引用本文： 吴骥, 管小青, 顾书成, 郑向欣, 侍孝红, 江小玲, 袁牧, 张旭旭. 乳腺浸润性导管癌组织中COX-2和Ki-67的表达及相关性分析. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(2): 197-201. doi: 10.7507/1007-9424.20140045 复制
近年来，乳腺癌的发病率呈持续上升的趋势，占女性所患全部恶性肿瘤的23%，全世界每年新发乳腺癌约150万例，尤其在大中城市渐成为女性首发的恶性肿瘤[1-2]。因此，深入研究乳腺癌发生的分子生物学机制，对于乳腺癌的防治具有重要意义。环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）在恶性肿瘤，如肝癌[3]、胃癌[4-6]、大肠癌[7]、胰腺癌[8]等的发病机制中起着非常重要的作用。COX-2能通过促进肿瘤新生血管形成和肿瘤细胞增殖[9]，从而影响肿瘤患者预后。Ki-67是一种存在于增殖细胞中的核抗原，与细胞的有丝分裂有关，其表达能反映肿瘤的增殖活性。研究[10]表明，Ki-67在多种恶性肿瘤中高表达，并与恶性肿瘤的发生、发展有关。浸润性导管癌是乳腺癌最常见的病理类型且预后差，在乳腺浸润性导管癌组织中COX-2和Ki-67表达的相关性临床上少见报道。因此，我们采用免疫组织化学方法检测乳腺浸润性导管癌组织中COX-2和Ki-67的表达，并分析两者之间的相关性及其与临床病理特征之间的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2008年1月至2013年1月期间在南京鼓楼医院集团宿迁市人民医院（徐州医学院附属宿迁医院）甲乳外科接受乳腺癌改良根治术且病理类型为浸润性导管癌的患者82例，均为女性；发病年龄34～66岁，（48.67±7.34）岁。绝经前患者48例，绝经后患者34例。依据2009年美国癌症联合会（AJCC）修订的乳腺癌分期（第7版）标准[11]进行TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期47例，Ⅲ期25例。肿块最大直径≤2 cm者23例，＞2 cm者59例。伴有腋窝淋巴结转移者48例，无腋窝淋巴结转移者34例。组织学分级：Ⅰ级18例，Ⅱ级43例，Ⅲ级21例。伴脉管侵犯者55例，无脉管侵犯者27例。术前均未经放疗、化疗及内分泌治疗。相应的距癌肿5 cm且经病理学证实的正常乳腺组织为对照组。所有病理诊断均经两位病理科副高以上专家阅片复核证实。
1.2 免疫组织化学方法
1.2.1 SP法
手术切除组织标本均用10%甲醛中性缓冲液固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片，行常规HE染色及免疫组织化学染色。鼠抗人COX-2单克隆抗体、鼠抗人Ki-67单克隆抗体、SP试剂盒及DAB底物显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。COX-2和Ki-67的抗体工作浓度均为1：100，实验步骤按试剂盒说明书进行。用PBS代替一抗作为染色的阴性对照，用已知的COX-2染色阳性的结肠癌组织和已知的Ki-67染色阳性的胃癌组织分别作为阳性对照。
1.2.2 结果判定标准
COX-2表达产物主要定位于细胞浆，肿瘤细胞浆出现棕黄色或黄褐色均匀颗粒为阳性细胞；Ki-67阳性细胞为核着色，少数为较弱的细胞质染色，呈棕黄色或黄褐色线性分布。取任意5个高倍镜（×400）视野中阳性细胞所占细胞总数比例的平均值为阳性细胞百分比，阳性细胞数＞5%为阳性（+），≤5%为阴性（―）。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析法，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 COX-2和Ki-67在乳腺浸润性导管癌组织和相应癌旁正常乳腺组织中的表达结果
COX-2和Ki-67的免疫组织化学染色结果见图 1。在82例乳腺浸润性导管癌组织中COX-2表达阳性率为71.95%（59/82），其在相应癌旁正常乳腺组织中的表达阳性率为8.54%（7/82），前者明显高于后者（χ2=68.56，P < 0.001）；Ki-67蛋白表达阳性率在乳腺浸润性导管癌组织和相应癌旁正常乳腺组织中分别为64.63%（53/82）和13.42%（11/82），前者明显高于后者（χ2=45.20，P < 0.001）。
图1
COX-2和Ki-67在乳腺浸润性导管癌组织中的阳性表达（SP ×100）。1A：COX-2；1B：Ki-67
Figure1.
