数据以及癌基因数据来源
基因表达谱数据（E-MEXP-84与E-TABM-292）来自欧洲分子生物学实验数据库（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/）。该数据包含76个HCC患者的基因表达谱数据（实验平台：Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133A与Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133B），包括35例术后2年内复发的HCC患者样本数据，41例未复发的HCC患者样本数据[
1.2 数据预处理以及差异表达基因筛选
为了得到HCC术后相关的显著差异表达基因，本研究使用基因表达控制台软件〔gene expression console software（RMA算法）〕对表达谱原始数据进行预处理，然后使用微阵列芯片显著性分析（significant analysis of microarray，SAM）算法筛选差异表达基因（基于EXCEL的SAM软件）。本研究筛选差异表达基因的阈值为：|差异倍数（fold change）|>2，q值<0.05。
1.3 GO与pathway富集分析
为了在分子水平上对HCC术后复发的代谢变化情况进行分析研究，本研究从京都基因与基因组百科全书生物通路数据库（KEGG）与GO数据库（KEGG数据库：http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html；GO数据库：http://geneontology.org/）中获得相关功能分类以及生物学通路数据，然后使用BiNGO软件[
1.4 cmap数据库分析
cmap数据库[12]收集了在各种生物活性小分子活性干预情况下人类细胞全基因组转录表达数据，其中包括6 100组小分子干预实验数据（包括小分子干预组和正常对照组数据）和7 056组基因表达谱。因此，利用Connectivity Map识别和整理体内细胞处于各种状态的基因组“识别标志”（signature），研究人员可以精确地预测一种新颖的治疗性化合物的分子活性，以及得到应用到癌症之类疾病治疗上的新药物的途径，也使得研究一个具体候选药物的研究人员可以将一个识别标志输入到数据库中，来发现该药物可能的新作用。本研究将HCC术后复发相关差异表达基因输入cmap数据库，并且对小分子干预引起的差异表达基因进行了比较分析，以期发现正常细胞中和肝癌细胞中类似的基因表达谱，或者确定小干预分子。其中差异表达基因被分为上调和下调两类。然后我们定义了一个富集值，用来表示cmap数据库中经过小分子干预后的差异表达基因数据与通过基因集富集分析结果之间的近似度，该数值在-1与1之间，该数值越接近1，表明小分子干预结果越能模拟正常细胞中的基因表达情况；该数值越接近-1，则表明小分子干预结果越能模拟肝癌细胞中的基因表达情况。
2 结果
2.1 对不同病理状态下的基因表达差异情况的识别
首先，本研究将76个样本的HCC表达谱芯片数据进行预处理，得到标准化的表达谱数据。而后，为了筛选可能与术后复发相关的基因，本研究应用SAM分析以寻找两组样本间差异表达基因（|差异倍数|>2，P < 0.05）。结果得到316个差异表达基因，这316个基因中有61个基因都属于已知癌基因（超几何分布P=0.034），其已知癌基因来源于癌症基因普查数据库（cancer gene census database）[9]。该结果提示，本研究得到的差异表达基因与肿瘤显著相关。
2.2 差异表达基因的GO与pathway富集分析结果
本研究针对316个差异表达基因，分别应用BiNGO软件[10]中Goslim数据库进行GO功能富集分析和KOBAS软件[11]进行KEGG通路富集分析。结果发现：差异表达基因大多富集到“蛋白绑定”、“信号转导”、“蛋白激酶活性”等GO功能以及“黏着斑信号通路”、“MAPK信号通路”等KEGG通路（表 1）。
表1
差异表达基因富集分析结果（FDR<0.05）
Table1.
Results of gene enrichment analysis of differently expressed genes(FDR < 0.05)
2.3 cmap数据库分析结果
本研究使用基因集富集分析方法对cmap数据库中的差异表达基因进行比较研究，结果获得了9个可能与HCC显著相关的生物活性小分子（P<0.05），其中“富集度”表示小分子与HCC术后复发的相关性，靠近+1表示对HCC术后复发有治疗作用，而靠近-1则表示该小分子有致癌作用。结果见表 2。由表 2可见，一些小分子可能有防治HCC术后复发的功能，如班布特罗（富集值=0.667）和洛伐他汀（富集值=0.658）；同时也发现了一些具有强致癌作用的小分子，如恩波吡维铵（富集值=-0.818）和替卡西林（富集值=-0.846）。
表2
HCC术后复发相关生物活性小分子（cmap数据库）
Table2.
