引用本文： 王健, 王晓东, 唐冠杰, 赵佳. pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体的构建和鉴定. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(3): 300-304. doi: 10.7507/1007-9424.20140072 复制
组织因子途径抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2）又称为胎盘蛋白-5（placental pro-tein-5，PP-5）或视网膜色素上皮细胞-1（retinal pig-ment epithelium-1，RPE-1），属于丝氨酸蛋白酶抑制物的一种[1-2]。研究[3-5]表明，TFPI-2蛋白在维持细胞外基质（ECM）结构的完整性、调控恶性肿瘤的内外扩张和迁移中均起着重要的作用。TFPI-2基因在人体正常组织中高表达，而在肿瘤组织中则表现为低表达，甚至不表达[6-8]。将外源性TFPI-2基因克隆于肿瘤细胞的DNA中可上调其表达，但随着肿瘤细胞的复制，常出现TFPI-2基因缺失。真核细胞表达载体如pEGFP-N3质粒强大复制能力的发现，为克服上述方法的不足提供了可能。本实验将外源性TFPI-2基因克隆于pEGFP-N3载体中，成功构建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体，旨在为恶性肿瘤的基因治疗提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料和设备
主要材料：人胎盘组织，胎牛血清（中国杭州四季青生物工程材料有限公司），pEGFP-N3质粒（中国北京斯百汇生物科技有限公司），Top10化学感受态细胞（大肠杆菌Top10菌株）转染试剂盒和质粒小抽试剂盒（日本TaKaRa公司），1%琼脂糖凝胶回收试剂盒（中国百奥迈科生物技术公司），DNA聚合酶和T4连接酶缓冲液（中国上海生工生物工程有限公司），24%聚乙二醇6000（PEG6000，加拿大Fermentas公司），限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ（美国NEB公司），1 kb plus DNA ladder（北京天根公司）），逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒和Trizol试剂（美国Roche公司），DNA凝胶回收试剂盒（西安华舜公司）。设备：Western blot用电泳仪、电泳槽及转膜仪（美国Bio-Rad公司），酶标仪（上海安泰分析仪器有限公司），紫外分析仪和分光光度计（韩国Mecasys公司）。
1.2 引物的设计与合成
设计扩增TFPI-2基因cDNA的引物时，上、下游引物分别选用XhoⅠ（CTCGAG序列）和KpnⅠ（GGTACC序列）两个酶切位点。引物序列由沈阳宝信生物科技有限公司合成。TFPI-2基因：上游引物序列为5′-CCAATCTCGAGATGGACCCCGCTCGC-CCCCTGGGGCTG-3′，下游引物序列为5′-CCAAT-GGTACCGTAAATTGCTTCTTCCGAATTTTCCG-3′（扩增产物长度为368 bp）；β-actin：上游引物序列为5′-CTCCTTAAGCTCGGGACCTTCCCAGAATT-CGGCTAAAC-3′，下游引物序列为5′-GACCTAGC-ACCCTTAGGAATTTCCGACGGGTACGACG-3′（扩增产物长度为520 bp）。
1.3 TFPI-2基因cDNA的获取
取新鲜人胎盘组织40 mg，于液氮中研磨成粉；加入500μL Trizol试剂反复吹打，使细胞完全裂解，室温静置5 min；加入200μL氯仿，剧烈震荡12 s，室温静置2 min；4℃离心（1 200 r/min，r=13.5 cm，15 min）；去上清液，加入1 mL 75%乙醇溶液洗涤沉淀，4℃离心（7 500 r/min，r=13.5 cm，5 min）；吸去乙醇，室温沉淀10 min，加入焦炭酸二乙酯水（DEPC-H2O）溶解RNA。以紫外分析仪检测总RNA的纯度，判断符合RT-PCR的反应要求后，经逆转录合成cDNA的第1链（操作按试剂盒说明书进行），然后采用PCR技术扩增cDNA（在试管中加入模板DNA 1μL，PCR引物（oligo 6）1μL，4种核苷酸共1μL及Mgcl2溶液4μL）。PCR的反应条件：95℃、5 min条件下激活和热启动Taq DNA聚合酶，95℃30 s（变性），56℃30 s（退火），72℃1 min（延伸），共25个循环。以扩增后的cDNA为模板，以引物T重复寡核苷酸（oligo dT）引导进行PCR扩增（操作按试剂盒说明书进行），从而获取TFPI-2基因的全长cDNA。
1.4 pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体的构建和扩增
