引用本文： 陈静, 徐晓阳, 朱新江, 戴冬秋. ADAMTS1在结直肠癌组织中的表达及其与预后的关系. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(3): 330-334. doi: 10.7507/1007-9424.20140077 复制
含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombos-pondin motifs，ADAMTS）是近年来发现的继基质金属蛋白酶（MMPs）后的另外一类Zn2＋依赖的分泌型金属蛋白酶，它广泛存在于哺乳动物和无脊椎动物体内[1]。自从1997年发现第1个ADAMTSs家族成员以来[2]，已经有19个成员被发现，其在人体正常生理及病理活动中均起着重要的作用。目前的研究[3-5]发现，ADAMTSs家族参与众多生理活动过程，如胶原成熟、器官形成、黏蛋白降解、抑制血管生成、神经再生、炎症等。近来逐渐发现，该家族在肿瘤的发生、发展和转移过程中亦具有重要的作用[6-8]。而有关ADAMTSs家族中含血小板结合蛋白基序1的解聚蛋白样金属蛋白酶（ADAMTS1）在结直肠癌中的作用，国内外鲜见报道。笔者通过免疫组化染色方法检测了ADAMTS1在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达，以探讨其表达与结直肠癌临床病理特征和预后的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集1995年5月至2005年7月期间中国医科大学附属第四医院胃肠外科经手术切除的结直肠癌组织及癌旁组织（癌组织以远5 cm）的石蜡包埋标本65例，所有标本均经病理学检查证实。全部病例均为首发，手术前后均未接受放化疗，均行根治性切除术；其中男41例，女24例；＜65岁26例，≥65岁39例；肿瘤部位：直肠22例，结肠43例；手术方式：Dixon术13例，Miles术9例，右半结肠切除术21例，乙状结肠切除术15例，左半结肠切除术5例，横结肠切除术2例；肿瘤直径：＜5 cm者40例，≥5 cm 25例；TNM分期〔根据国际抗癌联盟（UICC）标准〕：Ⅰ期1例，Ⅱ期17例，Ⅲ期29例，Ⅳ期18例；病理学类型：腺癌55例，黏液腺癌10例；分化程度：高分化13例，中分化8例，低分化44例；有淋巴结转移41例，无淋巴结转移24例。所有病例均获访，随访时间96～216个月，中位随访时间为120个月。术后出现远处转移39例，局部复发14例，随访期间死亡48例。
1.2 方法
采用SP免疫组织化学染色法检测结直肠癌组织和癌旁组织中ADAMTS1的表达。兔抗人ADAMTS1多克隆抗体（编号：ab39194）为北京中杉生物技术有限公司代理的美国Abcam公司产品，即用型SP试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。将石蜡切片（5μm厚）常规脱蜡水化，以3% H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min，以微波炉加热修复抗原3 min；加ADAMTS1一抗（1︰500稀释）4℃冰箱过夜后，滴加山羊抗兔IgG二抗37℃静置10 min；再以DAB显色，苏木精复染，行脱水透明封片后，在显微镜下观察。用PBS代替一抗作阴性对照，采用已经证实ADAMTS1表达阳性的人胎盘组织切片为阳性对照。
1.3 免疫组化染色评分判定
根据以下3个方面进行评分判定：①染色程度评分：0分，无染色；1分，弱染色；2分，中染色；3分，强染色。②阳性染色细胞所占百分比评分：0分，所占比例为0；1分，＜10%；2分，10%～50%；3分，51%～90%；4分，＞90%。③染色方式评分：0分，无染色；1分，散在染色；2分，局灶染色；3分，弥漫染色。标本染色积分=①得分×②得分×③得分。阴性为0分，阳性为1～36分。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件进行统计学分析。ADAMTS1表达与结直肠癌临床病理特征关系的分析采用χ2检验；生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法，生存分析单因素分析采用log-rank检验，多因素分析采用Cox比例风险模型。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 ADAMTS1在结直肠癌和癌旁组织中的表达
ADAMTS1阳性染色主要定位于癌旁组织的细胞浆中，呈黄色或棕黄色颗粒；在结直肠癌组织中呈少量或无表达（图 1）。在结直肠癌组织中，ADAMTS1的表达阳性率为40%（26/65），癌旁组织为85%（55/65），结直肠癌组织的ADAMTS1表达阳性率低于癌旁组织（χ2=27.546，P＜0.001）。
图1
示ADAMTS1在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达结果（SP×200）。1A：在结直肠癌组织中呈阴性表达；1B：在癌旁组织中呈阳性表达
Figure1.