Positive expressions of COX-2 and Ki-6 in invasive ductal carcinoma of breast (SP ×100). 1A:COX-2;1B:Ki-67
2.2 COX-2和Ki-67的表达与乳腺浸润性导管癌患者临床病理特征的关系
COX-2和Ki-67蛋白阳性表达与肿瘤临床TNM分期（rs=0.349，P < 0.05；rs=0.305，P < 0.05）、淋巴结转移（rs=0.336，P < 0.05；rs=0.419，P < 0.01）、脉管侵犯（rs=0.235，P < 0.05；rs=0.461，P < 0.01）及组织学分级（rs=0.434，P < 0.01；rs=0.378，P < 0.05）呈正相关；Ki-67蛋白阳性表达与肿瘤直径呈正相关（rs=0.365，P < 0.01），而COX-2蛋白阳性表达与此无关（rs=0.135，P > 0.05）。COX-2和Ki-67的表达皆与患者是否绝经无关（rs=0.172，P > 0.05；rs=0.163，P > 0.05），见表 1。
表1
COX-2和Ki-67在乳腺浸润性导管癌组织中的蛋白阳性表达与其临床病理特征的关系
Table1.
Relationship of positive expressions of COX-2 and Ki-67 to clinicopathologic features in invasive ductal carcinoma of breast
2.3 乳腺浸润性导管癌组织中COX-2和Ki-67表达的相关性
在82例乳腺浸润性导管癌组织中COX-2阳性表达而Ki-67阴性表达者13例（15.84%），COX-2阴性表达而Ki-67阳性表达者7例（8.54%）；两者均阳性表达者46例（56.10%），两者均阴性表达者16例（19.51%）；经统计学分析在浸润性导管癌组织中COX-2和Ki-67表达呈正相关性（rs=0.475，P < 0.01）。
3 讨论
3.1 COX-2与乳腺癌的关系
大量研究[12-14]发现，COX-2高表达与乳腺癌的发生、发展密切相关。COX-2通过介导前列腺素，尤其是前列腺素E2刺激肿瘤细胞的增殖，前列腺素E2在表皮生长因子的作用下刺激乳腺细胞增长，其作为上皮细胞分裂素通过增加雌激素水平直接刺激细胞增殖，芳香酶复合体与乳腺癌组织局部产生雌激素有关，COX-2催化的前列腺素E2可通过上调芳香酶活性，导致雌激素合成增加，从而使肿瘤细胞增殖[15]。COX-2可通过抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤新生血管生成及肿瘤细胞的侵袭和转移等促进肿瘤的发生、发展，COX-2调节肿瘤细胞增殖和凋亡的具体机制可能通过其下游的各种前列腺素受体包括膜受体（G蛋白偶联受体）和核内受体而发挥其相应的效应[16]，COX-2在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的作用，从早期的增生到转移的发生，COX-2的高表达贯穿于肿瘤发生、发展的整个过程[17]。郭贵龙等[18]的研究发现，在乳腺癌组织中46.8%的癌组织存在COX-2过表达，且COX-2阳性表达患者生存时间较短，与患者预后密切相关。另有研究[19]发现，MCF-7乳腺癌细胞表达的COX-2可诱导染色体组的不稳定、BCL-2的表达、对阿霉素等药物的耐药，从而促进乳腺癌的发生和进展，进一步提示COX-2将成为乳腺癌治疗和预防的靶点。
