引用本文： 孙英冬, 周勇, 王勇, 刘金钢. Ghrelin提高L6大鼠成肌细胞胰岛素敏感性及其机理. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(7): 816-821. doi: 10.7507/1007-9424.20140195 复制
Ghrelin是一种由28个氨基酸组成的小分子活性肽，主要由胃底的X/A样细胞分泌，Ghrelin在体内有3种形式存在：Ghrelin（n-octanoyl-Ghrelin、acy-lated Ghrelin及Ghrelin，AG）、非酰化Ghrelin（unacy-lated Ghrelin、des-Ghrelin及UAG）和瘦素（obestatin，Ob）[1-2]，Ghrelin可在肠道、胰腺、肾脏、性腺、胎盘、下丘脑、垂体等组织中表达，发挥相应的生物学功能[3]。有研究[1-2, 4]表明，Ghrelin除了促进生长激素释放、增加食欲外，还与胰岛素、瘦素等外周信号共同影响能量平衡和糖代谢，与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病等关系密切。骨骼肌是人体胰岛素作用的主要靶组织，胰岛素刺激下的机体葡萄糖摄取约有80%是由骨骼肌完成的，机体胰岛素敏感性极大地依赖于骨骼肌葡萄糖摄取量[5]。本研究通过体外培养L6大鼠成肌细胞，利用棕榈酸建立胰岛素抵抗模型，观察Ghrelin是否影响L6大鼠成肌细胞胰岛素刺激下的葡萄糖代谢，并讨论其与磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β（PI3K/Akt/GSK-3β）信号通路的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
L6大鼠成肌细胞株购于武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清、高糖DMEM培养液及胰酶购于北京久峰润达生物技术有限公司；Ghrelin购于北京晨博生物科技有限公司；葡萄糖测定试剂盒购于上海荣盛生物药业有限公司；BCA定量试剂盒和PI3K阻断剂（LY294002）购于碧云天生物技术研究所；胎牛胰岛素、棕榈酸、抗磷酸化总蛋白激酶B（Akt）兔抗体（Ser473）及抗磷酸化糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）兔抗体（Ser9）购于美国Sigma-Aldrich生物技术公司；抗总Akt兔抗体和抗总GSK-3β兔抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；山羊抗兔二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司；抗GLUT-4兔抗体购于美国Santa Cruz生物技术公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
将复苏后的L6大鼠成肌细胞接种在培养瓶中，在5% CO2、37℃饱和湿度条件下，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液孵育，经4～5 d细胞生长至70%～80%融合时，换为含2%胎牛血清的高糖DMEM培养液进行诱导分化，每隔2 d换液，直至细胞生长出肌管。实验分为对照组、棕榈酸组、胰岛素组、棕榈酸＋胰岛素组（该组即为胰岛素抵抗组）及实验组。棕榈酸组、胰岛素组及棕榈酸＋胰岛素组实为制作胰岛素抵抗模型过程，按实验要求分别加入棕榈酸及胰岛素。实验组则向培养瓶中加入含有0.3 mmol/L的棕榈酸无血清DMEM培养液孵育16 h，然后分别加入1、10及100 nmol/L的Ghrelin孵育8 h，并于提取上清液前30 min加100 nmol/L胰岛素孵育30 min。对照组则加入等量蒸馏水。
1.2.2 检测葡萄糖摄取
用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法（GOD-POD）检测各组上清液中残余葡萄糖浓度，将试剂R1和R2等量混匀配制成工作液，取200μL工作液加入96孔板，同时设立空白孔和标准孔，加样后37℃水浴30 min，在490 nm处测定各孔的吸光度值（A值）。测定孔与标准孔A值的比值即为上清液残存的葡萄糖浓度，以此计算各组L6大鼠成肌细胞葡萄糖摄取量。
1.2.3 荧光共聚焦显微镜下观察细胞膜GLUT-4染色情况