Expression of ADAMTS1 in colorectal cancer tissues and corr-esponding adjacent benign tissues (SP×200). 1A:Negative expression of ADAMTS-1 was observed in colorectal cancer tissues; 1B:Positive expression of ADAMTS1 was observed in adjacent benign tissues
2.2 结直肠癌组织中ADAMTS1表达与其临床病理特征的关系
结直肠癌组织中ADAMTS1的表达与其淋巴结转移有关，有淋巴结转移的结直肠癌其ADAMTS1的表达阳性率低于无淋巴结转移者（χ2=5.329，P=0.021），而ADAMTS1的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、病理学类型、肿瘤大小、分化程度及TNM分期均无关（P＞0.05），见表 1。
表1
ADAMTS1表达与结直肠癌临床病理特征的关系（例）
Table1.
Relationship between expression of ADAMTS1 and clinico-pathological features of colorectal cancer(case)
2.3 ADAMTS1表达与结直肠癌预后关系的单因素分析结果
高-中分化（χ2=4.452，P=0.035）、Ⅰ～Ⅱ期（χ2=14.356，P＜0.001）、无淋巴结转移（χ2=8.200，P=0.004）和ADAMTS1表达阳性（χ2=10.151，P=0.001）的结直肠癌其中位生存时间分别高于低分化、Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移和ADAMTS1表达阴性者。而结直肠癌患者的预后与年龄、性别、肿瘤部位、病理学类型及肿瘤大小均无关（P＞0.05）。见表 2。
表2
结直肠癌预后影响因素的单因素分析结果
Table2.
Univariate analysis results on influence factor of prognosis in colorectal cancer
2.4 ADAMTS1表达与结直肠癌预后关系的多因素分析结果
将ADAMTS1的表达情况、性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、病理学类型、分化程度、TNM分期以及淋巴结转移情况纳入Cox比例风险模型进行多因素分析。结果显示，TNM分期、淋巴结转移和ADAMTS1表达情况是结直肠癌患者预后的独立影响因素（表 3），Ⅰ～Ⅱ期（RR=3.782，95% CI：1.509～9.476，P=0.005）、无淋巴结转移（RR=3.107，95% CI：1.186～8.138，P=0.021）和ADAMTS1表达阳性者（RR=2.020，95% CI：1.071～3.809，P=0.030）的生存情况较好。
表3
结直肠癌预后影响因素的Cox比例风险模型结果
Table3.
