引用本文： 王涛, 徐睿, 鞠玲燕, 王美红, 徐永波, 祝筱姬, 李坤, 褚海波. 高流体静力压和缺氧对大隐静脉和脾静脉滋养血管超微结构的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(10): 1241-1244. doi: 10.7507/1007-9424.20140297 复制
研究表明，静脉管壁的滋养血管主要分布在外膜和中膜的外层，以纵向排列的滋养血管占居优势[1-2]。静脉高压时，血管壁的滋养血管增多，且扭曲和呈不规则膨胀[3-4]。通过血管铸型技术和精确解剖技术评价大隐静脉滋养血管结构，国外已有报道[3, 5]。前期，我们对高流体静力压下大隐静脉和脾静脉滋养血管的组织形态学进行了对比研究[6]。本研究采用半薄切片定位，通过电镜观察大隐静脉和脾静脉滋养血管内皮细胞的超微结构变化，探讨高流体静力压和缺氧对滋养血管内皮细胞的影响。
1 资料与方法
1.1 标本来源
所有病例均经潍坊医学院人类研究伦理委员会批准。所有选取标本均来自解放军第89医院普通外科2009年6月至2012年6月期间的住院的患者。其中行高位结扎剥脱加旋切治疗的大隐静脉曲张患者20例作为大隐静脉曲张组，男12例，女8例，年龄23～46岁，平均43岁，术前均经彩色多普勒超声检查确诊为原发性大隐静脉曲张，按临床、病因、解剖及病理生理（CEAP）分类选取C2～C3、病程5～8年者。行脾大部切除大网膜胸骨后固定术治疗的门静脉高压症患者14例作为病脾静脉组，男8例，女6例，年龄21～44岁，平均42岁，确诊为乙型肝炎后肝硬变，肝功能Child分级为A、B级，伴有脾功能亢进，病程为5～8年。创伤后下肢行截肢术而大隐静脉无损伤者20例，男14例，女6例，年龄22～45岁，平均40岁；外伤性脾破裂脾静脉无损伤者14例，男9例，女5例，年龄20～43岁，平均39岁，共34例作为对照组。
1.2 主要试剂与仪器
试剂：25%戊二醛溶液水溶液购自上海安谱科学仪器有限公司；环氧丙烷液购自上海欧复实业有限公司；环氧树脂购自南京蓝柯高分子材料有限公司；醋酸铀饱和水溶液购自西安鼎天化工有限公司；枸橼酸铅溶液购自南京森贝伽生物科技有限公司。仪器：超薄切片机（德国徕卡，RM2235型），光学显微镜（日本奥林巴斯，BX51型），透视电子显微镜（日本日立，H-7500型）。
1.3 方法
将获取的大隐静脉和脾静脉标本切取1 mm见方的组织块，1 min内置入戊二醛溶液固定；经1%锇酸后固定，用磷酸盐（PBS）缓冲溶液将多余的锇酸洗净后，梯度乙醇脱水；分别浸入环氧丙烷液30 min、环氧丙烷:环氧树脂（1:1）液2 h、环氧丙烷:环氧树脂（1:2）液1 h和环氧树脂（Epon 812）液2 h，最后用环氧树脂包埋后入45℃烤箱12 h、65℃烤箱48 h。包埋块修整，超薄切片机切片，将0.8μm厚切片转移到载玻片上、烘干。脱环氧树脂、脱碱，HE染色，光镜下观察大隐静脉和脾静脉外膜层滋养血管，半薄切片定位。采用超薄切片，片厚70 nm，切片水洗后放入醋酸铀饱和水溶液浸30 min，双蒸水洗3次各15 min；然后再用枸橼酸铅溶液浸15 min，双蒸水洗3次各15 min。应用日立H-7500型透射电镜观察大隐静脉和脾静脉外膜层滋养血管内皮细胞的超微结构变化并摄片。
2 结果
病脾静脉组：滋养血管内皮细胞细胞核结构完整，染色质分布正常（图 1A）；部分线粒体基质深染，嵴模糊、嵴断裂（图 1B）。脾静脉对照组：滋养血管内皮细胞细胞核结构完整，染色质分布和细胞器形态正常（图 2A、2B）。大隐静脉曲张组：滋养血管内皮细胞细胞核结构完整，染色质分布正常（图 3A）；部分线粒体基质深染，嵴模糊、嵴断裂及髓样变（图 3B）。大隐静脉对照组：滋养血管内皮细胞细胞核结构完整，染色质分布和细胞器形态正常（图 4A、4B）。
图1
示病脾静脉组滋养血管内皮细胞的改变。1A：细胞核（TEM×10 000）；1B：黑箭所示线粒体（TEM×20 000） 图 2 示脾静脉对照组滋养血管内皮细胞的改变。2A：细胞核（TEM×10 000）；2B：黑箭所示线粒体（TEM×30 000） 图 3 示大隐静脉曲张组滋养血管内皮细胞的改变。3A：细胞核（TEM×10 000）；3B：黑箭所示线粒体（TEM×20 000） 图 4 示大隐静脉对照组滋养血管内皮细胞的改变。4A：细胞核（TEM×10 000）；4B：黑箭所示线粒体（TEM×30 000）。EC：内皮细胞；N：细胞核；Ery：红细胞
Figure1.