将pEGFP-N3质粒和TFPI-2 cDNA分别行XhoⅠ和KpnⅠ酶切后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带，再予以连接：加入T4连接酶缓冲液2μL、酶切后回收的pEGFR-N3质粒片段4μL，酶切后回收的TFPI-2 cDNA片段1μL，加灭菌水至10μL，16℃条件下反应4 h。从-80℃冰箱中取出Top10化学感受态细胞50μL，加入10μL连接产物，冰上孵育35 min；在42℃水浴锅中热击90 s，将热击后的感受态细胞迅速转移至冰上静置3 min；加入600μL LB卡那霉素抗性液体培养基（0.03μg/L），37℃摇床培养1 h（220 r/min，振幅32 mm，后同）；将培养基加入EP管中，离心（3 000 r/min，r=13.5 cm，5 min）；在超净工作台中倒掉上清，用加样移液器吹吸使菌体重悬；吸取适量菌液（200μL）涂布LB卡那霉素培养基平板，37℃倒置过夜培养（12～16 h）。等待长出单克隆菌落后，挑取菌斑加于48孔深孔板中（含有LB卡那霉素抗性液体培养基），37℃摇床扩大培养16 h。按照质粒小抽试剂盒的操作说明书提取pEGFR-N3-TFPI-2重组质粒。将pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒行XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，再行1%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带的长度是否与理论值一致。同时将含阳性重组质粒的细菌送宝生物工程（大连）有限公司行DNA序列测定，测序结果与GenBank的检测结果完全一致。经测序验证构建正确后，将载体命名为pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒。
1.5 pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒的转染
在24孔培养板上，以无血清无双抗的1640培养基培养Top10感受态细胞4 h后，采用Lipofecta-mineTM 2000转染，转染步骤按试剂盒说明书进行。Top10感受态细胞的铺板密度为2×104个/孔，pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒用量为0.5μg，脂质体用量为4μL；逐一优化转染条件后转染（转染组），转染4 h后更换为完全培养基。空白对照组仅转染pEGFP-N3质粒，转染步骤同转染组，未转染组不做转染处理。转染24 h后检测3组细胞中TFPI-2蛋白的表达情况。
1.6 Western blot法检测TFPI-2蛋白的表达
蛋白样品的制备：转染组、未转染组和空白对照组分别收集细胞1×107个，再用PBS冲洗3遍；加入裂解液400μL，置于冰上裂解30 min。将细胞碎片和裂解液移至EP管中，4℃离心（12 000 r/min，r=13.5 cm，5 min），取上清（即为总蛋白）。蛋白含量的测定：配制适量的二喹啉甲酸（BCA）工作液，与蛋白标准品充分混匀，使其完全溶解；将标准品按0、1、2、4、8、12、16及20μL加到96孔细胞培养板的标准品孔中，加无菌生理盐水补足到20μL。加5μL蛋白样品到样品孔中，加生理盐水补足到20μL；各孔加入BCA工作液200μL，37℃放置30 min。以酶标仪测定光密度值（A值），绘制标准曲线，计算蛋白浓度，浓度符合要求后进行后续操作。电泳：灌胶，用微量移液器加样20μL，加入电泳缓冲液，接好电极，观察Marker的移动情况，适时终止电泳。将电泳后的凝胶取出浸入buffer中，置于摇床上30 min；截取聚偏二氯乙烯膜（PVDF膜）浸入buffer中10 min；将1张厚滤纸浸湿铺于半干转印仪底层电极板上，将PVDF膜铺在厚滤纸上，再用另一张浸湿的厚滤纸放于PVDF膜上，盖上顶层电极板，转印1 h。取出PVDF膜，浸入含5%脱脂牛奶的TBST封闭液中，摇床摇1 h，倒掉封闭液，加入TFPI-2一抗（兔抗人TFPI-2单克隆抗体，1∶1 000），过夜孵育，再加抗兔二抗（1∶2 000），按显色试剂盒说明书进行显色分析。
1.7 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（
2 结果
总RNA经分光光度法测定：A260 /A280=1.926，表明所获得的总RNA的纯度符合RT-PCR的要求。
2.1 pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒的鉴定结果
将pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒分别行XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后，行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，分别在708 bp和4 700 bp处有特异扩增条带（图 1），长度与理论值一致；pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒对应的条带长度与其理论值一致，表明目的基因已成功转入pEGFP-N3载体中。同时，pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒的DNA测序结果表明载体构建正确。
图1
pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒的酶切结果。1：pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒（未被酶切）；2：pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒行XhoⅠ和KpnⅠ双酶切；3：DNA Marker
Figure1.