取棕榈酸＋胰岛素组和100 nmol/L Ghrelin组细胞，弃上清液后用PBS冲洗细胞3次。以4%多聚甲醛在室温固定细胞20 min，后用PBS冲洗3次。0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）于室温透化作用10 min，PBS冲洗3次后，加入抗Glut-4兔抗体（1:500稀释）室温下孵育2 h。PBS冲洗一抗3次，每次浸泡5 min，以异硫氰酸荧光素结合二抗（1:200稀释）于室温下避光孵育1 h。PBS冲洗3次，于荧光共聚焦显微镜下观察并拍摄图片。
1.2.4 免疫印迹（Western blot）法检测Akt、pAkt、GSK-3β及pGSK-3β蛋白表达水平
取各组待测细胞弃上清液后以PBS冲洗3次，用细胞刮收集细胞于Eppendorf管中，4℃、1 000 r/min离心5 min（r=42 mm）后，弃上清PBS。于冰上用含磷酸酶抑制剂（phosphatase inhibitor，PI）和苯甲基磺酰氟丝氨酸蛋白酶抑制剂（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的细胞组织快速裂解液（RIPA）裂解细胞15 min，用1 mL注射器反复抽吸10次，4℃、14 000 r/min（r=42 mm）离心30 min。取上清，以BCA试剂盒测定蛋白浓度，再与裂解缓冲液（5×Lysis buffer）按1:4比例混合后，100℃加热震荡5 min，使蛋白变性。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE；浓缩胶5%，电压80 V；分离胶10%，电压120 V）分离蛋白样品（每孔上样55μg）后，再依照Marker切取Akt和GSK-3β相应的蛋白条带，再湿转2 h到二氟化树脂（PVDF）膜上。上述含有相应蛋白条带的PVDF膜经5%胎牛血清封闭2 h后，分别用抗总Akt兔抗体（1:200稀释）、抗磷酸化Akt兔抗体（Ser473，1:1 000稀释）、抗总GSK-3β兔抗体（1:200稀释）或抗磷酸化GSK-3β兔抗体（Ser9，1:1 000稀释）在4℃条件下孵育PVDF膜过夜。次日PVDF膜复温30 min，后以1×三羟甲基氨基甲烷-氯化钠-吐温20三者的混合物（TBST）清洗PVDF膜3次，每次10 min。二抗使用偶联过氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG（1:6 000稀释）室温孵育2 h。1×TBST洗膜3次，方法同前。最后蛋白条带用增强化学发光底物检测试剂盒检测后，曝光，应用NIHImage J软件分析定量，即可分别检测Akt及GSK-3β蛋白磷酸化表达水平。
1.2.5 PI3K阻断剂LY294002作用后葡萄糖摄取及Akt、pAkt、GSK-3β和pGSK-3β蛋白表达水平的检测
在100 nmol/L Ghrelin与骨骼肌细胞作用前30 min加入PI3K阻断剂LY294002，其终浓度为10μmol/L，然后按1.2.2和1.2.4项的方法分别检测葡萄糖摄取及Akt、pAkt，GSK-3β和pGSK-3β蛋白的表达。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件包进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 各组L6大鼠成肌细胞葡萄糖摄取量检测结果
胰岛素组葡萄糖摄取量高于对照组，是后者的1.699倍（P＜0.05）；棕榈酸＋胰岛素组（胰岛素抵抗模型）葡萄糖摄取量低于胰岛素组，是后者的35.6%（P＜0.05）。而在Ghrelin的作用下，各Ghrelin浓度组葡萄糖摄取量均有所提高，且呈浓度依赖型，与棕榈酸＋胰岛素组比较，其中1、10和100 nmol/L Ghrelin组葡萄糖摄取量分别提高了29.7%（P=0.057）、35.3%（P＜0.05）和100.1%（P＜0.01），见表 1。该结果提示，Ghrelin可改善胰岛素抵抗L6大鼠成肌细胞的葡萄糖摄取。
表1
各组上清液中葡萄糖浓度及细胞的葡萄糖摄取量检测结果（2.2 2组L6大鼠成肌细胞GLUT-4膜蛋白表达检测结果
利用荧光抗体标记2组细胞膜GLUT-4蛋白，共聚焦显微镜下观察GLUT-4蛋白荧光显色变化。结果100 nmol/L Ghrelin处理组细胞膜上GLUT-4荧光染色较棕榈酸＋胰岛素组（胰岛素抵抗组）明显加深（图 1）。该结果提示，Ghrelin可增加胰岛素抵抗L6大鼠成肌细胞GLUT-4膜蛋白的表达。
图1
示共聚焦显微镜下观察细胞膜GLUT-4蛋白染色情况（免疫荧光染色×400）。1A：胰岛素抵抗组；1B：100 nmol/L Ghrelin处理组
Figure1.
