引用本文： 李威, 姜波健, 俞继卫. CD44与CD133蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(1): 21-28. doi: 10.7507/1007-9424.20140005 复制
在世界范围内胃癌是最常见的肿瘤之一，死亡率高，其发生、发展、浸润、转移以及复发的机理仍不明确[1]。虽然根治性切除是治愈的唯一办法，但总体术后5年生存率在多数国家仅为20%～25%。对伴有远处转移和广泛淋巴结转移的胃癌患者，仍缺乏有效的治疗手段[2]。
近年来，肿瘤干细胞理论使人们对肿瘤有了新的认识。研究[3]发现，胃肠道肿瘤或是一种干细胞疾病，可由干细胞突变而来。干细胞在肿瘤的发生、发展进程中实现自我更新和无限分化与增殖。肿瘤干细胞不仅能启动肿瘤发生，还参与肿瘤细胞的侵袭和转移。因此，对肿瘤干细胞来说，识别其特异性细胞表面标志物的研究已成为热点。CD44及CD133是近期研究较多的肿瘤标志物。研究[4]发现，两者极可能在胃肠癌干细胞参与肿瘤侵袭、转移机理中起重要作用。目前，已有研究[5]证明，在大多数的脑肿瘤、前列腺癌、肺癌、肠癌等组织中，均可以检测到有CD133+细胞和CD44+细胞的表达。然而，CD44与CD133可否作为胃癌肿瘤干细胞标志物仍存有争议[6]，但也有研究[7]表明，CD133+细胞和CD44+细胞具有肿瘤干细胞的多种生物学特征。本研究应用免疫组化染色方法检测了人胃癌原发病灶中CD133和CD44蛋白的表达，以分析相关临床病理因素对其表达的影响，进而分析CD133和CD44蛋白的表达与胃癌临床病理特征以及患者预后的关系。
1 资料和方法
1.1 病例资料和组织样本来源
经伦理委员审批后同意，选取上海交通大学医学院附属第三人民医院普外一科2007年7月年至2010年5月期间收治并获得随访的100例胃腺癌患者作为研究对象，男68例，女32例；年龄34～83岁，中位年龄59岁；均行胃癌根治术（D2、R0）；随访截止时间为2013年5月30日，失访率为0。新鲜标本获取经患者及其家属知情同意，取自切除的胃癌病灶或配对的距原发灶边缘5 cm以上并获得病理学检查证实的正常胃黏膜组织；术中严格遵循无瘤原则，避免挤压。所有患者术前均未行放疗或化疗。为减少手术因素影响，术后3个月内死亡患者未纳入该研究，排除年龄大于85岁以上高龄患者，所有入选者随访时间不少于3年。全部患者的临床病理资料根据日本胃癌学会胃癌治疗规范第12版标准[8]进行综合评估。
1.2 主要试剂
鼠抗人CD133单克隆抗体（德国美天旎Miltenyi Biotec公司），鼠抗人CD44单克隆抗体（美国Abcam公司），ABC试剂及二抗购自中国上海碧云天公司，其他所需试剂及染料如双氧水、蒸馏水、PBS、二甲苯、枸橼酸、苏木精等免疫组化配套试剂均由上海市第三人民医院病理科提供。
1.3 胃癌组织中CD133及CD44蛋白表达的检测
1.3.1 检测方法
采用免疫组化SABC法。将用10%甲醛固定、石蜡包埋的胃癌组织标本切片（每份标本行4μm连续贴邻切片）置58～60℃烤箱中60 min，固定标本。二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。30% H2O2＋蒸馏水10份混合，室温处理10 min以除去内源性过氧化物酶，将切片浸入pH 6.0的0.01 mol/L柠檬酸缓冲液中，放于微波炉，中火3 min行抗原修复。随后用PBS冲洗3次；滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液，室温20 min后，甩去多余液体，不洗。滴加一抗，CD44单克隆抗体稀释度为1∶200，CD133单克隆抗体稀释度为1∶40。滴注一抗后，4℃过夜。PBS冲洗后滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，5～10 min。PBS冲洗后滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC），37℃20 min，PBS冲洗后用二氨基联苯胺（DAB）染色，取1 mL蒸馏水，加试剂盒中DAB显色剂ABC试剂各1滴，混匀后加至切片。室温下显色，镜下控制反应时间20 min。苏木精复染1 min。脱水、透明、封片。以试剂公司提供的已知阳性切片作为阳性对照，以PBS替代一抗作为阴性对照。
1.3.2 结果判定标准CD44及CD133蛋白表达
阳性细胞，其细胞膜染色均呈棕黄色。由两个病理科医师在未知临床病理资料下读取结果，并协商取得统一。结果判断标准：有棕褐色或棕黄色着色者为阳性。每张组织切片随机选5个高倍视野，计数500个细胞，其阳性细胞数＜5%者判为阴性，≥5%为阳性，其中5%～25%为弱阳性，25%～50%为中阳性，＞50%为强阳性。
1.4 统计学方法