本研究结果发现，在浸润性导管癌组织中COX-2表达阳性率明显高于其癌旁正常组织（P < 0.001），该结果与文献[12-14, 18]报道相似；COX-2的阳性表达与肿瘤临床分期、淋巴结转移、脉管侵犯及组织学分级呈正相关（P < 0.05）；与肿瘤大小及患者绝经与否无关；提示COX-2高表达与乳腺浸润性导管癌的发生、发展密切相关。
3.2 Ki-67与乳腺癌的关系
Ki-67是1983年Gerdes等[20]用鼠源单克隆抗体检测一种来自霍奇金淋巴瘤系细胞核抗原时首次发现的，是一种能识别存在于增殖细胞核基质内的核蛋白，能够有效评估肿瘤细胞增殖活性的重要标志物。Ki-67在细胞周期活动期（G1晚期、S、G2和有丝分裂期）的增殖细胞中均有表达，但在静止细胞中不表达；Ki-67蛋白表达可反映肿瘤细胞增殖活性，是目前公认的肿瘤细胞增殖的特异性指标；而肿瘤的高增殖又与肿瘤的浸润生长和转移有关[21-22]。据文献[23]报道，40%的乳腺原位导管癌的Ki-67表达水平升高，其高表达水平还与乳腺癌病理分级、粉刺型坏死及微浸润相关，正常的乳腺组织和非癌性乳腺组织中也可表达Ki-67，但一般不超过3%。Santisteban等[24]检测了192例良性乳腺病组织，Ki-67表达的中位值是1.0%。von Minckwitz等[25]评价了196例乳腺癌患者新辅助治疗中Ki-67的预测作用，该研究发现，Ki-67表达水平低的患者对三苯氧胺的应答效果较好，而Ki-67高表达水平组的患者对三苯氧胺的治疗无额外受益。本研究小组[26]的结果发现，Ki-67在复发转移性乳腺癌组织中表达较其在原发性乳腺癌组织中的表达增高，提示该类患者预后不良。
本研究结果显示，Ki-67在乳腺浸润性导管癌组织中的表达阳性率为64.63%，相应癌旁正常乳腺组织中的表达阳性率为13.42%，与国内钱金锋等[22]的报道结果相似；同时，Ki-67阳性表达与脉管侵犯、组织学分级及肿瘤直径呈正相关；进一步表明Ki-67是反映乳腺癌生物学行为的可靠指标，可以作为判断肿瘤细胞增殖状态及评价乳腺癌预后的生物学指标。有关Ki-67表达与腋窝淋巴结转移的关系是目前研究的热点之一。本研究结果显示，Ki-67表达与患者腋窝淋巴结转移状态呈正相关，与谢春华等[27]的研究结果不一致，尚有待于大样本的进一步研究。
3.3 COX-2和Ki-67表达的相关性
本研究中将COX-2和Ki-67在82例乳腺浸润性导管癌组织中的表达情况进行了相关分析，发现二者的蛋白阳性表达之间呈正相关（rs=0.475，P < 0.01），但二者之间的具体作用机制尚不明确，这提示COX-2和Ki-67均可作为反映乳腺浸润性导管癌生物学行为的客观参考指标。COX-2有可能通过诱导Ki-67的表达升高来促进乳腺癌细胞的恶性增殖和分化，抑制癌细胞的凋亡，提示与乳腺癌的发生、发展密切相关[28]；COX-2和Ki-67在肿瘤形成过程中的内在关系尚需进一步研究。
综上所述，乳腺浸润性导管癌组织中COX-2和Ki-67的蛋白阳性表达呈显著正相关，并与乳腺浸润性导管癌患者的临床病理特征有密切关系，提示二者在乳腺浸润性导管癌发生、发展中发挥着重要作用，对两者进行联合检测，可作为反映其生物学行为的指标；选择性COX-2抑制剂的开发有望为肿瘤预防及治疗开辟新的途径。
近年来，乳腺癌的发病率呈持续上升的趋势，占女性所患全部恶性肿瘤的23%，全世界每年新发乳腺癌约150万例，尤其在大中城市渐成为女性首发的恶性肿瘤[1-2]。因此，深入研究乳腺癌发生的分子生物学机制，对于乳腺癌的防治具有重要意义。环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）在恶性肿瘤，如肝癌[3]、胃癌[4-6]、大肠癌[7]、胰腺癌[8]等的发病机制中起着非常重要的作用。COX-2能通过促进肿瘤新生血管形成和肿瘤细胞增殖[9]，从而影响肿瘤患者预后。