GLUT-4 protein staining on cell membrane under confocal microscopy (Immunofluorescence staining×400). 1A: Insulin resistance group; 1B: 100 nmol/L Ghrelin group
2.3 各组L6大鼠成肌细胞Akt及GSK-3β蛋白磷酸化水平检测结果
胰岛素组pAkt蛋白的表达明显高于对照组（P＜0.05），而棕榈酸处理后，胰岛素刺激下的pAkt蛋白表达明显降低（P＜0.05），而经100 nmol/L的Ghrelin作用后，pAkt蛋白的表达有所上升（P＜0.05），见图 2；pGSK-3β蛋白的表达也呈相同趋势（图 3）。各组细胞总Akt及总GSK-3β蛋白的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。该结果提示，Ghrelin可增加胰岛素抵抗L6大鼠成肌细胞pAkt及pGSK-3β蛋白的表达。
图2
示各组细胞pAkt蛋白表达检测结果。2A：电泳结果；2B：定量结果；1：对照组；2：胰岛素组；3：胰岛素抵抗组；4：Ghrelin组 图 3 示各组细胞pGSK-3β蛋白表达检测结果。3A：电泳结果；3B：定量结果；1：对照组；2：胰岛素组；3：胰岛素抵抗组；4：Ghrelin组 图 4 示PI3K阻断剂作用后pAkt蛋白表达检测结果。4A：电泳结果；4B：定量结果；1：Ghrelin组；2：PI3K阻断剂组 图 5 示PI3K阻断剂作用后pGSK-3β蛋白表达检测结果。4A：电泳结果；4B：定量结果；1：Ghrelin组；2：PI3K阻断剂组
Figure2.
Expression results of pAkt protein of cells in each group. 2A: Electrophoresis results; 2B: Quantitative results; 1: Control group; 2: Insulin group; 3: Insulin-resistant group; 4: Ghrelin group Figure 3 Expression results of pGSK-3βprotein of cells in each group. 2A: Electrophoresis results; 2B: Quantitative results; 1: Control group; 2: Insulin group; 3: Insulin-resistant group; 4: Ghrelin group Figure 4 Expression results of pAkt protein after PI3K blocking in two groups. 4A: Electrophoresis results; 4B: Quantitative results; 1: Ghrelin group; 2: PI3K inhibitor group Figure 5 Expression results of pGSK-3βprotein after PI3K blocking in two groups. 4A: Electrophoresis results; 4B: Quantitative results; 1: Ghrelin group; 2: PI3K inhibitor group
2.4 PI3K阻断剂对Ghrelin改善葡萄糖摄取的影响
于100 nmol/L Ghrelin作用前30 min加入PI3K阻断剂LY294002 10μmol/L，胰岛素作用30 min后，PI3K阻断剂组细胞的葡萄糖摄取量为（2.748±0.168）×10-6 mol，较Ghrelin组的（4.539±0.161）×10-6 mol降低了39.5%（P＜0.05），减弱了Ghrelin对细胞葡萄糖摄取的改善作用。经免疫印迹法检测，PI3K阻断剂组细胞的pAkt及pGSK-3β蛋白表达水平均较Ghrelin组明显下降（P＜0.05），见图 4及图 5。
3 讨论