Results of enzyme digestion of recombinant plasmid of pEGFP-N3-TFPI-2. 1:Recombinant plasmid of pEGFP-N3-TFPI-2 by no digestion; 2:Recombinant plasmid of pEGFP-N3-TFPI-2 by double digestion with XhoⅠand KpnⅠ; 3:DNA Marker
2.2 3组细胞中TFPI-2蛋白的表达情况
Western blot法检测结果（图 2）显示，TFPI-2蛋白的表达量转染组为0.657 3±0.032 5，空白对照组为0.301 7±0.028 7，未转染组为0.314 3±0.026 6，转染组TFPI-2蛋白的表达量高于空白对照组和未转染组（P＜0.01），而对照组和未转染组TFPI-2蛋白表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。表明真核表达载体已整合入Top10化学感受态细胞中，促使抑癌因子TFPI-2蛋白的表达明显上调。
图2
示3组细胞中TFPI-2蛋白的表达结果。1：未转染组；2：空白对照组；3：转染组
Figure2.
Expression results of TFPI-2 protein in 3 groups. 1:Untrans-fection group; 2:Blank control group; 3:Transfection group
3 讨论
恶性肿瘤是一类侵袭能力强、早期易发生转移，且目前缺乏有效治疗方法的一类疾病，其发病率呈逐年上升趋势。现认为，恶性肿瘤侵袭和转移的基础为ECM降解，因而维持ECM的完整性是减少恶性肿瘤侵袭和转移的关键[9-12]。TFPI-2基因定位于人类7号染色体长臂2区2带（7q22），全长约7 kb。TFPI-2基因广泛分布于人类肝脏、胰腺、胃、前列腺、骨骼肌等正常组织中，其编码产物为丝氨酸蛋白酶抑制物——TFPI-2蛋白。TFPI-2蛋白在ECM的重塑与动态平衡中起到关键作用。ECM为上皮细胞提供了一个支架，参与细胞凋亡、增殖、黏附、迁移及分化，是肿瘤发展过程中必不可少的一部分。ECM的降解和重塑是血管生成、肿瘤细胞侵袭和转移等生理、病理过程的基本步骤[13]。在正常人体组织中，TFPI-2蛋白抑制纤溶酶和多种基质金属蛋白酶（MMPs）的活性，进而维持了ECM结构的完整性，抑制了血管的重塑[14]，这是抑制肿瘤侵袭和转移的重要机理[2, 15]。在乳腺癌[2, 16]、胃癌[6, 17-18]、非小细胞肺癌[19-20]、胰腺癌[21-22]、肝细胞癌[23]、宫颈癌[24]等多种恶性肿瘤组织中，TFPI-2蛋白的表达下调。研究[2]表明，表达失调的TFPI-2蛋白可能与肿瘤的进展相关。通过对喉鳞状细胞癌的研究[25]表明，TFPI-2蛋白通过抑制ECM的降解，可以使其癌细胞的侵袭和转移能力下降。
本实验从人胎盘组织中提取了TFPI-2基因，将其克隆在pEGFP-N3载体上，并通过双酶切法和DNA序列测定验证了所构建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体的正确性。Western blot法检测结果显示，稳定转染的细胞中TFPI-2蛋白的表达量明显高于空白对照组和未转染组，表明真核表达载体已成功整合入转染细胞。所选用的pEGFP-N3载体具有便于目的基因插入的多克隆位点，因而操作简便易行。本实验为进一步研究TFPI-2基因对肿瘤细胞的抑制作用提供了实验基础。
组织因子途径抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2）又称为胎盘蛋白-5（placental pro-tein-5，PP-5）或视网膜色素上皮细胞-1（retinal pig-ment epithelium-1，RPE-1），属于丝氨酸蛋白酶抑制物的一种[1-2]。研究[3-5]表明，TFPI-2蛋白在维持细胞外基质（ECM）结构的完整性、调控恶性肿瘤的内外扩张和迁移中均起着重要的作用。TFPI-2基因在人体正常组织中高表达，而在肿瘤组织中则表现为低表达，甚至不表达[6-8]。将外源性TFPI-2基因克隆于肿瘤细胞的DNA中可上调其表达，但随着肿瘤细胞的复制，常出现TFPI-2基因缺失。真核细胞表达载体如pEGFP-N3质粒强大复制能力的发现，为克服上述方法的不足提供了可能。本实验将外源性TFPI-2基因克隆于pEGFP-N3载体中，成功构建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体，旨在为恶性肿瘤的基因治疗提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料和设备
