引用本文： 孙叶飞, 周建平. 胃癌组织中miR-497表达及其生物学意义. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(5): 609-613. doi: 10.7507/1007-9424.20140146 复制
微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为17～25个核苷酸的小分子非编码RNA，其通过与靶mRNA的3′-UTR互补结合，抑制或降解靶mRNA的翻译来调节基因的表达，miRNA参与肿瘤的增殖、分化、凋亡、组织器官形成等多个病理生理过程[1-2]。研究[3]表明，miRNA的异常表达参与了多种疾病包括肿瘤的发生、发展，因此，miRNA在肿瘤中的研究更成为热点。胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，目前已发现一些在胃癌中异常表达的miRNA，如miR-363、miR-202、miR-145、miR-20a等[4]。而miR-497在肝癌[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]等肿瘤中发挥着抑癌基因的功能，但其在胃癌中的表达及功能尚未有深入研究。本研究采用荧光实时定量PCR法，检测miR-497在胃癌组织以及与其对应的癌旁组织中的表达情况，同时通过miRNA数据库预测miR-497的靶基因，RT-PCR和Western blot对miR-497的靶基因进行验证，对miR-497在胃癌发生、发展中的作用机制进行初步的探索。
1 资料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织
收集2010～2013年期间中国医科大学附属第一医院胃肠外科的标本，均已告知患者并取得患者同意，行外科手术切除的胃癌及癌旁组织标本94例，男43例，女51例；年龄28～81岁，平均61.4岁。所有病例术前均未行放化疗，均经病理诊断证实。获取新鲜组织标本后，肉眼下剔除肿瘤的坏死部分、肌肉和脂肪，用生理盐水冲洗后在液体氮中速冻后移入-80℃冰箱备用。
1.1.2 细胞
人胃癌细胞株SGC-7901来源于中国医科大学细胞生物学实验室，在37℃、50 mL/L CO2孵箱、含10% FBS的Hyclone1640培养基中培养。
1.1.3 引物及主要试剂
由miRBase数据库（http：//microrna.sanger.ac.uk/）查找基因序列，用软件Primer-Express 2.0进行引物设计。miR-497上游引物为5′-ACACTCCAGCTGGGCAGCAGCACACTGTG-3′，下游引物为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG-GCAATTCAGTTGAGACAAACCA-3′；内参U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；BCL2L2上游引物为5′-GTTCAGGGTAAGATTTTATTT-3′，下游引物为5′-GTTCAGTCCTTCTCATTAAAC-3′，上述引物均由金斯瑞公司合成。TRIzol试剂，Invi-trogen公司；miR-497模拟体（mimics）及模拟体阴性对照，吉玛基因有限公司；MTT试剂盒，Sigma公司；蛋白抽提试剂盒，上海卓康生物科技有限公司；BCL2L2抗体，Bio world，美国；GAPDH抗体，碧云天公司；逆转录试剂盒，Takara公司，日本；荧光定量Real-time PCR试剂盒，Takara公司，日本。
1.2 RT-PCR法检测胃癌及癌旁组织和细胞系中mRNA表达
1.2.1 总RNA提取
取约100 mg冰冻新鲜胃癌组织放在盛有液氮的研钵中碾碎，移入放有1 mL TRIzol试剂的平底EP管内。高速匀浆机将组织进一步粉碎。室温放置5 min后，于室温下12 000 r/min（r=6 cm）离心15 min。将上清移至EP管中，加入200μL的氯仿，室温下颠倒混匀5 min。4℃条件下，12 000 r/min（r=6 cm）离心15 min。利用异丙醇沉淀RNA，以75%冰乙醇清洗沉淀。在空气条件下等待沉淀干燥后，DEPC水30μL溶解RNA。紫外分光光度计对提取的总RNA进行纯度和含量鉴定。
1.2.2 逆转录反应
由于miRNA长度仅有20个核苷酸左右，不能用传统的实时RT-PCR检测。逆转录引物需设计成特殊的茎环结构来完成cDNA的生成。引物序列见上述。
1.2.3 miRNA末端序列
室温加样：RNA 2μg，5×miRNA Reaction Buffer 5μL，25 mmol/L MgCl2 2.5μL，Diluted ATP（4 mmol/L）1μL，PolyA末端序列加尾酶0.5μL，DEPC水调体积至25μL。混匀，37℃孵育15 min。
1.2.4 第一链cDNA合成