Ghrelin是在外周组织中有丰富表达的小分子脑肠肽，是生长激素促分泌物受体（GHS-R）的内源性配体[4]。GHS-R属于G蛋白偶联受体，可分为GHS-R1α和GHS-R1β两个亚型。其中GHS-R1α广泛存在于周围及中枢组织中，是GHS-R发挥生物学功能的主要形式，而GHS-R1β则不介导生物学效应[6]。Ghrelin通过与GHS-R1α相结合而发挥生物学作用[7-8]，包括促进生长激素GH释放和参与调节摄食行为。有研究发现[5, 9-11]，Ghrelin与改善外周组织糖代谢和保护胰岛细胞功能密切相关，而且存在很大争议。
2型糖尿病已成为威胁国人健康的第一大疾病，且近期有年轻化趋势。在我国20岁以上的人群中，糖尿病男女的患病率分别达10.6%和8.8%，总体糖尿病患病率为9.7% [12]，形势十分严峻。2型糖尿病是由环境、基因及内分泌因素引起的一种病理状态，其发病原因和确切机理尚不完全清楚，但周围组织胰岛素抵抗是2型糖尿病发生和发展的重要病理生理基础[13]。因此，有效改善机体胰岛素抵抗状态，对降低2型糖尿病的发病率，采取有效的防治措施具有重要意义。
骨骼肌是人体胰岛素作用的主要靶组织，胰岛素刺激下的机体葡萄糖摄取约有80%是由骨骼肌完成的，机体胰岛素敏感性极大地依赖于骨骼肌葡萄糖摄取量[14-16]。有研究阐述，造成骨骼肌胰岛素抵抗的主要原因是线粒体功能的丧失[17]和膜蛋白表达受抑制[5, 18]。在体内，胰岛素主要通过胰岛素受体底物（IRS-1）/ PI3K）/ Akt途径促进葡萄糖转运。Akt属丝氨酸/苏氨酸激酶家族，是PI3K信号通路下游受体蛋白激酶的主要靶点，Akt由PI3K激活后其结构发生变化，导致其两个调节位点Thr308和Ser-473磷酸化，在多数情况下，Ser-473位点磷酸化水平可以代表Akt的磷酸化程度[19]，Akt、GSK-3β和葡萄糖转运因子GLUT-4均为胰岛素信号传导通路中的调节因子。Akt是参与骨骼肌细胞中胰岛素刺激的GLUT-4向质膜转位的重要信号蛋白，它能刺激葡萄糖摄取和GLUT-4转位，调节葡萄糖摄取、糖原合成、糖酵解等胰岛素代谢反应[20-22]。GSK-3是一种广泛存在于真核生物体内的多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，有两种亚型：GSK-3α和GSK-3β，在氨基酸排列顺序上二者有85%的同源性。GSK-3β是糖原合成途径中的关键酶，正常情况下，GSK-3β是有活性的，可通过使糖原合成酶磷酸化失活，抑制糖原合成，导致血糖升高[9]。GSK-3β为Akt的直接底物，活化的Akt可使GSK-3β的Ser9位点磷酸化，导致GSK-3β失活，糖原合成增加[23]，此过程依赖Akt的参与[24]。因此，PI3K、Akt和GSK-3β形成骨骼肌中胰岛素调节糖原合成的信号级联系统中一个重要通路。本研究中，经棕榈酸处理的L6大鼠成肌细胞，其胰岛素敏感性明显降低，细胞处于胰岛素抵抗状态。细胞经Ghrelin处理后，pAkt表达增加，进而增加pGSK-3β表达，抑制GSK-3β活性，促进糖原合成，最终使GLUT-4从细胞质转位到细胞膜表面，将葡萄糖转入细胞内。GLUT-4的膜表达增加，细胞葡萄糖摄取量也有所提高，细胞胰岛素抵抗得以改善。而在PI3K阻断剂存在时，这种改善作用消失。
综上所述，棕榈酸可引起骨骼肌细胞胰岛素信号通路缺陷，造成胰岛素抵抗，而Ghrelin通过PI3K/ Akt/GSK-3β通路缓解L6大鼠成肌细胞胰岛素抵抗。本研究也为改善2型糖尿病患者周围组织胰岛素抵抗状态提供新的思路。而非酰化Ghrelin和瘦素也是Ghrelin在机体存在的重要形式[25]，其与Ghrelin之间有何相互作用，有待进一步研究证实。