Influence factors of prognosis in colorectal cancer by using Cox proportional hazard model
3 讨论
ADAMTSs家族是一类新的Zn2+依赖的金属蛋白酶家族。研究[3, 9-10]表明，ADAMTSs家族通过与细胞外基质结合及活化生长因子，在细胞增殖、凋亡及肿瘤的发生、发展及转移中均起重要作用。ADAMTS1是ADAMTSs家族的成员之一，研究[11]发现，ADAMTS1可以结合血管内皮生长因子165（VEGF165），导致VEGF不能激活其受体即血管内皮生长因子受体2（VEGFR2），从而抑制肿瘤的血管生成。它还可以特异性地抑制上皮细胞增生，阻滞成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）诱导的血管生成和VEGF诱导的血管生成，具有抗血管生成作用[12]。研究[13-15]报道，ADAMTS1在多种肿瘤（包括结直肠癌）中的表达下调，其表达下调的原因与基因启动子的高甲基化密切相关[16]。ADAMTS1在乳腺癌中的表达下调，通过抑制ADAMTS1的表达能够使VEGF的表达上调，从而促进乳腺肿瘤细胞的迁移和浸润[17]。ADAMTS1高表达能够促进乳腺癌细胞的肺转移[18]，因此其被认为是一种肿瘤生长抑制因子，但目前对ADAMTS1在肿瘤局部侵袭和转移中的作用机理尚有争论。有研究[19]认为，ADAMTS1在宫颈癌中的表达上调；还有研究[14, 20]认为，在胰腺癌和乳腺癌中，ADAMTS1可以通过提高癌细胞的迁徙和侵袭能力，从而促进肿瘤的转移。笔者[21]曾报道，ADAMTS1在胃癌原发灶中的表达水平明显低于淋巴结转移灶，且其表达与VEGF的表达呈负相关。因此，目前对ADAMTS1在肿瘤发生、发展及转移中的确切作用机理还不十分明确。
本研究应用免疫组化染色方法检测了结直肠癌组织及癌旁组织中ADAMTS1的表达，发现其在结直肠癌组织中的表达阳性率较低，提示其可能是一种肿瘤生长抑制因子。研究[14]表明，ADAMTS1高表达的胰腺癌患者其淋巴结转移和腹膜后侵袭明显增多。本组资料结果显示，结直肠癌组织中ADAMTS1的表达与淋巴结转移相关，无淋巴结转移者的ADAMTS1表达阳性率较高。研究[22-24]认为，术前癌胚抗原（CEA）水平、肿瘤病理学类型、淋巴结转移、肿瘤分期等是结直肠癌最重要的预后指标。本组资料多因素分析结果显示，Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴结转移结直肠癌患者的预后明显差于Ⅰ～Ⅱ期及无淋巴结转移者。有研究[25]报道，ADAMTS8高表达和ADMATS15低表达的乳腺癌患者具有较差的预后，表明此基因家族可能与乳腺癌的预后有关。此外，本组资料结果表明，ADAMTS1表达阳性者的预后明显好于表达阴性者，提示ADAMTS1可能是预测结直肠癌预后的独立指标之一。
综上所述，ADAMTS1可能是一种肿瘤生长抑制因子，它可能与结直肠癌的发展及淋巴结转移情况的关系更密切，也可能是预测结直肠癌预后的一种新指标。
含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombos-pondin motifs，ADAMTS）是近年来发现的继基质金属蛋白酶（MMPs）后的另外一类Zn2＋依赖的分泌型金属蛋白酶，它广泛存在于哺乳动物和无脊椎动物体内[1]。自从1997年发现第1个ADAMTSs家族成员以来[2]，已经有19个成员被发现，其在人体正常生理及病理活动中均起着重要的作用。目前的研究[3-5]发现，ADAMTSs家族参与众多生理活动过程，如胶原成熟、器官形成、黏蛋白降解、抑制血管生成、神经再生、炎症等。近来逐渐发现，该家族在肿瘤的发生、发展和转移过程中亦具有重要的作用[6-8]。而有关ADAMTSs家族中含血小板结合蛋白基序1的解聚蛋白样金属蛋白酶（ADAMTS1）在结直肠癌中的作用，国内外鲜见报道。笔者通过免疫组化染色方法检测了ADAMTS1在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达，以探讨其表达与结直肠癌临床病理特征和预后的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集1995年5月至2005年7月期间中国医科大学附属第四医院胃肠外科经手术切除的结直肠癌组织及癌旁组织（癌组织以远5 cm）的石蜡包埋标本65例，所有标本均经病理学检查证实。全部病例均为首发，手术前后均未接受放化疗，均行根治性切除术；其中男41例，女24例；＜65岁26例，≥65岁39例；肿瘤部位：直肠22例，结肠43例；手术方式：Dixon术13例，Miles术9例，右半结肠切除术21例，乙状结肠切除术15例，左半结肠切除术5例，横结肠切除术2例；肿瘤直径：＜5 cm者40例，≥5 cm 25例；TNM分期〔根据国际抗癌联盟（UICC）标准〕：Ⅰ期1例，Ⅱ期17例，Ⅲ期29例，Ⅳ期18例；病理学类型：腺癌55例，黏液腺癌10例；分化程度：高分化13例，中分化8例，低分化44例；有淋巴结转移41例，无淋巴结转移24例。所有病例均获访，随访时间96～216个月，中位随访时间为120个月。术后出现远处转移39例，局部复发14例，随访期间死亡48例。