室温加样：已加PolyA末端序列的RNA 4μL，RT Primer（25μmol/L）3μL，65℃孵育5 min后离心管置冰上1 min。加入2×RT Reaction Mix 10μL，SuperScriptⅢRT/RNase-OUT Enzyme Mix 2μL，DEPC水调至终体积20μL。轻轻混匀。反应条件为：50℃孵育50 min，85℃孵育5 min，反应产物置冰上，储存于-80℃冰箱。
1.2.5 标准样品制备
选用1管高浓度的总RNA标本，逆转为cDNA，以蒸馏水连续10倍稀释成5管，分装后冻存于-80℃冰箱，作为标准品备用。
1.2.6 实时RT-PCR测定成熟miRNA反应体系
2×SYBR Premix Ex Taq 10μL，10μmol/L上游引物0.4μL，10μmol/L下游引物0.4μL，cDNA模板2μL，DEPC水20μL。轻轻混匀，4 000 r/min（r=10 cm）离心3 min，在Bio-Rad IQ5荧光实时定量PCR仪上进行两步法RT-PCR反应。反应参数：94℃30 s，60℃60 s，共进行40个循环。同时设不加模板的反应管作阴性对照。每个样本重复3个平行管。反应结束，溶解曲线确定反应为特异性扩增，通过Bio-Rad IQ5 Comparative quantitation分析程序，以U6 snRNA为内参，分析样本中miRNA的表达。miR-497的绝对表达量采用标准曲线方法计算求得，再将结果进行log10转化。以U6 snRNA为内参，算得miR-497的相对表达量。
1.3 miR-497-mimics及阴性对照转染胃癌SGC-7901细胞系及鉴定转染效果
取对数生长期的SGC-7901细胞消化下来铺入6孔板，每孔2.0×105个细胞培养过夜，按照Lipo-fectamine2000说明书转染终浓度为100 nmol/L的miR-497-mimics或阴性对照。RT-PCR鉴定转染效果。
1.4 Western blot检测转染后胃癌SGC-7901细胞系中BCL2L2蛋白表达情况
用PicTar、TargetScan、miRanda等生物信息学软件预测，发现BCL2L2的3′-UTR区可与miR-497不完全结合。Western blot检测miR-497是否作用于BCL2L2。将转染了miR-497-mimics或阴性对照的胃癌SGC-7901细胞加入蛋白裂解液冰上裂解30 min，4℃16 000×g离心15 min吸取上清。取30μg转染了miR-497-mimics或阴性对照的胃癌SGC-7901细胞总蛋白加入5×SDS上样缓冲液100℃变性5 min，5%浓缩胶、10%分离胶80 V恒压电泳，250 mA恒流转至PVDF膜2 h，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，BCL2L2和GAPDH一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次后ECL发光液显影。
1.5 MTT法检测miR-497-mimics转染后SGC-7901细胞对5-Fu化疗敏感性的改变
取对数生长期的胃癌SGC-7901细胞转染miR-497-mimics及阴性对照后分别加入96孔板中，每孔100μL，1×104个细胞。每组加入5-FU使终浓度分别为1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00μg/mL，每组细胞每个浓度设3个复孔。5% CO2孵箱中培养48 h后，每孔中加入MTT（5 mg/mL）20μL，继续培养4 h弃去培养液，再加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，微量振荡约10 min，于自动酶标仪450 nm处测定各孔吸光度（A）值。根据公式“抑制率=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100%”计算抑制率，再根据抑制率计算半数抑制浓度（IC50）。
1.6 统计学方法
用SPSS 13.0行统计学分析，miR-497在组织中表达结果用均数±标准差表示，在细胞中的表达用中位数表示，用Wilcoxon秩和检验分析miR-497在癌组织和癌旁组织中的差异。Western blot结果采用Graphpad Prism软件进行数据统计分析和作图。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 RT-PCR反应效果及特异性
RT-PCR检测时，样本中miR-497 cDNA呈指数增长扩增达平台期，其扩增曲线为一组典型的S型曲线（图 1A）。溶解曲线中可见溶解温度均一，峰形单一锐利，反映特异性良好，无非特异扩增、引物二聚体及发夹结构的出现（图 1B）。
图1
样本中miR-497 RT-PCR的反应效果。1A：miR-497扩增曲线；1B：miR-497溶解曲线
Figure1.