Ghrelin是一种由28个氨基酸组成的小分子活性肽，主要由胃底的X/A样细胞分泌，Ghrelin在体内有3种形式存在：Ghrelin（n-octanoyl-Ghrelin、acy-lated Ghrelin及Ghrelin，AG）、非酰化Ghrelin（unacy-lated Ghrelin、des-Ghrelin及UAG）和瘦素（obestatin，Ob）[1-2]，Ghrelin可在肠道、胰腺、肾脏、性腺、胎盘、下丘脑、垂体等组织中表达，发挥相应的生物学功能[3]。有研究[1-2, 4]表明，Ghrelin除了促进生长激素释放、增加食欲外，还与胰岛素、瘦素等外周信号共同影响能量平衡和糖代谢，与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病等关系密切。骨骼肌是人体胰岛素作用的主要靶组织，胰岛素刺激下的机体葡萄糖摄取约有80%是由骨骼肌完成的，机体胰岛素敏感性极大地依赖于骨骼肌葡萄糖摄取量[5]。本研究通过体外培养L6大鼠成肌细胞，利用棕榈酸建立胰岛素抵抗模型，观察Ghrelin是否影响L6大鼠成肌细胞胰岛素刺激下的葡萄糖代谢，并讨论其与磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β（PI3K/Akt/GSK-3β）信号通路的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
L6大鼠成肌细胞株购于武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清、高糖DMEM培养液及胰酶购于北京久峰润达生物技术有限公司；Ghrelin购于北京晨博生物科技有限公司；葡萄糖测定试剂盒购于上海荣盛生物药业有限公司；BCA定量试剂盒和PI3K阻断剂（LY294002）购于碧云天生物技术研究所；胎牛胰岛素、棕榈酸、抗磷酸化总蛋白激酶B（Akt）兔抗体（Ser473）及抗磷酸化糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）兔抗体（Ser9）购于美国Sigma-Aldrich生物技术公司；抗总Akt兔抗体和抗总GSK-3β兔抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；山羊抗兔二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司；抗GLUT-4兔抗体购于美国Santa Cruz生物技术公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
将复苏后的L6大鼠成肌细胞接种在培养瓶中，在5% CO2、37℃饱和湿度条件下，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液孵育，经4～5 d细胞生长至70%～80%融合时，换为含2%胎牛血清的高糖DMEM培养液进行诱导分化，每隔2 d换液，直至细胞生长出肌管。实验分为对照组、棕榈酸组、胰岛素组、棕榈酸＋胰岛素组（该组即为胰岛素抵抗组）及实验组。棕榈酸组、胰岛素组及棕榈酸＋胰岛素组实为制作胰岛素抵抗模型过程，按实验要求分别加入棕榈酸及胰岛素。实验组则向培养瓶中加入含有0.3 mmol/L的棕榈酸无血清DMEM培养液孵育16 h，然后分别加入1、10及100 nmol/L的Ghrelin孵育8 h，并于提取上清液前30 min加100 nmol/L胰岛素孵育30 min。对照组则加入等量蒸馏水。
1.2.2 检测葡萄糖摄取
用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法（GOD-POD）检测各组上清液中残余葡萄糖浓度，将试剂R1和R2等量混匀配制成工作液，取200μL工作液加入96孔板，同时设立空白孔和标准孔，加样后37℃水浴30 min，在490 nm处测定各孔的吸光度值（A值）。测定孔与标准孔A值的比值即为上清液残存的葡萄糖浓度，以此计算各组L6大鼠成肌细胞葡萄糖摄取量。
1.2.3 荧光共聚焦显微镜下观察细胞膜GLUT-4染色情况
取棕榈酸＋胰岛素组和100 nmol/L Ghrelin组细胞，弃上清液后用PBS冲洗细胞3次。以4%多聚甲醛在室温固定细胞20 min，后用PBS冲洗3次。0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）于室温透化作用10 min，PBS冲洗3次后，加入抗Glut-4兔抗体（1:500稀释）室温下孵育2 h。PBS冲洗一抗3次，每次浸泡5 min，以异硫氰酸荧光素结合二抗（1:200稀释）于室温下避光孵育1 h。PBS冲洗3次，于荧光共聚焦显微镜下观察并拍摄图片。