1.2 方法
采用SP免疫组织化学染色法检测结直肠癌组织和癌旁组织中ADAMTS1的表达。兔抗人ADAMTS1多克隆抗体（编号：ab39194）为北京中杉生物技术有限公司代理的美国Abcam公司产品，即用型SP试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。将石蜡切片（5μm厚）常规脱蜡水化，以3% H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min，以微波炉加热修复抗原3 min；加ADAMTS1一抗（1︰500稀释）4℃冰箱过夜后，滴加山羊抗兔IgG二抗37℃静置10 min；再以DAB显色，苏木精复染，行脱水透明封片后，在显微镜下观察。用PBS代替一抗作阴性对照，采用已经证实ADAMTS1表达阳性的人胎盘组织切片为阳性对照。
1.3 免疫组化染色评分判定
根据以下3个方面进行评分判定：①染色程度评分：0分，无染色；1分，弱染色；2分，中染色；3分，强染色。②阳性染色细胞所占百分比评分：0分，所占比例为0；1分，＜10%；2分，10%～50%；3分，51%～90%；4分，＞90%。③染色方式评分：0分，无染色；1分，散在染色；2分，局灶染色；3分，弥漫染色。标本染色积分=①得分×②得分×③得分。阴性为0分，阳性为1～36分。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件进行统计学分析。ADAMTS1表达与结直肠癌临床病理特征关系的分析采用χ2检验；生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法，生存分析单因素分析采用log-rank检验，多因素分析采用Cox比例风险模型。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 ADAMTS1在结直肠癌和癌旁组织中的表达
ADAMTS1阳性染色主要定位于癌旁组织的细胞浆中，呈黄色或棕黄色颗粒；在结直肠癌组织中呈少量或无表达（图 1）。在结直肠癌组织中，ADAMTS1的表达阳性率为40%（26/65），癌旁组织为85%（55/65），结直肠癌组织的ADAMTS1表达阳性率低于癌旁组织（χ2=27.546，P＜0.001）。
图1
示ADAMTS1在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达结果（SP×200）。1A：在结直肠癌组织中呈阴性表达；1B：在癌旁组织中呈阳性表达
Figure1.
Expression of ADAMTS1 in colorectal cancer tissues and corr-esponding adjacent benign tissues (SP×200). 1A:Negative expression of ADAMTS-1 was observed in colorectal cancer tissues; 1B:Positive expression of ADAMTS1 was observed in adjacent benign tissues
2.2 结直肠癌组织中ADAMTS1表达与其临床病理特征的关系
结直肠癌组织中ADAMTS1的表达与其淋巴结转移有关，有淋巴结转移的结直肠癌其ADAMTS1的表达阳性率低于无淋巴结转移者（χ2=5.329，P=0.021），而ADAMTS1的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、病理学类型、肿瘤大小、分化程度及TNM分期均无关（P＞0.05），见表 1。
表1
ADAMTS1表达与结直肠癌临床病理特征的关系（例）
Table1.
Relationship between expression of ADAMTS1 and clinico-pathological features of colorectal cancer(case)
2.3 ADAMTS1表达与结直肠癌预后关系的单因素分析结果
高-中分化（χ2=4.452，P=0.035）、Ⅰ～Ⅱ期（χ2=14.356，P＜0.001）、无淋巴结转移（χ2=8.200，P=0.004）和ADAMTS1表达阳性（χ2=10.151，P=0.001）的结直肠癌其中位生存时间分别高于低分化、Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移和ADAMTS1表达阴性者。而结直肠癌患者的预后与年龄、性别、肿瘤部位、病理学类型及肿瘤大小均无关（P＞0.05）。见表 2。
表2
结直肠癌预后影响因素的单因素分析结果
Table2.