RT-PCR reaction of miR-497 in samples. 1A:Amplification curves of miR-497;1B:Dissociation curves of miR-497
2.2 胃癌组织中miR-497 mRNA表达结果
结果见图 2。胃癌组织中miR-497 mRNA表达较癌旁组织明显降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。
图2
miR-497在胃癌组织和癌旁组织中的表达结果。与癌旁组织比较，* P < 0.01 图 3 miR-497 mRNA在SGC-7901转染细胞系中的表达结果。1：阴性对照细胞株；2：miR-497-mimics细胞株。与阴性对照细胞株比较，* P < 0.05
Figure2.
Expression of miR-497 in gastric cancer and adjacent to cancer tissues．Compared with adjacent to cancer tissues, * P < 0.01 Figure 3Expression of miR-497 mRNA in transfected SGC-7901 cell line. 1:Negative control cell line; 2:miR-497-mimics cell line. Compared with negative control cell line, * P < 0.05
2.3 RT-PCR法检测SGC-7901细胞中miR-497-mimics及阴性对照转染效率
转染了mimics的SGC-7901细胞中miR-497表达量明显高于转染了阴性对照的SGC-7901细胞，差异有统计学意义（P < 0.05），形成miR-497瞬时转染细胞。见图 3。
2.4 miR-497与靶基因BCL2L2结合降低其表达
为了进一步阐述miR-497在胃癌中的作用机制，我们用生物信息学软件预测，发现BCL2L2的3′-UTR区可与miR-497不完全结合（图 4A）。RT-PCR检测结果见转染miR-497-mimics组与阴性对照组BCL2L2 mRNA表达无明显差别（图 4B）；Western blot结果见BCL2L2蛋白在阴性对照组细胞中表达明显强于miR-497-mimics细胞（图 4C）。
图4
miR-497下游靶基因BCL2L2表达结果。4A：miR-497与BCL2L2 3′-UTR结合位点。4B：阴性对照及miR-497-mimics转染后BCL2L2 mRNA的表达。1：阴性对照细胞株；2：miR-497-mimics细胞株。4C：Western blot检测阴性对照及miR-497-mimics转染后BCL2L2蛋白的表达。1和3：阴性对照；2和4：miR-497-mimics
Figure4.
Expressions of downtream target gene BCL2L2 of miR-497. 4A:Predicted miR-497 binding sites within BCL2L2 3′-UTR. 4B:Expressions of BCL2L2 mRNA in negative control and miR-497-mimics transfected SGC-7901 cell line. 1:negative control cell line; 2:miR-497-mimics cell line.4C:Expression of BCL2L2 protein in negative control and miR-497-mimics transfected SGC-7901 cell line. 1 and 3:negative control cell line; 2 and 4:miR-497-mimics cell line
2.5 SGC-7901细胞转染miR-497-mimics及阴性对照后对5-FU化疗的敏感性
转染miR-497-mimics后的胃癌SGC-7901细胞对5-FU的IC50值为（11.45±0.79）μg/mL，明显低于转染阴性对照后的胃癌SGC-7901细胞的（24.97±1.31）μg/mL，差异有统计学意义（P=0.004 6）。结果提示，miR-497过表达可提高胃癌SGC-7901细胞对5-FU的敏感性。
3 讨论
miRNA是一类具有调控基因表达的小片段非编码RNA，主要通过与靶基因的mRNA 3′-UTR结合，导致靶基因的mRNA被降解或者翻译抑制[8-9]。新近研究[10-11]显示，在大多数哺乳动物中，miRNA与肿瘤发生相关。肿瘤本质上就是一类多基因表达异常的疾病，通过原癌基因的激活和抑癌基因的失活，使细胞逃离正常的生长机制从而导致癌变，多种miRNA在各种肿瘤组织和细胞中的表达水平均有不同程度的上调或下调，提示肿瘤发生与miRNA表达之间有一定的相关性[9, 12]。