Ki-67是一种存在于增殖细胞中的核抗原，与细胞的有丝分裂有关，其表达能反映肿瘤的增殖活性。研究[10]表明，Ki-67在多种恶性肿瘤中高表达，并与恶性肿瘤的发生、发展有关。浸润性导管癌是乳腺癌最常见的病理类型且预后差，在乳腺浸润性导管癌组织中COX-2和Ki-67表达的相关性临床上少见报道。因此，我们采用免疫组织化学方法检测乳腺浸润性导管癌组织中COX-2和Ki-67的表达，并分析两者之间的相关性及其与临床病理特征之间的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2008年1月至2013年1月期间在南京鼓楼医院集团宿迁市人民医院（徐州医学院附属宿迁医院）甲乳外科接受乳腺癌改良根治术且病理类型为浸润性导管癌的患者82例，均为女性；发病年龄34～66岁，（48.67±7.34）岁。绝经前患者48例，绝经后患者34例。依据2009年美国癌症联合会（AJCC）修订的乳腺癌分期（第7版）标准[11]进行TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期47例，Ⅲ期25例。肿块最大直径≤2 cm者23例，＞2 cm者59例。伴有腋窝淋巴结转移者48例，无腋窝淋巴结转移者34例。组织学分级：Ⅰ级18例，Ⅱ级43例，Ⅲ级21例。伴脉管侵犯者55例，无脉管侵犯者27例。术前均未经放疗、化疗及内分泌治疗。相应的距癌肿5 cm且经病理学证实的正常乳腺组织为对照组。所有病理诊断均经两位病理科副高以上专家阅片复核证实。
1.2 免疫组织化学方法
1.2.1 SP法
手术切除组织标本均用10%甲醛中性缓冲液固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片，行常规HE染色及免疫组织化学染色。鼠抗人COX-2单克隆抗体、鼠抗人Ki-67单克隆抗体、SP试剂盒及DAB底物显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。COX-2和Ki-67的抗体工作浓度均为1：100，实验步骤按试剂盒说明书进行。用PBS代替一抗作为染色的阴性对照，用已知的COX-2染色阳性的结肠癌组织和已知的Ki-67染色阳性的胃癌组织分别作为阳性对照。
1.2.2 结果判定标准
COX-2表达产物主要定位于细胞浆，肿瘤细胞浆出现棕黄色或黄褐色均匀颗粒为阳性细胞；Ki-67阳性细胞为核着色，少数为较弱的细胞质染色，呈棕黄色或黄褐色线性分布。取任意5个高倍镜（×400）视野中阳性细胞所占细胞总数比例的平均值为阳性细胞百分比，阳性细胞数＞5%为阳性（+），≤5%为阴性（―）。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析法，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 COX-2和Ki-67在乳腺浸润性导管癌组织和相应癌旁正常乳腺组织中的表达结果
COX-2和Ki-67的免疫组织化学染色结果见图 1。在82例乳腺浸润性导管癌组织中COX-2表达阳性率为71.95%（59/82），其在相应癌旁正常乳腺组织中的表达阳性率为8.54%（7/82），前者明显高于后者（χ2=68.56，P < 0.001）；Ki-67蛋白表达阳性率在乳腺浸润性导管癌组织和相应癌旁正常乳腺组织中分别为64.63%（53/82）和13.42%（11/82），前者明显高于后者（χ2=45.20，P < 0.001）。
图1
COX-2和Ki-67在乳腺浸润性导管癌组织中的阳性表达（SP ×100）。1A：COX-2；1B：Ki-67
Figure1.