采用SPSS 21.0软件行统计学处理。CD44和CD133蛋白的表达与胃癌临床病理特征间的关系行Pearson χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier方法；生存率的统计分析采用log-rank方法；影响预后的多因素分析采用Cox风险回归方法。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 胃癌组织中CD133及CD44蛋白表达检测结果
CD44及CD133蛋白在胃癌组织中均有广泛表达，光镜下见CD44和CD133蛋白主要定位表达于细胞膜，细胞浆可见少量CD44和CD133蛋白表达；而距胃癌原发灶边缘5 cm以上的正常胃黏膜组织中CD44和CD133蛋白表达为阴性（图 1）。本组100例胃癌患者中59例（59.0%）CD44蛋白呈阳性表达，49例（49.0%）CD133蛋白呈阳性表达。
图1
示胃癌原发灶及正常胃黏膜组织中CD44和CD133蛋白的表达。1A：胃癌组织中CD44蛋白呈阳性表达（SABC法×400）；1B：正常胃黏膜组织中CD44蛋白呈阴性表达（SABC法×100）；1C：胃癌组织中CD133蛋白呈阳性表达（SABC法×400）；1D：正常胃黏膜组织中CD133蛋白呈阴性表达（SABC法×100）
Figure1.
Expressions of CD44 and CD133 protein in gastric cancer and normal gastric mucosa tissues. 1A:Positive expression of CD44 in gastric cancer tissues (SABC×400); 1B:Negative expression of CD44 in normal gastric mucosa tissues (SABC×100);1C:Positive expression of CD133 in gastric cancer tissues (SABC×400);1D:Negative expression of CD133 in normal gastric mucosa tissues (SABC×100)
2.2 胃癌组织中CD44及CD133蛋白表达与胃癌临床病理特征间的关系
结果见表 1。由表 1可见，胃癌组织中CD44及CD133蛋白的表达与胃癌患者的年龄和性别无关（P＞0.05），但与肿瘤大小、组织学分级、血管浸润、淋巴管浸润、肿瘤T分期、N分期以及pTNM分期均有关（P＜0.05），其中，肿瘤直径越大、组织学分级越高、有血管浸润、有淋巴管浸润、有淋巴结转移、肿瘤浸润得越深以及pTNM分期越高，其CD44和CD133蛋白表达阳性率越高。
表1
胃癌组织中CD44和CD133蛋白的表达与胃癌患者的临床病理特征的关系
Table1.
Relationship between the expressions of CD44 and CD133 protein and clinicopathologic features of patients with gastric cancer
CD44及CD133蛋白呈双阳性表达与胃癌临床病理特征的关系结果见表 2。由表 2可见，两者呈双阳性表达与患者的年龄及性别、肿瘤组织学分级以及血管浸润无关，但与肿瘤大小、淋巴管浸润、肿瘤T分期、N分期以及pTNM分期有关。其中，肿瘤直径越大（P=0.010），有淋巴管浸润（P=0.003），有淋巴结转移（P=0.045），肿瘤的浸润越深（P=0.041），pTNM分期越高（P=0.049），CD44+ CD133+双阳性表达率越高。
表2
CD44及CD133蛋白双阳性表达和胃癌患者临床病理特征的关系
Table2.
Relationship between co-expression of CD44 and CD133 protein and clinicopathologic features of patients with gastric cancer
2.3 CD44蛋白与CD133蛋白表达的关系
Spearman等级相关分析示CD44蛋白与CD133蛋白表达呈正相关关系（r=0.207，P=0.039）。
2.4 生存分析结果
本组患者均获3～5年随访，平均48个月。单因素分析显示，CD44阳性表达（P=0.005）、CD133阳性表达（P=0.002）及CD44+ CD133+双阳性表达（P＜0.001）与患者的3年生存率均有关，经log-rank法检验各组3年生存率差异具有统计学意义（P＜0.05）；与单一的CD44或CD133阳性表达相比，CD44和CD133双阳性表达提示预后更差（P＜0.001），见图 2。
图2
CD44和CD133蛋白单独表达以及共同表达与胃癌患者术后生存的关系。2A：CD44+者与CD44-者比较；2B：CD133+者与CD133-者比较；2C：CD44+CD133+者与其他患者比较，其他组包括CD44-CD133-、CD44+CD133-以及CD44-和CD133+者
Figure2.