miR-497位于人类染色体17p13.1。近来研究[13-14]发现，在结直肠癌及乳腺癌中可通过下调CCNE1抑制肿瘤细胞增殖及转移，在乳腺癌中发现miR-497下调后降低CHEK1的表达，在结直肠癌中可下调胰岛素样生长因子-1受体表达发挥其抑癌作用。在本研究中，RT-PCR检测到胃癌组织相较于癌旁组织中的miR-497表达降低，提示miR-497下调也可能参与了胃癌细胞的始发及演进。
通过PicTar、TargetScan、miRanda等生物信息学软件预测，发现BCL2L2的3′-UTR区可与miR-497不完全结合。BCL2L2是BCL2家族的一分子，与细胞凋亡及细胞生长有关，有可能对肿瘤细胞的迁移和侵袭也有重要作用[15-16]。为了进一步研究二者的关系，我们转染miR-497进入SGC-7901细胞上调它的表达，发现转染miR-497-mimics组的细胞中BCL2L2 mRNA的表达较阴性对照细胞没有变化，而BCL2L2蛋白明显下调，提示miR-497可作用于BCL2L2，抑制BCL2L2 mRNA的翻译而调控蛋白的表达。
临床上胃癌患者术后需5-FU为主的化疗以杀灭残存癌细胞，降低远处转移率及术后复发率，延长生存时间，提高5年生存率[17-18]。但胃癌耐药日益增多，影响化疗效果，如何降低化疗耐药性是胃癌研究的一大热点[19-20]。本研究中，miR-497过表达后，与阴性对照组相比，IC50值下调，化疗敏感性明显提高。提示miR-497可提高化疗敏感性，但其具体作用机制尚需进一步实验研究。
总之，本研究发现，miR-497在胃癌中的表达降低，可部分降低下游BCL2L2的表达；在细胞水平，发现其过表达可提高胃癌细胞对5-FU化疗的敏感性。这一结果丰富了胃癌相关miRNA理论，为从分子水平理解胃癌的病因、寻找理想的标志物并探索基因治疗提供了有用的靶点。
微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为17～25个核苷酸的小分子非编码RNA，其通过与靶mRNA的3′-UTR互补结合，抑制或降解靶mRNA的翻译来调节基因的表达，miRNA参与肿瘤的增殖、分化、凋亡、组织器官形成等多个病理生理过程[1-2]。研究[3]表明，miRNA的异常表达参与了多种疾病包括肿瘤的发生、发展，因此，miRNA在肿瘤中的研究更成为热点。胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，目前已发现一些在胃癌中异常表达的miRNA，如miR-363、miR-202、miR-145、miR-20a等[4]。而miR-497在肝癌[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]等肿瘤中发挥着抑癌基因的功能，但其在胃癌中的表达及功能尚未有深入研究。本研究采用荧光实时定量PCR法，检测miR-497在胃癌组织以及与其对应的癌旁组织中的表达情况，同时通过miRNA数据库预测miR-497的靶基因，RT-PCR和Western blot对miR-497的靶基因进行验证，对miR-497在胃癌发生、发展中的作用机制进行初步的探索。
1 资料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织
收集2010～2013年期间中国医科大学附属第一医院胃肠外科的标本，均已告知患者并取得患者同意，行外科手术切除的胃癌及癌旁组织标本94例，男43例，女51例；年龄28～81岁，平均61.4岁。所有病例术前均未行放化疗，均经病理诊断证实。获取新鲜组织标本后，肉眼下剔除肿瘤的坏死部分、肌肉和脂肪，用生理盐水冲洗后在液体氮中速冻后移入-80℃冰箱备用。
1.1.2 细胞
人胃癌细胞株SGC-7901来源于中国医科大学细胞生物学实验室，在37℃、50 mL/L CO2孵箱、含10% FBS的Hyclone1640培养基中培养。
1.1.3 引物及主要试剂
由miRBase数据库（http：//microrna.sanger.ac.uk/）查找基因序列，用软件Primer-Express 2.0进行引物设计。miR-497上游引物为5′-ACACTCCAGCTGGGCAGCAGCACACTGTG-3′，下游引物为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG-GCAATTCAGTTGAGACAAACCA-3′；内参U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；BCL2L2上游引物为5′-GTTCAGGGTAAGATTTTATTT-3′，下游引物为5′-GTTCAGTCCTTCTCATTAAAC-3′，上述引物均由金斯瑞公司合成。TRIzol试剂，Invi-trogen公司；miR-497模拟体（mimics）及模拟体阴性对照，吉玛基因有限公司；MTT试剂盒，Sigma公司；蛋白抽提试剂盒，上海卓康生物科技有限公司；BCL2L2抗体，Bio world，美国；GAPDH抗体，碧云天公司；逆转录试剂盒，Takara公司，日本；荧光定量Real-time PCR试剂盒，Takara公司，日本。