1.2.4 免疫印迹（Western blot）法检测Akt、pAkt、GSK-3β及pGSK-3β蛋白表达水平
取各组待测细胞弃上清液后以PBS冲洗3次，用细胞刮收集细胞于Eppendorf管中，4℃、1 000 r/min离心5 min（r=42 mm）后，弃上清PBS。于冰上用含磷酸酶抑制剂（phosphatase inhibitor，PI）和苯甲基磺酰氟丝氨酸蛋白酶抑制剂（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的细胞组织快速裂解液（RIPA）裂解细胞15 min，用1 mL注射器反复抽吸10次，4℃、14 000 r/min（r=42 mm）离心30 min。取上清，以BCA试剂盒测定蛋白浓度，再与裂解缓冲液（5×Lysis buffer）按1:4比例混合后，100℃加热震荡5 min，使蛋白变性。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE；浓缩胶5%，电压80 V；分离胶10%，电压120 V）分离蛋白样品（每孔上样55μg）后，再依照Marker切取Akt和GSK-3β相应的蛋白条带，再湿转2 h到二氟化树脂（PVDF）膜上。上述含有相应蛋白条带的PVDF膜经5%胎牛血清封闭2 h后，分别用抗总Akt兔抗体（1:200稀释）、抗磷酸化Akt兔抗体（Ser473，1:1 000稀释）、抗总GSK-3β兔抗体（1:200稀释）或抗磷酸化GSK-3β兔抗体（Ser9，1:1 000稀释）在4℃条件下孵育PVDF膜过夜。次日PVDF膜复温30 min，后以1×三羟甲基氨基甲烷-氯化钠-吐温20三者的混合物（TBST）清洗PVDF膜3次，每次10 min。二抗使用偶联过氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG（1:6 000稀释）室温孵育2 h。1×TBST洗膜3次，方法同前。最后蛋白条带用增强化学发光底物检测试剂盒检测后，曝光，应用NIHImage J软件分析定量，即可分别检测Akt及GSK-3β蛋白磷酸化表达水平。
1.2.5 PI3K阻断剂LY294002作用后葡萄糖摄取及Akt、pAkt、GSK-3β和pGSK-3β蛋白表达水平的检测
在100 nmol/L Ghrelin与骨骼肌细胞作用前30 min加入PI3K阻断剂LY294002，其终浓度为10μmol/L，然后按1.2.2和1.2.4项的方法分别检测葡萄糖摄取及Akt、pAkt，GSK-3β和pGSK-3β蛋白的表达。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件包进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 各组L6大鼠成肌细胞葡萄糖摄取量检测结果
胰岛素组葡萄糖摄取量高于对照组，是后者的1.699倍（P＜0.05）；棕榈酸＋胰岛素组（胰岛素抵抗模型）葡萄糖摄取量低于胰岛素组，是后者的35.6%（P＜0.05）。而在Ghrelin的作用下，各Ghrelin浓度组葡萄糖摄取量均有所提高，且呈浓度依赖型，与棕榈酸＋胰岛素组比较，其中1、10和100 nmol/L Ghrelin组葡萄糖摄取量分别提高了29.7%（P=0.057）、35.3%（P＜0.05）和100.1%（P＜0.01），见表 1。该结果提示，Ghrelin可改善胰岛素抵抗L6大鼠成肌细胞的葡萄糖摄取。
表1
各组上清液中葡萄糖浓度及细胞的葡萄糖摄取量检测结果（2.2 2组L6大鼠成肌细胞GLUT-4膜蛋白表达检测结果
利用荧光抗体标记2组细胞膜GLUT-4蛋白，共聚焦显微镜下观察GLUT-4蛋白荧光显色变化。结果100 nmol/L Ghrelin处理组细胞膜上GLUT-4荧光染色较棕榈酸＋胰岛素组（胰岛素抵抗组）明显加深（图 1）。该结果提示，Ghrelin可增加胰岛素抵抗L6大鼠成肌细胞GLUT-4膜蛋白的表达。
图1
示共聚焦显微镜下观察细胞膜GLUT-4蛋白染色情况（免疫荧光染色×400）。1A：胰岛素抵抗组；1B：100 nmol/L Ghrelin处理组
Figure1.
