引用本文： 沈宏, 赵冬雨, 张宁. 修复基因XRCC1 Arg194Trp位点多态性与结直肠癌易感性的相关性分析. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(4): 476-478. doi: 10.7507/1007-9424.20140114 复制
近年来，我国结直肠癌的发病率逐年上升，居常见恶性肿瘤发病率的第5位[1]。对结直肠癌的病因至今尚未完全清楚，大多数学者[2-3]认为，除饮食因素、慢性炎症刺激外，遗传因素也起着重要的作用。X射线交叉互补修复基因1（XRCC1）是一种重要的DNA损伤修复基因，包括3个常见的多态性位点，Arg339Gln、Arg280His和Arg194Trp。其多态性改变可能影响XRCC1蛋白的正常功能，从而降低DNA的修复能力，影响肿瘤的易感性和生物学行为[4]。目前针对Arg339Gln位点与结直肠癌的易感性关系已有部分研究[5-6]，而Arg194Trp位点多态性与结直肠癌的易感性关系相关文献报道较少。本研究拟采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术对XRCC1 Arg194Trp基因多态性进行检测分析，旨在探讨其与结直肠癌易感性的关系。
1 资料与方法
临床资料
结直肠癌组选择2008年1月至2012年1月期间笔者所在医院的住院患者，共120例，其中男82例，女38例，年龄（65.2±7.8）岁，均经手术后病理学检查证实为结直肠癌。对照组120例，其中男80例，女40例，年龄（64.8±8.2）岁，为自愿的健康体检人员。2组资料采用流行病学病例对照研究方法进行分析。
1.2 主要实验材料、试剂及设备
DNA提取试剂盒购自天津赛尔生物技术有限公司，PCR采用罗氏实时荧光定量PCR仪。
1.3 方法
1.3.1 外周血基因组DNA提取
所有受试对象在知情同意情况下，取外周静脉血2 mL，采用酚/氯仿法[7]提取2组患者外周血DNA。提取出的DNA在紫外线分光光度计（7230G型，上海天普分析仪器有限公司）下读取260 nm和280 nm处的吸光度值（A值）以鉴定其纯度和浓度。用无菌EP管分装，-80°保存。
1.3.2 多态性位点引物设计
根据XRCC1 Arg-194Trp位点对应的基因序列，采用Primer 5.0软件设计PCR扩增引物，上游引物为5′-GCCAGGGCC-CCTCCTFCAA-3′，下游引物为5′-TACCCTCAGA-CCCACGAGT-3′（购自天津赛尔生物技术有限公司）。
1.3.3 PCR反应体系及反应条件程序
PCR反应体系25μL，取2～10 ng基因组DNA，每种引物0.4μmol/mL，10×PCR缓冲液2.7μL，1.5 mmol/mL MgCl2，1.5 U Tag酶，100μmol/mL dNTP，采用Bio-Rad热循环仪（EF4577型，上海电威贸易有限公司）。反应条件为94℃预变性4 min，94℃变性40 s，63℃复性55 s，72℃延伸40 s，35个循环，最后再72℃延伸7 min。
1.3.4 限制性酶切
酶切反应体系为20μL，其中PCR产物5μL，10×PCR缓冲液3.5μL，限制性内切酶MspI（MBI）5 U，37℃水浴过夜。酶切产物于2％琼脂糖凝胶电泳（电压120 V，30 min），根据电泳条带数判断基因型。
1.4 统计学方法
使用SPSS 16.0软件处理数据。采用Mann-Whitney检验比较2组观察对象之间年龄分布差异；比值比（odds ratios，OR）及其95%可信区间（confidence intervals，CI）表示相对风险度。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 2组观察对象的基本特征
结直肠癌组与对照组相比，2组观察对象在年龄、性别、吸烟、饮酒、饮食特点等常见暴露因素方面比较其差异均无统计学意义（P > 0.05），具有可比性（表 1）。
表1
结直肠癌组与对照组的一般资料比较
2.2 2组观察对象XRCC1基因194位点基因型分布情况
结直肠癌组患者XRCC1基因194位点Arg/Arg、Arg/Trp及Trp/Trp多态基因型出现频率分别为70.00%、25.83%和4.17%，对照组出现频率分别为75.83%、20.83%和3.34%；结直肠癌组和对照组的变异基因型Arg/Trp＋Trp/Trp出现频率分别为30.00%和24.17%。2组间多态基因型和变异基因型出现频率比较其差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