1.2 RT-PCR法检测胃癌及癌旁组织和细胞系中mRNA表达
1.2.1 总RNA提取
取约100 mg冰冻新鲜胃癌组织放在盛有液氮的研钵中碾碎，移入放有1 mL TRIzol试剂的平底EP管内。高速匀浆机将组织进一步粉碎。室温放置5 min后，于室温下12 000 r/min（r=6 cm）离心15 min。将上清移至EP管中，加入200μL的氯仿，室温下颠倒混匀5 min。4℃条件下，12 000 r/min（r=6 cm）离心15 min。利用异丙醇沉淀RNA，以75%冰乙醇清洗沉淀。在空气条件下等待沉淀干燥后，DEPC水30μL溶解RNA。紫外分光光度计对提取的总RNA进行纯度和含量鉴定。
1.2.2 逆转录反应
由于miRNA长度仅有20个核苷酸左右，不能用传统的实时RT-PCR检测。逆转录引物需设计成特殊的茎环结构来完成cDNA的生成。引物序列见上述。
1.2.3 miRNA末端序列
室温加样：RNA 2μg，5×miRNA Reaction Buffer 5μL，25 mmol/L MgCl2 2.5μL，Diluted ATP（4 mmol/L）1μL，PolyA末端序列加尾酶0.5μL，DEPC水调体积至25μL。混匀，37℃孵育15 min。
1.2.4 第一链cDNA合成
室温加样：已加PolyA末端序列的RNA 4μL，RT Primer（25μmol/L）3μL，65℃孵育5 min后离心管置冰上1 min。加入2×RT Reaction Mix 10μL，SuperScriptⅢRT/RNase-OUT Enzyme Mix 2μL，DEPC水调至终体积20μL。轻轻混匀。反应条件为：50℃孵育50 min，85℃孵育5 min，反应产物置冰上，储存于-80℃冰箱。
1.2.5 标准样品制备
选用1管高浓度的总RNA标本，逆转为cDNA，以蒸馏水连续10倍稀释成5管，分装后冻存于-80℃冰箱，作为标准品备用。
1.2.6 实时RT-PCR测定成熟miRNA反应体系
2×SYBR Premix Ex Taq 10μL，10μmol/L上游引物0.4μL，10μmol/L下游引物0.4μL，cDNA模板2μL，DEPC水20μL。轻轻混匀，4 000 r/min（r=10 cm）离心3 min，在Bio-Rad IQ5荧光实时定量PCR仪上进行两步法RT-PCR反应。反应参数：94℃30 s，60℃60 s，共进行40个循环。同时设不加模板的反应管作阴性对照。每个样本重复3个平行管。反应结束，溶解曲线确定反应为特异性扩增，通过Bio-Rad IQ5 Comparative quantitation分析程序，以U6 snRNA为内参，分析样本中miRNA的表达。miR-497的绝对表达量采用标准曲线方法计算求得，再将结果进行log10转化。以U6 snRNA为内参，算得miR-497的相对表达量。
1.3 miR-497-mimics及阴性对照转染胃癌SGC-7901细胞系及鉴定转染效果
取对数生长期的SGC-7901细胞消化下来铺入6孔板，每孔2.0×105个细胞培养过夜，按照Lipo-fectamine2000说明书转染终浓度为100 nmol/L的miR-497-mimics或阴性对照。RT-PCR鉴定转染效果。
1.4 Western blot检测转染后胃癌SGC-7901细胞系中BCL2L2蛋白表达情况
用PicTar、TargetScan、miRanda等生物信息学软件预测，发现BCL2L2的3′-UTR区可与miR-497不完全结合。Western blot检测miR-497是否作用于BCL2L2。将转染了miR-497-mimics或阴性对照的胃癌SGC-7901细胞加入蛋白裂解液冰上裂解30 min，4℃16 000×g离心15 min吸取上清。取30μg转染了miR-497-mimics或阴性对照的胃癌SGC-7901细胞总蛋白加入5×SDS上样缓冲液100℃变性5 min，5%浓缩胶、10%分离胶80 V恒压电泳，250 mA恒流转至PVDF膜2 h，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，BCL2L2和GAPDH一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次后ECL发光液显影。