GLUT-4 protein staining on cell membrane under confocal microscopy (Immunofluorescence staining×400). 1A: Insulin resistance group; 1B: 100 nmol/L Ghrelin group
2.3 各组L6大鼠成肌细胞Akt及GSK-3β蛋白磷酸化水平检测结果
胰岛素组pAkt蛋白的表达明显高于对照组（P＜0.05），而棕榈酸处理后，胰岛素刺激下的pAkt蛋白表达明显降低（P＜0.05），而经100 nmol/L的Ghrelin作用后，pAkt蛋白的表达有所上升（P＜0.05），见图 2；pGSK-3β蛋白的表达也呈相同趋势（图 3）。各组细胞总Akt及总GSK-3β蛋白的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。该结果提示，Ghrelin可增加胰岛素抵抗L6大鼠成肌细胞pAkt及pGSK-3β蛋白的表达。
图2
示各组细胞pAkt蛋白表达检测结果。2A：电泳结果；2B：定量结果；1：对照组；2：胰岛素组；3：胰岛素抵抗组；4：Ghrelin组 图 3 示各组细胞pGSK-3β蛋白表达检测结果。3A：电泳结果；3B：定量结果；1：对照组；2：胰岛素组；3：胰岛素抵抗组；4：Ghrelin组 图 4 示PI3K阻断剂作用后pAkt蛋白表达检测结果。4A：电泳结果；4B：定量结果；1：Ghrelin组；2：PI3K阻断剂组 图 5 示PI3K阻断剂作用后pGSK-3β蛋白表达检测结果。4A：电泳结果；4B：定量结果；1：Ghrelin组；2：PI3K阻断剂组
Figure2.
Expression results of pAkt protein of cells in each group. 2A: Electrophoresis results; 2B: Quantitative results; 1: Control group; 2: Insulin group; 3: Insulin-resistant group; 4: Ghrelin group Figure 3 Expression results of pGSK-3βprotein of cells in each group. 2A: Electrophoresis results; 2B: Quantitative results; 1: Control group; 2: Insulin group; 3: Insulin-resistant group; 4: Ghrelin group Figure 4 Expression results of pAkt protein after PI3K blocking in two groups. 4A: Electrophoresis results; 4B: Quantitative results; 1: Ghrelin group; 2: PI3K inhibitor group Figure 5 Expression results of pGSK-3βprotein after PI3K blocking in two groups. 4A: Electrophoresis results; 4B: Quantitative results; 1: Ghrelin group; 2: PI3K inhibitor group
2.4 PI3K阻断剂对Ghrelin改善葡萄糖摄取的影响
于100 nmol/L Ghrelin作用前30 min加入PI3K阻断剂LY294002 10μmol/L，胰岛素作用30 min后，PI3K阻断剂组细胞的葡萄糖摄取量为（2.748±0.168）×10-6 mol，较Ghrelin组的（4.539±0.161）×10-6 mol降低了39.5%（P＜0.05），减弱了Ghrelin对细胞葡萄糖摄取的改善作用。经免疫印迹法检测，PI3K阻断剂组细胞的pAkt及pGSK-3β蛋白表达水平均较Ghrelin组明显下降（P＜0.05），见图 4及图 5。