主要材料：人胎盘组织，胎牛血清（中国杭州四季青生物工程材料有限公司），pEGFP-N3质粒（中国北京斯百汇生物科技有限公司），Top10化学感受态细胞（大肠杆菌Top10菌株）转染试剂盒和质粒小抽试剂盒（日本TaKaRa公司），1%琼脂糖凝胶回收试剂盒（中国百奥迈科生物技术公司），DNA聚合酶和T4连接酶缓冲液（中国上海生工生物工程有限公司），24%聚乙二醇6000（PEG6000，加拿大Fermentas公司），限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ（美国NEB公司），1 kb plus DNA ladder（北京天根公司）），逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒和Trizol试剂（美国Roche公司），DNA凝胶回收试剂盒（西安华舜公司）。设备：Western blot用电泳仪、电泳槽及转膜仪（美国Bio-Rad公司），酶标仪（上海安泰分析仪器有限公司），紫外分析仪和分光光度计（韩国Mecasys公司）。
1.2 引物的设计与合成
设计扩增TFPI-2基因cDNA的引物时，上、下游引物分别选用XhoⅠ（CTCGAG序列）和KpnⅠ（GGTACC序列）两个酶切位点。引物序列由沈阳宝信生物科技有限公司合成。TFPI-2基因：上游引物序列为5′-CCAATCTCGAGATGGACCCCGCTCGC-CCCCTGGGGCTG-3′，下游引物序列为5′-CCAAT-GGTACCGTAAATTGCTTCTTCCGAATTTTCCG-3′（扩增产物长度为368 bp）；β-actin：上游引物序列为5′-CTCCTTAAGCTCGGGACCTTCCCAGAATT-CGGCTAAAC-3′，下游引物序列为5′-GACCTAGC-ACCCTTAGGAATTTCCGACGGGTACGACG-3′（扩增产物长度为520 bp）。
1.3 TFPI-2基因cDNA的获取
取新鲜人胎盘组织40 mg，于液氮中研磨成粉；加入500μL Trizol试剂反复吹打，使细胞完全裂解，室温静置5 min；加入200μL氯仿，剧烈震荡12 s，室温静置2 min；4℃离心（1 200 r/min，r=13.5 cm，15 min）；去上清液，加入1 mL 75%乙醇溶液洗涤沉淀，4℃离心（7 500 r/min，r=13.5 cm，5 min）；吸去乙醇，室温沉淀10 min，加入焦炭酸二乙酯水（DEPC-H2O）溶解RNA。以紫外分析仪检测总RNA的纯度，判断符合RT-PCR的反应要求后，经逆转录合成cDNA的第1链（操作按试剂盒说明书进行），然后采用PCR技术扩增cDNA（在试管中加入模板DNA 1μL，PCR引物（oligo 6）1μL，4种核苷酸共1μL及Mgcl2溶液4μL）。PCR的反应条件：95℃、5 min条件下激活和热启动Taq DNA聚合酶，95℃30 s（变性），56℃30 s（退火），72℃1 min（延伸），共25个循环。以扩增后的cDNA为模板，以引物T重复寡核苷酸（oligo dT）引导进行PCR扩增（操作按试剂盒说明书进行），从而获取TFPI-2基因的全长cDNA。
1.4 pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体的构建和扩增
将pEGFP-N3质粒和TFPI-2 cDNA分别行XhoⅠ和KpnⅠ酶切后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带，再予以连接：加入T4连接酶缓冲液2μL、酶切后回收的pEGFR-N3质粒片段4μL，酶切后回收的TFPI-2 cDNA片段1μL，加灭菌水至10μL，16℃条件下反应4 h。从-80℃冰箱中取出Top10化学感受态细胞50μL，加入10μL连接产物，冰上孵育35 min；在42℃水浴锅中热击90 s，将热击后的感受态细胞迅速转移至冰上静置3 min；加入600μL LB卡那霉素抗性液体培养基（0.03μg/L），37℃摇床培养1 h（220 r/min，振幅32 mm，后同）；将培养基加入EP管中，离心（3 000 r/min，r=13.5 cm，5 min）；在超净工作台中倒掉上清，用加样移液器吹吸使菌体重悬；吸取适量菌液（200μL）涂布LB卡那霉素培养基平板，37℃倒置过夜培养（12～16 h）。等待长出单克隆菌落后，挑取菌斑加于48孔深孔板中（含有LB卡那霉素抗性液体培养基），37℃摇床扩大培养16 h。按照质粒小抽试剂盒的操作说明书提取pEGFR-N3-TFPI-2重组质粒。将pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒行XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，再行1%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带的长度是否与理论值一致。同时将含阳性重组质粒的细菌送宝生物工程（大连）有限公司行DNA序列测定，测序结果与GenBank的检测结果完全一致。经测序验证构建正确后，将载体命名为pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒。