1.5 MTT法检测miR-497-mimics转染后SGC-7901细胞对5-Fu化疗敏感性的改变
取对数生长期的胃癌SGC-7901细胞转染miR-497-mimics及阴性对照后分别加入96孔板中，每孔100μL，1×104个细胞。每组加入5-FU使终浓度分别为1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00μg/mL，每组细胞每个浓度设3个复孔。5% CO2孵箱中培养48 h后，每孔中加入MTT（5 mg/mL）20μL，继续培养4 h弃去培养液，再加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，微量振荡约10 min，于自动酶标仪450 nm处测定各孔吸光度（A）值。根据公式“抑制率=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100%”计算抑制率，再根据抑制率计算半数抑制浓度（IC50）。
1.6 统计学方法
用SPSS 13.0行统计学分析，miR-497在组织中表达结果用均数±标准差表示，在细胞中的表达用中位数表示，用Wilcoxon秩和检验分析miR-497在癌组织和癌旁组织中的差异。Western blot结果采用Graphpad Prism软件进行数据统计分析和作图。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 RT-PCR反应效果及特异性
RT-PCR检测时，样本中miR-497 cDNA呈指数增长扩增达平台期，其扩增曲线为一组典型的S型曲线（图 1A）。溶解曲线中可见溶解温度均一，峰形单一锐利，反映特异性良好，无非特异扩增、引物二聚体及发夹结构的出现（图 1B）。
图1
样本中miR-497 RT-PCR的反应效果。1A：miR-497扩增曲线；1B：miR-497溶解曲线
Figure1.
RT-PCR reaction of miR-497 in samples. 1A:Amplification curves of miR-497;1B:Dissociation curves of miR-497
2.2 胃癌组织中miR-497 mRNA表达结果
结果见图 2。胃癌组织中miR-497 mRNA表达较癌旁组织明显降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。
图2
miR-497在胃癌组织和癌旁组织中的表达结果。与癌旁组织比较，* P < 0.01 图 3 miR-497 mRNA在SGC-7901转染细胞系中的表达结果。1：阴性对照细胞株；2：miR-497-mimics细胞株。与阴性对照细胞株比较，* P < 0.05
Figure2.
Expression of miR-497 in gastric cancer and adjacent to cancer tissues．Compared with adjacent to cancer tissues, * P < 0.01 Figure 3Expression of miR-497 mRNA in transfected SGC-7901 cell line. 1:Negative control cell line; 2:miR-497-mimics cell line. Compared with negative control cell line, * P < 0.05
2.3 RT-PCR法检测SGC-7901细胞中miR-497-mimics及阴性对照转染效率
转染了mimics的SGC-7901细胞中miR-497表达量明显高于转染了阴性对照的SGC-7901细胞，差异有统计学意义（P < 0.05），形成miR-497瞬时转染细胞。见图 3。
2.4 miR-497与靶基因BCL2L2结合降低其表达
为了进一步阐述miR-497在胃癌中的作用机制，我们用生物信息学软件预测，发现BCL2L2的3′-UTR区可与miR-497不完全结合（图 4A）。RT-PCR检测结果见转染miR-497-mimics组与阴性对照组BCL2L2 mRNA表达无明显差别（图 4B）；Western blot结果见BCL2L2蛋白在阴性对照组细胞中表达明显强于miR-497-mimics细胞（图 4C）。
图4
miR-497下游靶基因BCL2L2表达结果。4A：miR-497与BCL2L2 3′-UTR结合位点。4B：阴性对照及miR-497-mimics转染后BCL2L2 mRNA的表达。1：阴性对照细胞株；2：miR-497-mimics细胞株。4C：Western blot检测阴性对照及miR-497-mimics转染后BCL2L2蛋白的表达。1和3：阴性对照；2和4：miR-497-mimics
Figure4.