The changes of endothelial cell in vasa vasorum of diseased splenic veins group. 1A:Nucleus (TEM×10 000);1B:Black arrow mean mitochondria (TEM×20 000) Figuer 2 The changes of endothelial cell in vasa vasorum of splenic vein group. 2A:Nucleus (TEM×10 000);2B:Black arrow mean mitochondria (TEM×30 000) Figuer 3 The changes of endothelial cell in vasa vasorum of varicose greater saphenous veins group. 3A:Nucleus (TEM×10 000);3B:Black arrow mean mitochondria (TEM×20 000) Figuer 4 The changes of endothelial cell in vasa vasorum of greater saphenous veins group. 4A:Nucleus (TEM×10 000); 4 B:Black arrow mean mitochondria (TEM×10 000). EC:Endothelial cell; N:Nucleus; Ery:Erythrocyte
3 讨论
关于大隐静脉滋养血管的研究目前主要聚焦在两方面：一是慢性功能不全静脉滋养血管，二是移植大隐静脉滋养血管[7]。研究发现，一方面，组织缺氧可诱发血管壁滋养血管增多，血管增生是一种退化和功能不全血管壁的营养与保护性反应[8-9]；另一方面，新生血管形成与白细胞募集、局部炎性因子产生及血管壁易变性增加有关[10]。滋养血管的变化还与交感神经调节、平滑肌增生及局部凝血平衡相关[11]。保护好外膜完整的滋养血管，可增加静脉内皮的完整性，维持内皮一氧化氮合酶活性和血管舒缩性及抗凝血活性[12-14]。一般而言，通常采用血管铸型微CT或扫描电镜观察血管壁滋养血管的立体分布。电镜下发现大隐静脉滋养血管沿主干管壁平行纵轴分布，静脉数量常多于动脉[15-16]。Lametschwandtner等[2]扫描电镜观察，滋养血管呈圆形收缩状或结状、外翻。当血流压力升高时，滋养血管会产生膨胀与伸展，但不会影响滋养血管功能。Kachlik等[1]通过血管铸型电镜测量滋养血管直径，发现动脉滋养血管直径为11.6～36.6μm，毛细血管直径为4.7～11.6μm，静脉滋养血管直径为36.6～200.3μm。一组大隐静脉滋养血管电镜观察发现，骨骼化大隐静脉30 min内出现血管平滑肌细胞分裂和细胞凋亡，而非接触获取（the“no-touch”harvesting technique）大隐静脉滋养血管超微结构改变不明显[17-18]。由此可见，血管外膜是滋养血管发生和代谢的重要部位，滋养血管的开放和增多与血管壁的压力和缺氧关系密切[19-20]。
前期我们的研究[6]发现，高流体静力压和缺氧下大隐静脉和脾静脉管壁滋养血管明显增多，两者血管床存在异质性，脾静脉以数量增多为主，大隐静脉以平均截面积增大为主。本研究发现，大隐静脉曲张组和病脾静脉组滋养血管内皮细胞细胞核结构完整，染色质分布正常；部分线粒体基质深染，嵴模糊、嵴断裂。该结果与我们前期研究[21]的大隐静脉和脾静脉管壁内皮细胞改变有相近之处（内皮表面不光滑，微绒毛增多，吞饮小泡消失，基底膜不完整，细胞核形态不规则，线粒体变性，凹陷增多，胞浆内细胞器减少）。本研究结果提示，曲张静脉和病脾静脉管壁滋养血管内皮细胞超微结构的改变以细胞器的线粒体为主。表明静脉高压和缺氧同样会影响滋养血管内皮的超微结构[22-23]。动物实验[24]也证实，滋养血管的密度与管壁压力和氧张力密切相关。有作者[3]认为，滋养血管增多是血管壁内改善代谢状况的一种继发性血管反应。滋养血管具备新生血管的潜能，这与内皮祖细胞的存在密切相关[25]。
综上所述，高流体静力压和缺氧下大隐静脉和脾静脉管壁滋养血管内皮细胞的超微结构会出现重塑现象，二者改变相同。
