引用本文： 钱昌林, 刘骅, 沈志勇, 季福, 蔡端. 运甲状腺素蛋白在胆固醇结石胆囊组织中的表达及其促成核作用研究. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(6): 716-720. doi: 10.7507/1007-9424.20140170 复制
运甲状腺素蛋白（transthyretin，TTR）又名前白蛋白，主要在肝脏细胞中合成。其主要的生理功能是运输甲状腺素和维生素A [1-3]。由于其半衰期很短，仅约1.9 d [4]，因此其血浆浓度测定可用于了解蛋白质营养状况，在评估肝功能不全方面较白蛋白（ALB）和转铁蛋白更具敏感性。TTR与血浆中的视黄醇和视黄醇结合蛋白（retinol binding protein，RBP）形成复合体后，再通过肝脏运输到外周组织。RBP和TTR一般以数量1︰1的比例结合成复合体在血液中循环。有研究[5-6]利用质谱法分析了复合体中2种蛋白质的相互作用，证实每个TTR四聚体最多可以结合两分子RBP。目前认为，多因素综合作用导致胆固醇结石的形成，包括热力学体系失平衡，促、抑成核因子比例失衡及胆道运动功能紊乱[7]。研究[8]表明，胆固醇结石组和正常对照组胆囊胆汁、胆汁微胶粒相和泡相中RBP表达的差异均有统计学意义；且体外模拟胆汁体系实验[9]表明，RBP是一种重要的促成核因子，其加速了胆固醇结晶形成，缩短了成核时间。比较蛋白质组学研究[10]结果提示，TTR在胆固醇结石患者胆囊组织中的表达水平高于正常人群。本实验通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot技术检测了TTR基因及其蛋白在胆固醇结石患者和正常人胆囊组织中的表达；同时在构建不同模拟胆汁体系的基础上，运用Holan成核时间法探讨TTR的促成核效应[11-12]，为探讨胆固醇结石的成因提供实验依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
收集上海交通大学医学院附属仁济医院及复旦大学附属华山医院普外科2010年11月至2012年4月期间施行择期胆囊切除术的25例胆固醇结石患者的胆囊组织（胆固醇结石组）。其中男13例，女12例；年龄35～71岁，中位年龄为53.0岁。所有病例均经B超检查和病理学检查确诊。收集2010年11月至2011年5月期间肝移植供体的9例胆囊组织作为正常对照组（胆囊正常无病变，来自上述2所医院，于肝移植供体等待手术时取出胆囊组织放置于液氮中），其中男7例，女2例；年龄24～45岁，中位年龄为34.5岁。本研究经仁济医院伦理委员会批准。
1.2 主要材料、试剂及设备
1.2.1 主要试剂和材料
胆红素Ⅸa购于Fluka公司，兔抗人TTR单克隆抗体购于Abcam公司，TTR、α1-酸性糖蛋白、胆固醇、卵磷脂、牛磺脱氧胆酸钠及三羟甲基氨基甲烷（Tris）购于Sigma公司，甲醇、依地酸钠、氯仿、叠氮钠及乙醇钠购于上海信帆生物科技公司，RNA提取试剂Trizol和莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）反转录酶购自Promega公司，脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）等试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）购于Millipore公司，医用Kodak X-感光片购自上海西巴斯技术公司，增强化学发光（ECL）试剂盒购自博鑫生物工程公司。
1.2.2 主要仪器
Western blot仪（Mini-PROTEAN®Tetra）为美国Bio-Rad公司产品，光学显微镜（E200）为日本尼康公司产品，RT-PCR仪（CFX96 TouchTM）为德国Biotron公司产品，高速低温离心机（Stratos）为Biofuge公司产品，分光光度计（722N）为上海科学仪器公司产品。
1.3 方法
1.3.1 人工模拟胆汁体系的制备
Small模拟胆汁的制备方法采用改良Kibe法[13]，综合模拟胆汁的制备参考文献[14]的方法（其成分比例见表 1）。
表1
模拟胆汁配置成分比例表（CSI=1.2）
Table1.