Expressions of downtream target gene BCL2L2 of miR-497. 4A:Predicted miR-497 binding sites within BCL2L2 3′-UTR. 4B:Expressions of BCL2L2 mRNA in negative control and miR-497-mimics transfected SGC-7901 cell line. 1:negative control cell line; 2:miR-497-mimics cell line.4C:Expression of BCL2L2 protein in negative control and miR-497-mimics transfected SGC-7901 cell line. 1 and 3:negative control cell line; 2 and 4:miR-497-mimics cell line
2.5 SGC-7901细胞转染miR-497-mimics及阴性对照后对5-FU化疗的敏感性
转染miR-497-mimics后的胃癌SGC-7901细胞对5-FU的IC50值为（11.45±0.79）μg/mL，明显低于转染阴性对照后的胃癌SGC-7901细胞的（24.97±1.31）μg/mL，差异有统计学意义（P=0.004 6）。结果提示，miR-497过表达可提高胃癌SGC-7901细胞对5-FU的敏感性。
3 讨论
miRNA是一类具有调控基因表达的小片段非编码RNA，主要通过与靶基因的mRNA 3′-UTR结合，导致靶基因的mRNA被降解或者翻译抑制[8-9]。新近研究[10-11]显示，在大多数哺乳动物中，miRNA与肿瘤发生相关。肿瘤本质上就是一类多基因表达异常的疾病，通过原癌基因的激活和抑癌基因的失活，使细胞逃离正常的生长机制从而导致癌变，多种miRNA在各种肿瘤组织和细胞中的表达水平均有不同程度的上调或下调，提示肿瘤发生与miRNA表达之间有一定的相关性[9, 12]。
miR-497位于人类染色体17p13.1。近来研究[13-14]发现，在结直肠癌及乳腺癌中可通过下调CCNE1抑制肿瘤细胞增殖及转移，在乳腺癌中发现miR-497下调后降低CHEK1的表达，在结直肠癌中可下调胰岛素样生长因子-1受体表达发挥其抑癌作用。在本研究中，RT-PCR检测到胃癌组织相较于癌旁组织中的miR-497表达降低，提示miR-497下调也可能参与了胃癌细胞的始发及演进。
通过PicTar、TargetScan、miRanda等生物信息学软件预测，发现BCL2L2的3′-UTR区可与miR-497不完全结合。BCL2L2是BCL2家族的一分子，与细胞凋亡及细胞生长有关，有可能对肿瘤细胞的迁移和侵袭也有重要作用[15-16]。为了进一步研究二者的关系，我们转染miR-497进入SGC-7901细胞上调它的表达，发现转染miR-497-mimics组的细胞中BCL2L2 mRNA的表达较阴性对照细胞没有变化，而BCL2L2蛋白明显下调，提示miR-497可作用于BCL2L2，抑制BCL2L2 mRNA的翻译而调控蛋白的表达。
临床上胃癌患者术后需5-FU为主的化疗以杀灭残存癌细胞，降低远处转移率及术后复发率，延长生存时间，提高5年生存率[17-18]。但胃癌耐药日益增多，影响化疗效果，如何降低化疗耐药性是胃癌研究的一大热点[19-20]。本研究中，miR-497过表达后，与阴性对照组相比，IC50值下调，化疗敏感性明显提高。提示miR-497可提高化疗敏感性，但其具体作用机制尚需进一步实验研究。
总之，本研究发现，miR-497在胃癌中的表达降低，可部分降低下游BCL2L2的表达；在细胞水平，发现其过表达可提高胃癌细胞对5-FU化疗的敏感性。这一结果丰富了胃癌相关miRNA理论，为从分子水平理解胃癌的病因、寻找理想的标志物并探索基因治疗提供了有用的靶点。