Relationship between the survival postoperative patients of gastric cancer with expression of CD44 protein or CD133 protein or Co-expression of them. 2A:CD44+vs. CD44-; 2B:CD133+vs. CD133-; 2C:CD44+CD133+vs. Other group; Other group include the CD44-CD133-, CD44+CD133-, and CD44-CD133+ patients
胃癌组织中CD44及CD133双阳性表达的log-istic回归分析提示，CD44与CD133蛋白双阳性表达是淋巴结转移（P=0.038）的独立危险因素（表 3）。Cox风险回归多因素生存分析显示，淋巴结转移（P=0.006）及CD44和CD133双阳性表达（P=0.003）为影响患者术后生存的独立预后因素（表 4）。
表3
胃癌组织中CD44及CD133蛋白双阳性表达与胃癌患者临床病理特征关系的logistic回归分析结果
Table3.
Results of logistic regression analysis for relationship between co-expression of CD44 and CD133 and clinicopathologic features of patients with gastric cancer
表4
Cox回归模型多因素生存分析结果
Table4.
Results of Cox proportional hazards model for survival analysis
3 讨论
肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的极少部分具有干细胞性质的细胞群体，具有自我更新能力和多向分化潜能。肿瘤干细胞学说认为，肿瘤干细胞是肿瘤形成及其不断生长的根源[9]。肿瘤干细胞最先发现在急性粒细胞白血病中。Bonnet等[10]成功分离出CD34+CD38-表型的急性髓细胞白血病（AML）细胞，并验证了极少量肿瘤干细胞在NOD/SCID小鼠体内的致瘤过程。研究肿瘤干细胞特异性以及相关的细胞表面标志物已成为近年的研究热点，而其中CD44与CD133是备受关注的肿瘤特异性标志物。CD133抗原是一个相对分子量为120×103的5次跨膜糖蛋白，包括细胞膜外的氨基末端、2个短的细胞内环和2个长的细胞外环以及细胞内的羧基末端，主要分布在细胞膜突部分。CD133在不同的肿瘤组织或胚胎组织中的表达情况不同，主要特异性表达于组织干细胞群或肿瘤干细胞亚群中[11]。CD44分子作为一种细胞黏附分子，其正常功能是介导淋巴细胞的归巢、淋巴细胞向炎症部位和黏膜相关淋巴组织归位、黏附细胞外基质等[12]。研究[13]发现，两者极可能在胃肠癌干细胞参与肿瘤侵袭以及转移机理中起重要作用，并与肿瘤的发生、侵袭、转移、耐药以及复发有密切关系。因此，深入了解CD44与CD133的分子生物学特性，对寻求有效的抗癌治疗尤其是对肿瘤干细胞的靶向治疗具有深远的意义。
对于这两种肿瘤干细胞标志物，有文献[14-15]报道称CD44与CD133可作为结直肠癌肿瘤干细胞良好的标志物，并且联合两者能更好地分选和纯化结直肠癌肿瘤干细胞。研究[16]发现，CD44与CD133在结直肠癌伴早期肝转移的患者中的表达明显高于不伴肝转移组，且经单因素与多因素生存分析表明，CD133与CD44的共表达程度与患者预后情况呈负相关，通过对患者的年龄、Dukes分期及淋巴结转移的多因素分析发现，CD133与CD44共表达是影响患者预后的独立因素，提示CD133与CD44在结肠癌伴早期肝转移的肿瘤细胞中的共表达可作为判断结肠癌早期肝转移的重要肿瘤标志物。研究[17-18]显示，CD44可作为非典型WNT信号通路的靶向基因，密切联系并参与肿瘤细胞生物学进程（如浸润、转移）及病理学过程。本课题组前期研究[19]发现，CXCR4能通过PI3K/Akt通路上调肿瘤起始细胞标志物CD133的表达；而CD133+细胞能促进胃癌增殖和侵袭能力的增强[20]。