The composition of model bile system（CSI=1.2）
1.3.2 RT-PCR法检测TTR基因的表达
①RNA提取及逆转录。取于液氮中保存的2组胆囊组织置入离心管中，加入1.0 mL Trizol液充分匀浆，4 ℃离心10 min（12 000 r/min，r=8 cm）；按1.0 mL RNA rose（异硫氰酸胍）使用200.0 μL的比例加入氯仿，室温放置15 min；4 ℃离心15 min（12 000 r/min，r=8 cm），加入等体积异丙醇，继续4 ℃离心15 min（12 000 r/min，r=8 cm）；小心弃上清液，加入75%乙醇后再4 ℃离心5 min（7 500 r/min，r=8 cm），弃上清，室温静置10 min使RNA沉淀；加入50.0 μL无核酶水溶解RNA。抽提RNA后，测定样品在260 nm和280 nm处的吸光度值（A值），确定RNA的浓度和纯度。A260/A280应在1.8～2.0之间。样本保存于-70 ℃冰箱中。将RNA逆转录为cDNA，逆转录操作按试剂盒说明书进行。②PCR法扩增TTR及磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因。GAPDH基因：上游引物序列为5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物序列为5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′（扩增长度为672 bp）。TTR基因：上游引物序列为5′-GGCTCACCACAGATGAGAAGTTC-3′，下游引物序列为5′-ACAAATGGGAGCTACTGCTTTGGC-3′（扩增长度为269 bp）。引物均由上海康成生物工程公司合成。扩增条件：95 ℃ 5 min热启动；95 ℃30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，扩增30循环；72 ℃保温10 min。扩增反应体系：10×Taq Buffer 5.0 μL，dNTP（10 mmol/L）4.0 μL，上下游引物各1.0 μL，Taq酶0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，最后滴加ddH2O至50.0 μL。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳1～2 h。电泳结束后，紫外线下观察电泳后的凝胶，拍照保存。采用Quantity One软件进行图片分析，以TTR mRNA和GAPDH mRNA灰度值的比值作为TTR mRNA的相对表达量。
1.3.3 Western blot法检测TTR蛋白的表达
将完整的胆囊组织放入等渗生理盐水中浸泡，加入液氮冷冻后研磨至粉末状；加入裂解液完全覆盖研磨粉末，继续超声裂解6～10次，每次5 min；置于冰上3 h后，4 ℃下高速离心（15 000 r/min，r=8 cm）1 h，取其上清液放至离心管中。蛋白定量采用考马斯亮蓝法（Bradford法）[15]。上清液经聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）后转至PVDF膜，以5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗〔兔抗人TTR单克隆抗体（1︰1 000）〕4 ℃过夜后，再加入二抗〔HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体（1︰3 000）〕室温孵育2 h，最后采用ECL法进行化学发光，暗室下行X-感光片曝光、显影、定影并扫描记录。以TTR蛋白和GAPDH的灰度值比值作为TTR蛋白的相对表达量。
1.3.4 成核时间（NT）以及成核活性的测定
取Small模拟胆汁和综合模拟胆汁各分为2组：TTR组和ALB组（对照组），每组4份，每份480.0 μL，37 ℃恒温超速离心0.5 h（45 000 r/min，r=8 cm）后去除结晶碎片，分别加入TTR或ALB（50 μg /份），静置入37 ℃恒温培养箱中培养，每24小时在显微镜下观察胆固醇结晶的析出情况，连续观察21 d。NT采用Holan成核时间法[11]测定，而成核活性则采用Holzbach法[12]计算。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 2组胆囊组织中TTR基因及其蛋白的表达
RT-PCR结果显示，胆固醇结石组TTR mRNA的表达量为1.51±0.78，高于正常对照组的0.85±
0.63（P<0.05）；Western blot结果显示，胆固醇结石组TTR蛋白的表达量为3.95±0.09，高于正常对照组的1.53±0.08（P<0.05），见图 1。
图1
示2组患者胆囊组织中TTR mRNA及其蛋白的电泳结果。1：正常对照组；2：胆固醇结石组；1A：TTR mRNA；1B：TTR蛋白
Figure1.