3 讨论
Ghrelin是在外周组织中有丰富表达的小分子脑肠肽，是生长激素促分泌物受体（GHS-R）的内源性配体[4]。GHS-R属于G蛋白偶联受体，可分为GHS-R1α和GHS-R1β两个亚型。其中GHS-R1α广泛存在于周围及中枢组织中，是GHS-R发挥生物学功能的主要形式，而GHS-R1β则不介导生物学效应[6]。Ghrelin通过与GHS-R1α相结合而发挥生物学作用[7-8]，包括促进生长激素GH释放和参与调节摄食行为。有研究发现[5, 9-11]，Ghrelin与改善外周组织糖代谢和保护胰岛细胞功能密切相关，而且存在很大争议。
2型糖尿病已成为威胁国人健康的第一大疾病，且近期有年轻化趋势。在我国20岁以上的人群中，糖尿病男女的患病率分别达10.6%和8.8%，总体糖尿病患病率为9.7% [12]，形势十分严峻。2型糖尿病是由环境、基因及内分泌因素引起的一种病理状态，其发病原因和确切机理尚不完全清楚，但周围组织胰岛素抵抗是2型糖尿病发生和发展的重要病理生理基础[13]。因此，有效改善机体胰岛素抵抗状态，对降低2型糖尿病的发病率，采取有效的防治措施具有重要意义。
骨骼肌是人体胰岛素作用的主要靶组织，胰岛素刺激下的机体葡萄糖摄取约有80%是由骨骼肌完成的，机体胰岛素敏感性极大地依赖于骨骼肌葡萄糖摄取量[14-16]。有研究阐述，造成骨骼肌胰岛素抵抗的主要原因是线粒体功能的丧失[17]和膜蛋白表达受抑制[5, 18]。在体内，胰岛素主要通过胰岛素受体底物（IRS-1）/ PI3K）/ Akt途径促进葡萄糖转运。Akt属丝氨酸/苏氨酸激酶家族，是PI3K信号通路下游受体蛋白激酶的主要靶点，Akt由PI3K激活后其结构发生变化，导致其两个调节位点Thr308和Ser-473磷酸化，在多数情况下，Ser-473位点磷酸化水平可以代表Akt的磷酸化程度[19]，Akt、GSK-3β和葡萄糖转运因子GLUT-4均为胰岛素信号传导通路中的调节因子。Akt是参与骨骼肌细胞中胰岛素刺激的GLUT-4向质膜转位的重要信号蛋白，它能刺激葡萄糖摄取和GLUT-4转位，调节葡萄糖摄取、糖原合成、糖酵解等胰岛素代谢反应[20-22]。GSK-3是一种广泛存在于真核生物体内的多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，有两种亚型：GSK-3α和GSK-3β，在氨基酸排列顺序上二者有85%的同源性。GSK-3β是糖原合成途径中的关键酶，正常情况下，GSK-3β是有活性的，可通过使糖原合成酶磷酸化失活，抑制糖原合成，导致血糖升高[9]。GSK-3β为Akt的直接底物，活化的Akt可使GSK-3β的Ser9位点磷酸化，导致GSK-3β失活，糖原合成增加[23]，此过程依赖Akt的参与[24]。因此，PI3K、Akt和GSK-3β形成骨骼肌中胰岛素调节糖原合成的信号级联系统中一个重要通路。本研究中，经棕榈酸处理的L6大鼠成肌细胞，其胰岛素敏感性明显降低，细胞处于胰岛素抵抗状态。细胞经Ghrelin处理后，pAkt表达增加，进而增加pGSK-3β表达，抑制GSK-3β活性，促进糖原合成，最终使GLUT-4从细胞质转位到细胞膜表面，将葡萄糖转入细胞内。GLUT-4的膜表达增加，细胞葡萄糖摄取量也有所提高，细胞胰岛素抵抗得以改善。而在PI3K阻断剂存在时，这种改善作用消失。
综上所述，棕榈酸可引起骨骼肌细胞胰岛素信号通路缺陷，造成胰岛素抵抗，而Ghrelin通过PI3K/ Akt/GSK-3β通路缓解L6大鼠成肌细胞胰岛素抵抗。本研究也为改善2型糖尿病患者周围组织胰岛素抵抗状态提供新的思路。而非酰化Ghrelin和瘦素也是Ghrelin在机体存在的重要形式[25]，其与Ghrelin之间有何相互作用，有待进一步研究证实。