Candidate bioactive small molecules related to postoperative recurrence of HCC(cmap database)
3 讨论
HCC是一种男性易发的常见癌症，其发病率与性别、年龄以及肝脏疾病的持续时间有关。然而无论其病因如何，肝硬变始终是HCC发病的最重要的因素[13]，而长期酗酒是造成肝硬变的重要原因[14-15]；另外，对于慢性乙肝患者而言，黄曲霉素的摄入也是引起HCC的重要因素之一[16]。尽管外科手术已经成为HCC治疗的重要方法，但术后肿瘤复发依旧成为HCC患者临床治疗的重大挑战[17]。
本研究收集35例术后复发与41例术后未复发HCC患者的基因表达谱数据，通过差异基因分析得到316个与HCC术后复发相关的基因，其中大量的基因与肿瘤相关，如昼夜节律蛋白（PER2）、信号传导子、转录激活子（STAT3）以及AKT3都是与肿瘤细胞有关的分子[18-20]。然后，针对这些术后复发相关基因进行功能以及通路富集分析，结果发现：差异表达基因大多富集到“蛋白绑定”、“信号转导”、“蛋白激酶活性”等GO功能以及“黏着斑信号通路”、“MAPK信号通路”等KEGG通路。其相关功能都与HCC的发生发展有重要关系[21]。进一步探讨差异表达基因功能富集分析得到的相关功能与通路，可以发现这些功能都是HCC细胞的一些共性特征。当HCC发生时，细胞最显著的变化发生在细胞膜和细胞核上。另外，细胞内的一些激酶活性、蛋白质结合能力等也发生了改变，而这些分子在细胞信号转导转化中发挥重要作用。所有这些分子引起的变化均与癌症紧密相关，同时有关细胞进程、增殖、凋亡等功能也显著的聚集。KEGG通路富集的结果发现一些与肿瘤转移相关的通路如“黏着斑通路”以及“MAPK信号通路”，HCC细胞中黏着斑通路发生了较大的变化。黏着斑主要起着细胞在基质中的链接作用，在细胞的运动性、增殖和分化中发挥着重要的作用。一些黏着斑是细胞膜表面信号受体和细胞内肌动蛋白纤维的链接机构，甚至直接作为信号分子在例如蛋白激酶、磷酸酶等系统中发挥作用。因此这些通路发生的变化可以直接阻塞细胞中正常的信号转导途径，从而使得肝细胞有序地进入癌变过程。由于信号转导途径被阻塞，许多重要的信号转导通路都发生变化。而MAPK信号通路是细胞内一条重要的信号转导通路，它对基因表达、细胞的增殖、分化和运动起着重要的调节作用。总之，HCC细胞通过黏着斑对细胞内和细胞间的信号转导通路进行影响，从而引起细胞内重要的信号转导通路的非正常表达（MARK信号通路、TGF-beta信号通路和神经营养因子信号通路）。一方面，HCC细胞阻止了人体免疫系统的响应，影响了正常细胞的增殖和凋亡；另一方面，HCC细胞改变了正常细胞的形态和行为特征，引导其转化为癌症细胞从而最终导致HCC的发生。因此，对HCC的临床病例特征及分子机理的研究，以及对不同病理程度的HCC患者的评估和分层诊断，以及对HCC的临床治疗管理都有着很大的帮助。研究中发现的基因集可以作为重要的基因库，为新型诊断和生物治疗标志物的确定和研究提供重要参考，为部分肝切除手术后的HCC患者的临床管理发挥重要作用。
目前，HCC治疗的新药研究相对紧缺。根据差异表达基因的情况以及从cmap数据库中获得的小分子的信息，我们发现一系列的小分子，这些小分子可以在一定程度上模拟与正常细胞相比的HCC细胞的不同状况，这就意味着这些小分子可能具有修复因HCC引起的肝代谢的失调的作用。其中洛伐他汀已被发现对多种癌症具有治疗作用，例如，Martirosyan等[22]研究发现，洛伐他汀有促进卵巢癌细胞的凋亡，并切可以与阿霉素联合用药，达到治疗的效果。Sanli等[23]发现，洛伐他汀可以增加肺癌细胞对电离辐射的敏感性，增强放疗作用。本研究同时也发现了一些具有强致癌作用的小分子，如恩波吡维铵（富集值=-0.818）和替卡西林（富集值=-0.846）。值得一提的是目前有一些报道发现这两种可能的致癌分子反而具有一定的肿瘤治疗作用[24-26]。
总之，本研究通过分析一套HCC术后复发与未复发的全基因组表达谱数据，解析了与复发相关的差异表达基因主要涉及的生物学功能以及通路，同时预测了可能对HCC术后复发具有治疗作用的一些潜在小分子，对防治HCC术后复发具有积极的意义。但这些潜在的小分子是否具有治疗作用且具体治疗靶点以及机理还需要进一步的实验去研究。