Positive expressions of COX-2 and Ki-6 in invasive ductal carcinoma of breast (SP ×100). 1A:COX-2;1B:Ki-67
2.2 COX-2和Ki-67的表达与乳腺浸润性导管癌患者临床病理特征的关系
COX-2和Ki-67蛋白阳性表达与肿瘤临床TNM分期（rs=0.349，P < 0.05；rs=0.305，P < 0.05）、淋巴结转移（rs=0.336，P < 0.05；rs=0.419，P < 0.01）、脉管侵犯（rs=0.235，P < 0.05；rs=0.461，P < 0.01）及组织学分级（rs=0.434，P < 0.01；rs=0.378，P < 0.05）呈正相关；Ki-67蛋白阳性表达与肿瘤直径呈正相关（rs=0.365，P < 0.01），而COX-2蛋白阳性表达与此无关（rs=0.135，P > 0.05）。COX-2和Ki-67的表达皆与患者是否绝经无关（rs=0.172，P > 0.05；rs=0.163，P > 0.05），见表 1。
表1
COX-2和Ki-67在乳腺浸润性导管癌组织中的蛋白阳性表达与其临床病理特征的关系
Table1.
Relationship of positive expressions of COX-2 and Ki-67 to clinicopathologic features in invasive ductal carcinoma of breast
2.3 乳腺浸润性导管癌组织中COX-2和Ki-67表达的相关性
在82例乳腺浸润性导管癌组织中COX-2阳性表达而Ki-67阴性表达者13例（15.84%），COX-2阴性表达而Ki-67阳性表达者7例（8.54%）；两者均阳性表达者46例（56.10%），两者均阴性表达者16例（19.51%）；经统计学分析在浸润性导管癌组织中COX-2和Ki-67表达呈正相关性（rs=0.475，P < 0.01）。
3 讨论
3.1 COX-2与乳腺癌的关系
大量研究[12-14]发现，COX-2高表达与乳腺癌的发生、发展密切相关。COX-2通过介导前列腺素，尤其是前列腺素E2刺激肿瘤细胞的增殖，前列腺素E2在表皮生长因子的作用下刺激乳腺细胞增长，其作为上皮细胞分裂素通过增加雌激素水平直接刺激细胞增殖，芳香酶复合体与乳腺癌组织局部产生雌激素有关，COX-2催化的前列腺素E2可通过上调芳香酶活性，导致雌激素合成增加，从而使肿瘤细胞增殖[15]。COX-2可通过抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤新生血管生成及肿瘤细胞的侵袭和转移等促进肿瘤的发生、发展，COX-2调节肿瘤细胞增殖和凋亡的具体机制可能通过其下游的各种前列腺素受体包括膜受体（G蛋白偶联受体）和核内受体而发挥其相应的效应[16]，COX-2在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的作用，从早期的增生到转移的发生，COX-2的高表达贯穿于肿瘤发生、发展的整个过程[17]。郭贵龙等[18]的研究发现，在乳腺癌组织中46.8%的癌组织存在COX-2过表达，且COX-2阳性表达患者生存时间较短，与患者预后密切相关。另有研究[19]发现，MCF-7乳腺癌细胞表达的COX-2可诱导染色体组的不稳定、BCL-2的表达、对阿霉素等药物的耐药，从而促进乳腺癌的发生和进展，进一步提示COX-2将成为乳腺癌治疗和预防的靶点。