Electrophoresis results of TTR mRNA and its protein in gallbladder tissues of 2 groups. 1：Normal control group；2：Cholesterol stones group；1A：TTR mRNA；1B：TTR protein
2.2 胆固醇结晶成核时间和成核活性
至21 d时，在Small模拟胆汁体系中，TTR组胆固醇结晶的NT为（14.5±1.3）d，ALB组为（18.0±0.8）d，2组比较差异有统计学意义（P<0.01），TTR组较短；以ALB作比较，可计算出TTR在Small模拟胆汁体系中的成核活性为0.81。在综合模拟胆汁体系中，TTR组胆固醇结晶的NT为（13.5±0.6）d，ALB组为（18.5±1.3）d，2组比较差异有统计学意义（P<0.01），TTR组较短；综合模拟胆汁体系中TTR的成核活性为0.73。该结果表明，TTR有加速胆固醇结晶成核的作用。
2.3 胆固醇成核和结晶过程的形态学观察结果
Small模拟胆汁体系中的胆固醇结晶形成步骤：胆汁泡聚集继而融合形成复合胆汁泡，复合胆汁泡呈散在分布、大小不等，其中央逐渐形成成核，最终导致胆固醇结晶的形成。含ALB的Small模拟胆汁体系在18 d开始形成片状胆固醇结晶；含TTR的Small模拟胆汁体系在9 d开始形成片状结晶，在17 d已形成片状和团簇状结晶（图 2和图 3）。
图2
示含ALB的Small模拟胆汁体系中胆固醇成核和结晶（黑箭）的形态学动态变化（ ×10）。2A：2 d；2B：4 d；2C：18 d；2D：20 d 图 3 示含TTR的Small模拟胆汁体系中胆固醇成核和结晶（黑箭）的形态学动态变化（ ×10）。3A：1 d；3B：3 d；3C：9 d；3D：17 d
Figure2.
Changes of cholesterol nucleation and crystal morphology dynamic （black arrow）in small model bile system which contained ALB （ ×10）. 2A：2 d；2B：4 d；2C：18 d；2D：20 d Figure 3 Changes of cholesterol nucleation and crystal morphology dynamic （black arrow）in small model bile system which contained TTR （ ×10）. 3A：1 d；3B：3 d；3C：9 d；3D：17 d
3 讨论
3.1 TTR的研究现状
TTR主要在肝脏细胞中合成，少部分形成于脑部的脉络丛或由眼底的感光组织合成，其半衰期很短，仅约1.9 d [4]，其生理功能主要是运输甲状腺素和维生素A。其在一般的醋酸纤维素薄膜电泳时不易看到，需用改进的缓冲液和新鲜血清方可见到。研究[16]表明，TTR基因的点突变与家族性淀粉样多发性神经病变密切相关，因为该基因的突变导致相应的蛋白结构出现变化，使得这些原本为水溶性的蛋白变成类淀粉蛋白纤维，在细胞外沉积而致病。这些沉积的纤维性蛋白会集结在脏器、血管、心脏、胃肠道等，特别是集结在周围神经系统而导致不同的症状与病变。通常此类患者血液中的TTR含量较低。
研究[17]表明，血清中TTR表达水平的升高与糖尿病密切相关。Refai等[18]的研究表明，TTR四聚体转化为单聚体过程中，可能会促使胰岛β细胞发生功能障碍，从而导致糖尿病的发生。Sundsten等[19]运用SDS-PAGE电泳和表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF MS）技术分析了正常糖耐量受试者与2型糖尿病患者血清中TTR的表达水平，结果表明，TTR在糖尿病患者中的表达上调。糖尿病与胆固醇结石的发病密切相关，而糖尿病易引起脂肪代谢障碍、内脏自主神经功能紊乱及微血管病变，推测TTR可能诱使胆汁中胆固醇、胆汁酸及磷脂的比例失调而致结石形成。这使我们将焦点集中于研究TTR在结石形成中的作用。