1.5 pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒的转染
在24孔培养板上，以无血清无双抗的1640培养基培养Top10感受态细胞4 h后，采用Lipofecta-mineTM 2000转染，转染步骤按试剂盒说明书进行。Top10感受态细胞的铺板密度为2×104个/孔，pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒用量为0.5μg，脂质体用量为4μL；逐一优化转染条件后转染（转染组），转染4 h后更换为完全培养基。空白对照组仅转染pEGFP-N3质粒，转染步骤同转染组，未转染组不做转染处理。转染24 h后检测3组细胞中TFPI-2蛋白的表达情况。
1.6 Western blot法检测TFPI-2蛋白的表达
蛋白样品的制备：转染组、未转染组和空白对照组分别收集细胞1×107个，再用PBS冲洗3遍；加入裂解液400μL，置于冰上裂解30 min。将细胞碎片和裂解液移至EP管中，4℃离心（12 000 r/min，r=13.5 cm，5 min），取上清（即为总蛋白）。蛋白含量的测定：配制适量的二喹啉甲酸（BCA）工作液，与蛋白标准品充分混匀，使其完全溶解；将标准品按0、1、2、4、8、12、16及20μL加到96孔细胞培养板的标准品孔中，加无菌生理盐水补足到20μL。加5μL蛋白样品到样品孔中，加生理盐水补足到20μL；各孔加入BCA工作液200μL，37℃放置30 min。以酶标仪测定光密度值（A值），绘制标准曲线，计算蛋白浓度，浓度符合要求后进行后续操作。电泳：灌胶，用微量移液器加样20μL，加入电泳缓冲液，接好电极，观察Marker的移动情况，适时终止电泳。将电泳后的凝胶取出浸入buffer中，置于摇床上30 min；截取聚偏二氯乙烯膜（PVDF膜）浸入buffer中10 min；将1张厚滤纸浸湿铺于半干转印仪底层电极板上，将PVDF膜铺在厚滤纸上，再用另一张浸湿的厚滤纸放于PVDF膜上，盖上顶层电极板，转印1 h。取出PVDF膜，浸入含5%脱脂牛奶的TBST封闭液中，摇床摇1 h，倒掉封闭液，加入TFPI-2一抗（兔抗人TFPI-2单克隆抗体，1∶1 000），过夜孵育，再加抗兔二抗（1∶2 000），按显色试剂盒说明书进行显色分析。
1.7 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（
2 结果
总RNA经分光光度法测定：A260 /A280=1.926，表明所获得的总RNA的纯度符合RT-PCR的要求。
2.1 pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒的鉴定结果
将pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒分别行XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后，行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，分别在708 bp和4 700 bp处有特异扩增条带（图 1），长度与理论值一致；pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒对应的条带长度与其理论值一致，表明目的基因已成功转入pEGFP-N3载体中。同时，pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒的DNA测序结果表明载体构建正确。
图1
pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒的酶切结果。1：pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒（未被酶切）；2：pEGFP-N3-TFPI-2重组质粒行XhoⅠ和KpnⅠ双酶切；3：DNA Marker
Figure1.