表2
2组的XRCC1 194位点基因型分布情况〔例（%）〕
3 讨论
结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，近20年来，结直肠癌的发病率逐年增高，发病年龄趋于老龄化。其好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，约占60% [8]。结直肠癌的病因至今尚未完全清楚，而有研究[9]报道，高脂和低纤维饮食与其发生有着密切的关系；慢性炎症刺激也是一重要的影响因素。此外，直肠息肉也被认为是一种结直肠癌的癌前病变[10-11]。近年来，更多的学者开始关注遗传因素与结直肠癌发生的相关性。有研究[12]发现，在结直肠癌患者家族中，约25%有癌肿家族史。因此，基因的多态性必然在癌症的发生过程中起着一定的作用。
XRCC1是一种参与DNA损伤修复的重要基因，目前研究[4, 13]发现，XRCC1基因主要存在3个常见的多态性位点，它们分别是第10外显子G28152A（Arg399Gln）、第9外显子C27466A（Arg280His）及第6外显子C26304T（Arg194Trp）；且已有研究[5, 14-15]发现XRCC1与多种癌症的发生存在着相关性，如乳腺癌、食管癌、结直肠癌等。国外研究[16-17]报道，Arg339Gln位点多态性与结直肠癌的易感性有显著的相关性。但Arg194Trp位点多态性与结直肠癌的易感性关系相关文献报道较少。本研究结果发现，在结直肠癌组，Arg194Trp变异基因型出现的频率与对照组相比其差异并无统计学意义。该结果提示，Arg194Trp位点多态性与结直肠癌的易感性无显著相关性。但因纳入的样本量有限，这一结果并不能说明整个地区、中国及亚洲人群的整体情况。此外，不同人种的基因多态性也存在着一定差异。
总之，XRCC1作为一种DNA损伤修复基因，其多态性与多种肿瘤的发生存在相关性。XRCC1的3种不同位点基因多态性与结直肠癌易感性关系仍存在很大争议。本研究结果发现，XRCC1 Arg194Trp位点基因多态性与结直肠癌易感性并不存在显著相关性，然而非随机抽样、有限的样本量及肿瘤诱发因素的多样性均会影响结果的准确性与代表性，因此尚需大样本高质量研究来验证这一结果。
近年来，我国结直肠癌的发病率逐年上升，居常见恶性肿瘤发病率的第5位[1]。对结直肠癌的病因至今尚未完全清楚，大多数学者[2-3]认为，除饮食因素、慢性炎症刺激外，遗传因素也起着重要的作用。X射线交叉互补修复基因1（XRCC1）是一种重要的DNA损伤修复基因，包括3个常见的多态性位点，Arg339Gln、Arg280His和Arg194Trp。其多态性改变可能影响XRCC1蛋白的正常功能，从而降低DNA的修复能力，影响肿瘤的易感性和生物学行为[4]。目前针对Arg339Gln位点与结直肠癌的易感性关系已有部分研究[5-6]，而Arg194Trp位点多态性与结直肠癌的易感性关系相关文献报道较少。本研究拟采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术对XRCC1 Arg194Trp基因多态性进行检测分析，旨在探讨其与结直肠癌易感性的关系。
1 资料与方法
临床资料
结直肠癌组选择2008年1月至2012年1月期间笔者所在医院的住院患者，共120例，其中男82例，女38例，年龄（65.2±7.8）岁，均经手术后病理学检查证实为结直肠癌。对照组120例，其中男80例，女40例，年龄（64.8±8.2）岁，为自愿的健康体检人员。2组资料采用流行病学病例对照研究方法进行分析。
1.2 主要实验材料、试剂及设备
DNA提取试剂盒购自天津赛尔生物技术有限公司，PCR采用罗氏实时荧光定量PCR仪。
1.3 方法
1.3.1 外周血基因组DNA提取
所有受试对象在知情同意情况下，取外周静脉血2 mL，采用酚/氯仿法[7]提取2组患者外周血DNA。提取出的DNA在紫外线分光光度计（7230G型，上海天普分析仪器有限公司）下读取260 nm和280 nm处的吸光度值（A值）以鉴定其纯度和浓度。用无菌EP管分装，-80°保存。
1.3.2 多态性位点引物设计
根据XRCC1 Arg-194Trp位点对应的基因序列，采用Primer 5.0软件设计PCR扩增引物，上游引物为5′-GCCAGGGCC-CCTCCTFCAA-3′，下游引物为5′-TACCCTCAGA-CCCACGAGT-3′（购自天津赛尔生物技术有限公司）。