本研究结果发现，在浸润性导管癌组织中COX-2表达阳性率明显高于其癌旁正常组织（P < 0.001），该结果与文献[12-14, 18]报道相似；COX-2的阳性表达与肿瘤临床分期、淋巴结转移、脉管侵犯及组织学分级呈正相关（P < 0.05）；与肿瘤大小及患者绝经与否无关；提示COX-2高表达与乳腺浸润性导管癌的发生、发展密切相关。
3.2 Ki-67与乳腺癌的关系
Ki-67是1983年Gerdes等[20]用鼠源单克隆抗体检测一种来自霍奇金淋巴瘤系细胞核抗原时首次发现的，是一种能识别存在于增殖细胞核基质内的核蛋白，能够有效评估肿瘤细胞增殖活性的重要标志物。Ki-67在细胞周期活动期（G1晚期、S、G2和有丝分裂期）的增殖细胞中均有表达，但在静止细胞中不表达；Ki-67蛋白表达可反映肿瘤细胞增殖活性，是目前公认的肿瘤细胞增殖的特异性指标；而肿瘤的高增殖又与肿瘤的浸润生长和转移有关[21-22]。据文献[23]报道，40%的乳腺原位导管癌的Ki-67表达水平升高，其高表达水平还与乳腺癌病理分级、粉刺型坏死及微浸润相关，正常的乳腺组织和非癌性乳腺组织中也可表达Ki-67，但一般不超过3%。Santisteban等[24]检测了192例良性乳腺病组织，Ki-67表达的中位值是1.0%。von Minckwitz等[25]评价了196例乳腺癌患者新辅助治疗中Ki-67的预测作用，该研究发现，Ki-67表达水平低的患者对三苯氧胺的应答效果较好，而Ki-67高表达水平组的患者对三苯氧胺的治疗无额外受益。本研究小组[26]的结果发现，Ki-67在复发转移性乳腺癌组织中表达较其在原发性乳腺癌组织中的表达增高，提示该类患者预后不良。
本研究结果显示，Ki-67在乳腺浸润性导管癌组织中的表达阳性率为64.63%，相应癌旁正常乳腺组织中的表达阳性率为13.42%，与国内钱金锋等[22]的报道结果相似；同时，Ki-67阳性表达与脉管侵犯、组织学分级及肿瘤直径呈正相关；进一步表明Ki-67是反映乳腺癌生物学行为的可靠指标，可以作为判断肿瘤细胞增殖状态及评价乳腺癌预后的生物学指标。有关Ki-67表达与腋窝淋巴结转移的关系是目前研究的热点之一。本研究结果显示，Ki-67表达与患者腋窝淋巴结转移状态呈正相关，与谢春华等[27]的研究结果不一致，尚有待于大样本的进一步研究。
3.3 COX-2和Ki-67表达的相关性
本研究中将COX-2和Ki-67在82例乳腺浸润性导管癌组织中的表达情况进行了相关分析，发现二者的蛋白阳性表达之间呈正相关（rs=0.475，P < 0.01），但二者之间的具体作用机制尚不明确，这提示COX-2和Ki-67均可作为反映乳腺浸润性导管癌生物学行为的客观参考指标。COX-2有可能通过诱导Ki-67的表达升高来促进乳腺癌细胞的恶性增殖和分化，抑制癌细胞的凋亡，提示与乳腺癌的发生、发展密切相关[28]；COX-2和Ki-67在肿瘤形成过程中的内在关系尚需进一步研究。
综上所述，乳腺浸润性导管癌组织中COX-2和Ki-67的蛋白阳性表达呈显著正相关，并与乳腺浸润性导管癌患者的临床病理特征有密切关系，提示二者在乳腺浸润性导管癌发生、发展中发挥着重要作用，对两者进行联合检测，可作为反映其生物学行为的指标；选择性COX-2抑制剂的开发有望为肿瘤预防及治疗开辟新的途径。