Results of enzyme digestion of recombinant plasmid of pEGFP-N3-TFPI-2. 1:Recombinant plasmid of pEGFP-N3-TFPI-2 by no digestion; 2:Recombinant plasmid of pEGFP-N3-TFPI-2 by double digestion with XhoⅠand KpnⅠ; 3:DNA Marker
2.2 3组细胞中TFPI-2蛋白的表达情况
Western blot法检测结果（图 2）显示，TFPI-2蛋白的表达量转染组为0.657 3±0.032 5，空白对照组为0.301 7±0.028 7，未转染组为0.314 3±0.026 6，转染组TFPI-2蛋白的表达量高于空白对照组和未转染组（P＜0.01），而对照组和未转染组TFPI-2蛋白表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。表明真核表达载体已整合入Top10化学感受态细胞中，促使抑癌因子TFPI-2蛋白的表达明显上调。
图2
示3组细胞中TFPI-2蛋白的表达结果。1：未转染组；2：空白对照组；3：转染组
Figure2.
Expression results of TFPI-2 protein in 3 groups. 1:Untrans-fection group; 2:Blank control group; 3:Transfection group
3 讨论
恶性肿瘤是一类侵袭能力强、早期易发生转移，且目前缺乏有效治疗方法的一类疾病，其发病率呈逐年上升趋势。现认为，恶性肿瘤侵袭和转移的基础为ECM降解，因而维持ECM的完整性是减少恶性肿瘤侵袭和转移的关键[9-12]。TFPI-2基因定位于人类7号染色体长臂2区2带（7q22），全长约7 kb。TFPI-2基因广泛分布于人类肝脏、胰腺、胃、前列腺、骨骼肌等正常组织中，其编码产物为丝氨酸蛋白酶抑制物——TFPI-2蛋白。TFPI-2蛋白在ECM的重塑与动态平衡中起到关键作用。ECM为上皮细胞提供了一个支架，参与细胞凋亡、增殖、黏附、迁移及分化，是肿瘤发展过程中必不可少的一部分。ECM的降解和重塑是血管生成、肿瘤细胞侵袭和转移等生理、病理过程的基本步骤[13]。在正常人体组织中，TFPI-2蛋白抑制纤溶酶和多种基质金属蛋白酶（MMPs）的活性，进而维持了ECM结构的完整性，抑制了血管的重塑[14]，这是抑制肿瘤侵袭和转移的重要机理[2, 15]。在乳腺癌[2, 16]、胃癌[6, 17-18]、非小细胞肺癌[19-20]、胰腺癌[21-22]、肝细胞癌[23]、宫颈癌[24]等多种恶性肿瘤组织中，TFPI-2蛋白的表达下调。研究[2]表明，表达失调的TFPI-2蛋白可能与肿瘤的进展相关。通过对喉鳞状细胞癌的研究[25]表明，TFPI-2蛋白通过抑制ECM的降解，可以使其癌细胞的侵袭和转移能力下降。
本实验从人胎盘组织中提取了TFPI-2基因，将其克隆在pEGFP-N3载体上，并通过双酶切法和DNA序列测定验证了所构建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体的正确性。Western blot法检测结果显示，稳定转染的细胞中TFPI-2蛋白的表达量明显高于空白对照组和未转染组，表明真核表达载体已成功整合入转染细胞。所选用的pEGFP-N3载体具有便于目的基因插入的多克隆位点，因而操作简便易行。本实验为进一步研究TFPI-2基因对肿瘤细胞的抑制作用提供了实验基础。