迄今为止（至2013年），鲜有研究报道胆固醇结石形成与TTR的关系。胆固醇结石是多因素作用的结果，其本质是一种代谢紊乱性疾病，其中蛋白及脂类的代谢异常是其主要原因[20-21]。有研究[22]测定了204例胆结石患者血清TTR的表达水平，结果表明，与无肝胆系统及心血管系统疾病的其他疾病患者比较，结石组患者静脉血中TTR的表达水平升高（P<0.01），可能与其参与形成结石构架、加速结石成核和生长有关，提示其是胆结石形成的敏感因素。在人体代谢过程中，TTR与血浆中的视黄醇和RBP形成复合体后，再从肝脏运输到外周组织。RBP与TTR的关系密切，而RBP与糖脂类代谢疾病如胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征均密切相关[23]。研究[8, 23-24]表明，RBP在胆固醇结石患者中的表达水平高于正常人群，胆汁泡相的浓度较微胶粒相升高，在体外模拟胆汁体系中具有促成核活性。
3.2 TTR的促成核作用
本实验通过体外模拟胆汁体系研究了TTR在胆固醇结石形成过程中的促成核作用。Western blot和RT-PCR结果表明胆固醇结石组患者胆囊组织中TTR基因及其蛋白的表达上调。在Small模拟胆汁体系和综合模拟胆汁体系中，TTR组的NT均短于ALB组，其成核活性分别为0.81和0.73，表明TTR能缩短胆固醇结晶的成核时间。此外，本实验还观察到了模拟胆汁体系中的结晶形成步骤：胆汁泡聚集、融合形成复合胆汁泡后，进一步形成胆固醇片状结晶；ALB组在18 d开始形成胆固醇片状结晶，而TTR组在9 d即开始形成片状结晶，在17 d已形成团簇状结晶，初步说明了TTR具有促成核功能。笔者推测，TTR可能经胆囊黏膜分泌到胆汁中，影响胆固醇、胆汁酸及磷脂三者的比例，从而发挥促成核作用，促使胆固醇结石形成。
综上所述，TTR与糖脂类代谢疾病密切相关[25-27]。本实验结果表明，TTR在胆固醇结石患者胆囊组织中的表达上调，且在体外模拟胆汁体系中表现出促成核活性，其可能参与了胆固醇结石的发生和发展过程，但其具体的体内代谢机理有待于进一步深入研究。
运甲状腺素蛋白（transthyretin，TTR）又名前白蛋白，主要在肝脏细胞中合成。其主要的生理功能是运输甲状腺素和维生素A [1-3]。由于其半衰期很短，仅约1.9 d [4]，因此其血浆浓度测定可用于了解蛋白质营养状况，在评估肝功能不全方面较白蛋白（ALB）和转铁蛋白更具敏感性。TTR与血浆中的视黄醇和视黄醇结合蛋白（retinol binding protein，RBP）形成复合体后，再通过肝脏运输到外周组织。RBP和TTR一般以数量1︰1的比例结合成复合体在血液中循环。有研究[5-6]利用质谱法分析了复合体中2种蛋白质的相互作用，证实每个TTR四聚体最多可以结合两分子RBP。目前认为，多因素综合作用导致胆固醇结石的形成，包括热力学体系失平衡，促、抑成核因子比例失衡及胆道运动功能紊乱[7]。研究[8]表明，胆固醇结石组和正常对照组胆囊胆汁、胆汁微胶粒相和泡相中RBP表达的差异均有统计学意义；且体外模拟胆汁体系实验[9]表明，RBP是一种重要的促成核因子，其加速了胆固醇结晶形成，缩短了成核时间。比较蛋白质组学研究[10]结果提示，TTR在胆固醇结石患者胆囊组织中的表达水平高于正常人群。本实验通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot技术检测了TTR基因及其蛋白在胆固醇结石患者和正常人胆囊组织中的表达；同时在构建不同模拟胆汁体系的基础上，运用Holan成核时间法探讨TTR的促成核效应[11-12]，为探讨胆固醇结石的成因提供实验依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
收集上海交通大学医学院附属仁济医院及复旦大学附属华山医院普外科2010年11月至2012年4月期间施行择期胆囊切除术的25例胆固醇结石患者的胆囊组织（胆固醇结石组）。其中男13例，女12例；年龄35～71岁，中位年龄为53.0岁。所有病例均经B超检查和病理学检查确诊。收集2010年11月至2011年5月期间肝移植供体的9例胆囊组织作为正常对照组（胆囊正常无病变，来自上述2所医院，于肝移植供体等待手术时取出胆囊组织放置于液氮中），其中男7例，女2例；年龄24～45岁，中位年龄为34.5岁。本研究经仁济医院伦理委员会批准。
1.2 主要材料、试剂及设备
1.2.1 主要试剂和材料