Univariate analysis results on influence factor of prognosis in colorectal cancer
2.4 ADAMTS1表达与结直肠癌预后关系的多因素分析结果
将ADAMTS1的表达情况、性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、病理学类型、分化程度、TNM分期以及淋巴结转移情况纳入Cox比例风险模型进行多因素分析。结果显示，TNM分期、淋巴结转移和ADAMTS1表达情况是结直肠癌患者预后的独立影响因素（表 3），Ⅰ～Ⅱ期（RR=3.782，95% CI：1.509～9.476，P=0.005）、无淋巴结转移（RR=3.107，95% CI：1.186～8.138，P=0.021）和ADAMTS1表达阳性者（RR=2.020，95% CI：1.071～3.809，P=0.030）的生存情况较好。
表3
结直肠癌预后影响因素的Cox比例风险模型结果
Table3.
Influence factors of prognosis in colorectal cancer by using Cox proportional hazard model
3 讨论
ADAMTSs家族是一类新的Zn2+依赖的金属蛋白酶家族。研究[3, 9-10]表明，ADAMTSs家族通过与细胞外基质结合及活化生长因子，在细胞增殖、凋亡及肿瘤的发生、发展及转移中均起重要作用。ADAMTS1是ADAMTSs家族的成员之一，研究[11]发现，ADAMTS1可以结合血管内皮生长因子165（VEGF165），导致VEGF不能激活其受体即血管内皮生长因子受体2（VEGFR2），从而抑制肿瘤的血管生成。它还可以特异性地抑制上皮细胞增生，阻滞成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）诱导的血管生成和VEGF诱导的血管生成，具有抗血管生成作用[12]。研究[13-15]报道，ADAMTS1在多种肿瘤（包括结直肠癌）中的表达下调，其表达下调的原因与基因启动子的高甲基化密切相关[16]。ADAMTS1在乳腺癌中的表达下调，通过抑制ADAMTS1的表达能够使VEGF的表达上调，从而促进乳腺肿瘤细胞的迁移和浸润[17]。ADAMTS1高表达能够促进乳腺癌细胞的肺转移[18]，因此其被认为是一种肿瘤生长抑制因子，但目前对ADAMTS1在肿瘤局部侵袭和转移中的作用机理尚有争论。有研究[19]认为，ADAMTS1在宫颈癌中的表达上调；还有研究[14, 20]认为，在胰腺癌和乳腺癌中，ADAMTS1可以通过提高癌细胞的迁徙和侵袭能力，从而促进肿瘤的转移。笔者[21]曾报道，ADAMTS1在胃癌原发灶中的表达水平明显低于淋巴结转移灶，且其表达与VEGF的表达呈负相关。因此，目前对ADAMTS1在肿瘤发生、发展及转移中的确切作用机理还不十分明确。
本研究应用免疫组化染色方法检测了结直肠癌组织及癌旁组织中ADAMTS1的表达，发现其在结直肠癌组织中的表达阳性率较低，提示其可能是一种肿瘤生长抑制因子。研究[14]表明，ADAMTS1高表达的胰腺癌患者其淋巴结转移和腹膜后侵袭明显增多。本组资料结果显示，结直肠癌组织中ADAMTS1的表达与淋巴结转移相关，无淋巴结转移者的ADAMTS1表达阳性率较高。研究[22-24]认为，术前癌胚抗原（CEA）水平、肿瘤病理学类型、淋巴结转移、肿瘤分期等是结直肠癌最重要的预后指标。本组资料多因素分析结果显示，Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴结转移结直肠癌患者的预后明显差于Ⅰ～Ⅱ期及无淋巴结转移者。有研究[25]报道，ADAMTS8高表达和ADMATS15低表达的乳腺癌患者具有较差的预后，表明此基因家族可能与乳腺癌的预后有关。此外，本组资料结果表明，ADAMTS1表达阳性者的预后明显好于表达阴性者，提示ADAMTS1可能是预测结直肠癌预后的独立指标之一。
综上所述，ADAMTS1可能是一种肿瘤生长抑制因子，它可能与结直肠癌的发展及淋巴结转移情况的关系更密切，也可能是预测结直肠癌预后的一种新指标。