致谢：本课题得到潍坊医学院电镜室张圣明教授和吴红娟副教授大力帮助，谨表致谢！
研究表明，静脉管壁的滋养血管主要分布在外膜和中膜的外层，以纵向排列的滋养血管占居优势[1-2]。静脉高压时，血管壁的滋养血管增多，且扭曲和呈不规则膨胀[3-4]。通过血管铸型技术和精确解剖技术评价大隐静脉滋养血管结构，国外已有报道[3, 5]。前期，我们对高流体静力压下大隐静脉和脾静脉滋养血管的组织形态学进行了对比研究[6]。本研究采用半薄切片定位，通过电镜观察大隐静脉和脾静脉滋养血管内皮细胞的超微结构变化，探讨高流体静力压和缺氧对滋养血管内皮细胞的影响。
1 资料与方法
1.1 标本来源
所有病例均经潍坊医学院人类研究伦理委员会批准。所有选取标本均来自解放军第89医院普通外科2009年6月至2012年6月期间的住院的患者。其中行高位结扎剥脱加旋切治疗的大隐静脉曲张患者20例作为大隐静脉曲张组，男12例，女8例，年龄23～46岁，平均43岁，术前均经彩色多普勒超声检查确诊为原发性大隐静脉曲张，按临床、病因、解剖及病理生理（CEAP）分类选取C2～C3、病程5～8年者。行脾大部切除大网膜胸骨后固定术治疗的门静脉高压症患者14例作为病脾静脉组，男8例，女6例，年龄21～44岁，平均42岁，确诊为乙型肝炎后肝硬变，肝功能Child分级为A、B级，伴有脾功能亢进，病程为5～8年。创伤后下肢行截肢术而大隐静脉无损伤者20例，男14例，女6例，年龄22～45岁，平均40岁；外伤性脾破裂脾静脉无损伤者14例，男9例，女5例，年龄20～43岁，平均39岁，共34例作为对照组。
1.2 主要试剂与仪器
试剂：25%戊二醛溶液水溶液购自上海安谱科学仪器有限公司；环氧丙烷液购自上海欧复实业有限公司；环氧树脂购自南京蓝柯高分子材料有限公司；醋酸铀饱和水溶液购自西安鼎天化工有限公司；枸橼酸铅溶液购自南京森贝伽生物科技有限公司。仪器：超薄切片机（德国徕卡，RM2235型），光学显微镜（日本奥林巴斯，BX51型），透视电子显微镜（日本日立，H-7500型）。
1.3 方法
将获取的大隐静脉和脾静脉标本切取1 mm见方的组织块，1 min内置入戊二醛溶液固定；经1%锇酸后固定，用磷酸盐（PBS）缓冲溶液将多余的锇酸洗净后，梯度乙醇脱水；分别浸入环氧丙烷液30 min、环氧丙烷:环氧树脂（1:1）液2 h、环氧丙烷:环氧树脂（1:2）液1 h和环氧树脂（Epon 812）液2 h，最后用环氧树脂包埋后入45℃烤箱12 h、65℃烤箱48 h。包埋块修整，超薄切片机切片，将0.8μm厚切片转移到载玻片上、烘干。脱环氧树脂、脱碱，HE染色，光镜下观察大隐静脉和脾静脉外膜层滋养血管，半薄切片定位。采用超薄切片，片厚70 nm，切片水洗后放入醋酸铀饱和水溶液浸30 min，双蒸水洗3次各15 min；然后再用枸橼酸铅溶液浸15 min，双蒸水洗3次各15 min。应用日立H-7500型透射电镜观察大隐静脉和脾静脉外膜层滋养血管内皮细胞的超微结构变化并摄片。
2 结果
病脾静脉组：滋养血管内皮细胞细胞核结构完整，染色质分布正常（图 1A）；部分线粒体基质深染，嵴模糊、嵴断裂（图 1B）。脾静脉对照组：滋养血管内皮细胞细胞核结构完整，染色质分布和细胞器形态正常（图 2A、2B）。大隐静脉曲张组：滋养血管内皮细胞细胞核结构完整，染色质分布正常（图 3A）；部分线粒体基质深染，嵴模糊、嵴断裂及髓样变（图 3B）。大隐静脉对照组：滋养血管内皮细胞细胞核结构完整，染色质分布和细胞器形态正常（图 4A、4B）。
图1
示病脾静脉组滋养血管内皮细胞的改变。1A：细胞核（TEM×10 000）；1B：黑箭所示线粒体（TEM×20 000） 图 2 示脾静脉对照组滋养血管内皮细胞的改变。2A：细胞核（TEM×10 000）；2B：黑箭所示线粒体（TEM×30 000） 图 3 示大隐静脉曲张组滋养血管内皮细胞的改变。3A：细胞核（TEM×10 000）；3B：黑箭所示线粒体（TEM×20 000） 图 4 示大隐静脉对照组滋养血管内皮细胞的改变。4A：细胞核（TEM×10 000）；4B：黑箭所示线粒体（TEM×30 000）。EC：内皮细胞；N：细胞核；Ery：红细胞
Figure1.