胆红素Ⅸa购于Fluka公司，兔抗人TTR单克隆抗体购于Abcam公司，TTR、α1-酸性糖蛋白、胆固醇、卵磷脂、牛磺脱氧胆酸钠及三羟甲基氨基甲烷（Tris）购于Sigma公司，甲醇、依地酸钠、氯仿、叠氮钠及乙醇钠购于上海信帆生物科技公司，RNA提取试剂Trizol和莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）反转录酶购自Promega公司，脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）等试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）购于Millipore公司，医用Kodak X-感光片购自上海西巴斯技术公司，增强化学发光（ECL）试剂盒购自博鑫生物工程公司。
1.2.2 主要仪器
Western blot仪（Mini-PROTEAN®Tetra）为美国Bio-Rad公司产品，光学显微镜（E200）为日本尼康公司产品，RT-PCR仪（CFX96 TouchTM）为德国Biotron公司产品，高速低温离心机（Stratos）为Biofuge公司产品，分光光度计（722N）为上海科学仪器公司产品。
1.3 方法
1.3.1 人工模拟胆汁体系的制备
Small模拟胆汁的制备方法采用改良Kibe法[13]，综合模拟胆汁的制备参考文献[14]的方法（其成分比例见表 1）。
表1
模拟胆汁配置成分比例表（CSI=1.2）
Table1.
The composition of model bile system（CSI=1.2）
1.3.2 RT-PCR法检测TTR基因的表达
①RNA提取及逆转录。取于液氮中保存的2组胆囊组织置入离心管中，加入1.0 mL Trizol液充分匀浆，4 ℃离心10 min（12 000 r/min，r=8 cm）；按1.0 mL RNA rose（异硫氰酸胍）使用200.0 μL的比例加入氯仿，室温放置15 min；4 ℃离心15 min（12 000 r/min，r=8 cm），加入等体积异丙醇，继续4 ℃离心15 min（12 000 r/min，r=8 cm）；小心弃上清液，加入75%乙醇后再4 ℃离心5 min（7 500 r/min，r=8 cm），弃上清，室温静置10 min使RNA沉淀；加入50.0 μL无核酶水溶解RNA。抽提RNA后，测定样品在260 nm和280 nm处的吸光度值（A值），确定RNA的浓度和纯度。A260/A280应在1.8～2.0之间。样本保存于-70 ℃冰箱中。将RNA逆转录为cDNA，逆转录操作按试剂盒说明书进行。②PCR法扩增TTR及磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因。GAPDH基因：上游引物序列为5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物序列为5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′（扩增长度为672 bp）。TTR基因：上游引物序列为5′-GGCTCACCACAGATGAGAAGTTC-3′，下游引物序列为5′-ACAAATGGGAGCTACTGCTTTGGC-3′（扩增长度为269 bp）。引物均由上海康成生物工程公司合成。扩增条件：95 ℃ 5 min热启动；95 ℃30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，扩增30循环；72 ℃保温10 min。扩增反应体系：10×Taq Buffer 5.0 μL，dNTP（10 mmol/L）4.0 μL，上下游引物各1.0 μL，Taq酶0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，最后滴加ddH2O至50.0 μL。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳1～2 h。电泳结束后，紫外线下观察电泳后的凝胶，拍照保存。采用Quantity One软件进行图片分析，以TTR mRNA和GAPDH mRNA灰度值的比值作为TTR mRNA的相对表达量。