1.3.3 PCR反应体系及反应条件程序
PCR反应体系25μL，取2～10 ng基因组DNA，每种引物0.4μmol/mL，10×PCR缓冲液2.7μL，1.5 mmol/mL MgCl2，1.5 U Tag酶，100μmol/mL dNTP，采用Bio-Rad热循环仪（EF4577型，上海电威贸易有限公司）。反应条件为94℃预变性4 min，94℃变性40 s，63℃复性55 s，72℃延伸40 s，35个循环，最后再72℃延伸7 min。
1.3.4 限制性酶切
酶切反应体系为20μL，其中PCR产物5μL，10×PCR缓冲液3.5μL，限制性内切酶MspI（MBI）5 U，37℃水浴过夜。酶切产物于2％琼脂糖凝胶电泳（电压120 V，30 min），根据电泳条带数判断基因型。
1.4 统计学方法
使用SPSS 16.0软件处理数据。采用Mann-Whitney检验比较2组观察对象之间年龄分布差异；比值比（odds ratios，OR）及其95%可信区间（confidence intervals，CI）表示相对风险度。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 2组观察对象的基本特征
结直肠癌组与对照组相比，2组观察对象在年龄、性别、吸烟、饮酒、饮食特点等常见暴露因素方面比较其差异均无统计学意义（P > 0.05），具有可比性（表 1）。
表1
结直肠癌组与对照组的一般资料比较
2.2 2组观察对象XRCC1基因194位点基因型分布情况
结直肠癌组患者XRCC1基因194位点Arg/Arg、Arg/Trp及Trp/Trp多态基因型出现频率分别为70.00%、25.83%和4.17%，对照组出现频率分别为75.83%、20.83%和3.34%；结直肠癌组和对照组的变异基因型Arg/Trp＋Trp/Trp出现频率分别为30.00%和24.17%。2组间多态基因型和变异基因型出现频率比较其差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
表2
2组的XRCC1 194位点基因型分布情况〔例（%）〕
3 讨论
结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，近20年来，结直肠癌的发病率逐年增高，发病年龄趋于老龄化。其好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，约占60% [8]。结直肠癌的病因至今尚未完全清楚，而有研究[9]报道，高脂和低纤维饮食与其发生有着密切的关系；慢性炎症刺激也是一重要的影响因素。此外，直肠息肉也被认为是一种结直肠癌的癌前病变[10-11]。近年来，更多的学者开始关注遗传因素与结直肠癌发生的相关性。有研究[12]发现，在结直肠癌患者家族中，约25%有癌肿家族史。因此，基因的多态性必然在癌症的发生过程中起着一定的作用。
XRCC1是一种参与DNA损伤修复的重要基因，目前研究[4, 13]发现，XRCC1基因主要存在3个常见的多态性位点，它们分别是第10外显子G28152A（Arg399Gln）、第9外显子C27466A（Arg280His）及第6外显子C26304T（Arg194Trp）；且已有研究[5, 14-15]发现XRCC1与多种癌症的发生存在着相关性，如乳腺癌、食管癌、结直肠癌等。国外研究[16-17]报道，Arg339Gln位点多态性与结直肠癌的易感性有显著的相关性。但Arg194Trp位点多态性与结直肠癌的易感性关系相关文献报道较少。本研究结果发现，在结直肠癌组，Arg194Trp变异基因型出现的频率与对照组相比其差异并无统计学意义。该结果提示，Arg194Trp位点多态性与结直肠癌的易感性无显著相关性。但因纳入的样本量有限，这一结果并不能说明整个地区、中国及亚洲人群的整体情况。此外，不同人种的基因多态性也存在着一定差异。
总之，XRCC1作为一种DNA损伤修复基因，其多态性与多种肿瘤的发生存在相关性。XRCC1的3种不同位点基因多态性与结直肠癌易感性关系仍存在很大争议。本研究结果发现，XRCC1 Arg194Trp位点基因多态性与结直肠癌易感性并不存在显著相关性，然而非随机抽样、有限的样本量及肿瘤诱发因素的多样性均会影响结果的准确性与代表性，因此尚需大样本高质量研究来验证这一结果。