The changes of endothelial cell in vasa vasorum of diseased splenic veins group. 1A:Nucleus (TEM×10 000);1B:Black arrow mean mitochondria (TEM×20 000) Figuer 2 The changes of endothelial cell in vasa vasorum of splenic vein group. 2A:Nucleus (TEM×10 000);2B:Black arrow mean mitochondria (TEM×30 000) Figuer 3 The changes of endothelial cell in vasa vasorum of varicose greater saphenous veins group. 3A:Nucleus (TEM×10 000);3B:Black arrow mean mitochondria (TEM×20 000) Figuer 4 The changes of endothelial cell in vasa vasorum of greater saphenous veins group. 4A:Nucleus (TEM×10 000); 4 B:Black arrow mean mitochondria (TEM×10 000). EC:Endothelial cell; N:Nucleus; Ery:Erythrocyte
3 讨论
关于大隐静脉滋养血管的研究目前主要聚焦在两方面：一是慢性功能不全静脉滋养血管，二是移植大隐静脉滋养血管[7]。研究发现，一方面，组织缺氧可诱发血管壁滋养血管增多，血管增生是一种退化和功能不全血管壁的营养与保护性反应[8-9]；另一方面，新生血管形成与白细胞募集、局部炎性因子产生及血管壁易变性增加有关[10]。滋养血管的变化还与交感神经调节、平滑肌增生及局部凝血平衡相关[11]。保护好外膜完整的滋养血管，可增加静脉内皮的完整性，维持内皮一氧化氮合酶活性和血管舒缩性及抗凝血活性[12-14]。一般而言，通常采用血管铸型微CT或扫描电镜观察血管壁滋养血管的立体分布。电镜下发现大隐静脉滋养血管沿主干管壁平行纵轴分布，静脉数量常多于动脉[15-16]。Lametschwandtner等[2]扫描电镜观察，滋养血管呈圆形收缩状或结状、外翻。当血流压力升高时，滋养血管会产生膨胀与伸展，但不会影响滋养血管功能。Kachlik等[1]通过血管铸型电镜测量滋养血管直径，发现动脉滋养血管直径为11.6～36.6μm，毛细血管直径为4.7～11.6μm，静脉滋养血管直径为36.6～200.3μm。一组大隐静脉滋养血管电镜观察发现，骨骼化大隐静脉30 min内出现血管平滑肌细胞分裂和细胞凋亡，而非接触获取（the“no-touch”harvesting technique）大隐静脉滋养血管超微结构改变不明显[17-18]。由此可见，血管外膜是滋养血管发生和代谢的重要部位，滋养血管的开放和增多与血管壁的压力和缺氧关系密切[19-20]。
前期我们的研究[6]发现，高流体静力压和缺氧下大隐静脉和脾静脉管壁滋养血管明显增多，两者血管床存在异质性，脾静脉以数量增多为主，大隐静脉以平均截面积增大为主。本研究发现，大隐静脉曲张组和病脾静脉组滋养血管内皮细胞细胞核结构完整，染色质分布正常；部分线粒体基质深染，嵴模糊、嵴断裂。该结果与我们前期研究[21]的大隐静脉和脾静脉管壁内皮细胞改变有相近之处（内皮表面不光滑，微绒毛增多，吞饮小泡消失，基底膜不完整，细胞核形态不规则，线粒体变性，凹陷增多，胞浆内细胞器减少）。本研究结果提示，曲张静脉和病脾静脉管壁滋养血管内皮细胞超微结构的改变以细胞器的线粒体为主。表明静脉高压和缺氧同样会影响滋养血管内皮的超微结构[22-23]。动物实验[24]也证实，滋养血管的密度与管壁压力和氧张力密切相关。有作者[3]认为，滋养血管增多是血管壁内改善代谢状况的一种继发性血管反应。滋养血管具备新生血管的潜能，这与内皮祖细胞的存在密切相关[25]。
综上所述，高流体静力压和缺氧下大隐静脉和脾静脉管壁滋养血管内皮细胞的超微结构会出现重塑现象，二者改变相同。
致谢：本课题得到潍坊医学院电镜室张圣明教授和吴红娟副教授大力帮助，谨表致谢！