1.3.3 Western blot法检测TTR蛋白的表达
将完整的胆囊组织放入等渗生理盐水中浸泡，加入液氮冷冻后研磨至粉末状；加入裂解液完全覆盖研磨粉末，继续超声裂解6～10次，每次5 min；置于冰上3 h后，4 ℃下高速离心（15 000 r/min，r=8 cm）1 h，取其上清液放至离心管中。蛋白定量采用考马斯亮蓝法（Bradford法）[15]。上清液经聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）后转至PVDF膜，以5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗〔兔抗人TTR单克隆抗体（1︰1 000）〕4 ℃过夜后，再加入二抗〔HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体（1︰3 000）〕室温孵育2 h，最后采用ECL法进行化学发光，暗室下行X-感光片曝光、显影、定影并扫描记录。以TTR蛋白和GAPDH的灰度值比值作为TTR蛋白的相对表达量。
1.3.4 成核时间（NT）以及成核活性的测定
取Small模拟胆汁和综合模拟胆汁各分为2组：TTR组和ALB组（对照组），每组4份，每份480.0 μL，37 ℃恒温超速离心0.5 h（45 000 r/min，r=8 cm）后去除结晶碎片，分别加入TTR或ALB（50 μg /份），静置入37 ℃恒温培养箱中培养，每24小时在显微镜下观察胆固醇结晶的析出情况，连续观察21 d。NT采用Holan成核时间法[11]测定，而成核活性则采用Holzbach法[12]计算。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 2组胆囊组织中TTR基因及其蛋白的表达
RT-PCR结果显示，胆固醇结石组TTR mRNA的表达量为1.51±0.78，高于正常对照组的0.85±
0.63（P<0.05）；Western blot结果显示，胆固醇结石组TTR蛋白的表达量为3.95±0.09，高于正常对照组的1.53±0.08（P<0.05），见图 1。
图1
示2组患者胆囊组织中TTR mRNA及其蛋白的电泳结果。1：正常对照组；2：胆固醇结石组；1A：TTR mRNA；1B：TTR蛋白
Figure1.
Electrophoresis results of TTR mRNA and its protein in gallbladder tissues of 2 groups. 1：Normal control group；2：Cholesterol stones group；1A：TTR mRNA；1B：TTR protein
2.2 胆固醇结晶成核时间和成核活性
至21 d时，在Small模拟胆汁体系中，TTR组胆固醇结晶的NT为（14.5±1.3）d，ALB组为（18.0±0.8）d，2组比较差异有统计学意义（P<0.01），TTR组较短；以ALB作比较，可计算出TTR在Small模拟胆汁体系中的成核活性为0.81。在综合模拟胆汁体系中，TTR组胆固醇结晶的NT为（13.5±0.6）d，ALB组为（18.5±1.3）d，2组比较差异有统计学意义（P<0.01），TTR组较短；综合模拟胆汁体系中TTR的成核活性为0.73。该结果表明，TTR有加速胆固醇结晶成核的作用。
2.3 胆固醇成核和结晶过程的形态学观察结果
Small模拟胆汁体系中的胆固醇结晶形成步骤：胆汁泡聚集继而融合形成复合胆汁泡，复合胆汁泡呈散在分布、大小不等，其中央逐渐形成成核，最终导致胆固醇结晶的形成。含ALB的Small模拟胆汁体系在18 d开始形成片状胆固醇结晶；含TTR的Small模拟胆汁体系在9 d开始形成片状结晶，在17 d已形成片状和团簇状结晶（图 2和图 3）。
图2
示含ALB的Small模拟胆汁体系中胆固醇成核和结晶（黑箭）的形态学动态变化（ ×10）。2A：2 d；2B：4 d；2C：18 d；2D：20 d 图 3 示含TTR的Small模拟胆汁体系中胆固醇成核和结晶（黑箭）的形态学动态变化（ ×10）。3A：1 d；3B：3 d；3C：9 d；3D：17 d
Figure2.
Changes of cholesterol nucleation and crystal morphology dynamic （black arrow）in small model bile system which contained ALB （ ×10）. 2A：2 d；2B：4 d；2C：18 d；2D：20 d Figure 3 Changes of cholesterol nucleation and crystal morphology dynamic （black arrow）in small model bile system which contained TTR （ ×10）. 3A：1 d；3B：3 d；3C：9 d；3D：17 d
3 讨论
3.1 TTR的研究现状
TTR主要在肝脏细胞中合成，少部分形成于脑部的脉络丛或由眼底的感光组织合成，其半衰期很短，仅约1.9 d [4]，其生理功能主要是运输甲状腺素和维生素A。其在一般的醋酸纤维素薄膜电泳时不易看到，需用改进的缓冲液和新鲜血清方可见到。研究[16]表明，TTR基因的点突变与家族性淀粉样多发性神经病变密切相关，因为该基因的突变导致相应的蛋白结构出现变化，使得这些原本为水溶性的蛋白变成类淀粉蛋白纤维，在细胞外沉积而致病。这些沉积的纤维性蛋白会集结在脏器、血管、心脏、胃肠道等，特别是集结在周围神经系统而导致不同的症状与病变。通常此类患者血液中的TTR含量较低。
研究[17]表明，血清中TTR表达水平的升高与糖尿病密切相关。Refai等[18]的研究表明，TTR四聚体转化为单聚体过程中，可能会促使胰岛β细胞发生功能障碍，从而导致糖尿病的发生。Sundsten等[19]运用SDS-PAGE电泳和表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF MS）技术分析了正常糖耐量受试者与2型糖尿病患者血清中TTR的表达水平，结果表明，TTR在糖尿病患者中的表达上调。糖尿病与胆固醇结石的发病密切相关，而糖尿病易引起脂肪代谢障碍、内脏自主神经功能紊乱及微血管病变，推测TTR可能诱使胆汁中胆固醇、胆汁酸及磷脂的比例失调而致结石形成。这使我们将焦点集中于研究TTR在结石形成中的作用。
迄今为止（至2013年），鲜有研究报道胆固醇结石形成与TTR的关系。胆固醇结石是多因素作用的结果，其本质是一种代谢紊乱性疾病，其中蛋白及脂类的代谢异常是其主要原因[20-21]。有研究[22]测定了204例胆结石患者血清TTR的表达水平，结果表明，与无肝胆系统及心血管系统疾病的其他疾病患者比较，结石组患者静脉血中TTR的表达水平升高（P<0.01），可能与其参与形成结石构架、加速结石成核和生长有关，提示其是胆结石形成的敏感因素。在人体代谢过程中，TTR与血浆中的视黄醇和RBP形成复合体后，再从肝脏运输到外周组织。RBP与TTR的关系密切，而RBP与糖脂类代谢疾病如胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征均密切相关[23]。研究[8, 23-24]表明，RBP在胆固醇结石患者中的表达水平高于正常人群，胆汁泡相的浓度较微胶粒相升高，在体外模拟胆汁体系中具有促成核活性。
3.2 TTR的促成核作用
本实验通过体外模拟胆汁体系研究了TTR在胆固醇结石形成过程中的促成核作用。Western blot和RT-PCR结果表明胆固醇结石组患者胆囊组织中TTR基因及其蛋白的表达上调。在Small模拟胆汁体系和综合模拟胆汁体系中，TTR组的NT均短于ALB组，其成核活性分别为0.81和0.73，表明TTR能缩短胆固醇结晶的成核时间。此外，本实验还观察到了模拟胆汁体系中的结晶形成步骤：胆汁泡聚集、融合形成复合胆汁泡后，进一步形成胆固醇片状结晶；ALB组在18 d开始形成胆固醇片状结晶，而TTR组在9 d即开始形成片状结晶，在17 d已形成团簇状结晶，初步说明了TTR具有促成核功能。笔者推测，TTR可能经胆囊黏膜分泌到胆汁中，影响胆固醇、胆汁酸及磷脂三者的比例，从而发挥促成核作用，促使胆固醇结石形成。
综上所述，TTR与糖脂类代谢疾病密切相关[25-27]。本实验结果表明，TTR在胆固醇结石患者胆囊组织中的表达上调，且在体外模拟胆汁体系中表现出促成核活性，其可能参与了胆固醇结石的发生和发展过程，但其具体的体内代谢机理有待于进一步深入研究。