本实验应用免疫组化方法检测胃癌组织中CD44及CD133的表达，发现两者表达阳性率在有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组，且两者的阳性表达提示胃癌肿瘤分期较晚、患者预后差，是影响胃癌患者预后的独立因素。有研究[21-22]发现，多种肿瘤干细胞标志物的组合可进一步识别肿瘤干细胞表型，并可分离一种甚至多种致瘤亚群。因此，对CD44及CD133两种肿瘤干细胞标志物在胃癌肿瘤组织中的生物学功能、两者间共表达可能存在的交互作用的机理及其与临床病理特征的关系的研究备受瞩目。
本实验检测了CD44及CD133这两种肿瘤干细胞标志物在胃癌组织中的表达与分布情况。CD44阳性细胞细胞膜染色，CD133阳性细胞顶端膜染色，两者细胞浆均不染色。本实验检测胃癌组织中有59.0%的CD44以及49.0%的CD133呈阳性表达，这两种标志物主要高表达于癌巢区域，且其表达阳性率与肿瘤大小、组织学分级、血管浸润、淋巴管浸润、淋巴结转移以及肿瘤TMN分期均有关（P＜0.05），即肿瘤直径越大、组织学分级越高、有血管浸润、有淋巴管浸润、有淋巴结转移以及肿瘤浸润越深，其CD44和CD133表达阳性率越高。Cox回归分析发现，有淋巴结转移者以及CD44和CD133共表达提示患者的预后较差。该结果与国外相关文献[23-25]报道结果相一致。同时经Spearman等级相关分析发现，CD44蛋白的表达与CD133蛋白的表达呈正相关关系（r=0.207，P=0.039），提示CD44与CD133的表达可能存在一定的协同作用，通过某种机理将两者联合起来，从而促使肿瘤细胞的黏附力降低，迁移率提高，从而提高了肿瘤的侵袭与转移潜能。因此，两者的联合作用促进了肿瘤的浸润与转移。另外，与CD44或CD133单一预测因素相比，该两种标志物的共表达或更可能是一独立的预后判断因素。
综上所述，对CD44及CD133蛋白在癌组织中共表达的检测可能是预判肿瘤复发和转移的可行方法，并对胃癌转移和复发的机理研究提供初步的临床数据分析，进而为寻找新的靶向治疗提供新的潜在靶点。
在世界范围内胃癌是最常见的肿瘤之一，死亡率高，其发生、发展、浸润、转移以及复发的机理仍不明确[1]。虽然根治性切除是治愈的唯一办法，但总体术后5年生存率在多数国家仅为20%～25%。对伴有远处转移和广泛淋巴结转移的胃癌患者，仍缺乏有效的治疗手段[2]。
近年来，肿瘤干细胞理论使人们对肿瘤有了新的认识。研究[3]发现，胃肠道肿瘤或是一种干细胞疾病，可由干细胞突变而来。干细胞在肿瘤的发生、发展进程中实现自我更新和无限分化与增殖。肿瘤干细胞不仅能启动肿瘤发生，还参与肿瘤细胞的侵袭和转移。因此，对肿瘤干细胞来说，识别其特异性细胞表面标志物的研究已成为热点。CD44及CD133是近期研究较多的肿瘤标志物。研究[4]发现，两者极可能在胃肠癌干细胞参与肿瘤侵袭、转移机理中起重要作用。目前，已有研究[5]证明，在大多数的脑肿瘤、前列腺癌、肺癌、肠癌等组织中，均可以检测到有CD133+细胞和CD44+细胞的表达。然而，CD44与CD133可否作为胃癌肿瘤干细胞标志物仍存有争议[6]，但也有研究[7]表明，CD133+细胞和CD44+细胞具有肿瘤干细胞的多种生物学特征。本研究应用免疫组化染色方法检测了人胃癌原发病灶中CD133和CD44蛋白的表达，以分析相关临床病理因素对其表达的影响，进而分析CD133和CD44蛋白的表达与胃癌临床病理特征以及患者预后的关系。
1 资料和方法
1.1 病例资料和组织样本来源
经伦理委员审批后同意，选取上海交通大学医学院附属第三人民医院普外一科2007年7月年至2010年5月期间收治并获得随访的100例胃腺癌患者作为研究对象，男68例，女32例；年龄34～83岁，中位年龄59岁；均行胃癌根治术（D2、R0）；随访截止时间为2013年5月30日，失访率为0。新鲜标本获取经患者及其家属知情同意，取自切除的胃癌病灶或配对的距原发灶边缘5 cm以上并获得病理学检查证实的正常胃黏膜组织；术中严格遵循无瘤原则，避免挤压。所有患者术前均未行放疗或化疗。为减少手术因素影响，术后3个月内死亡患者未纳入该研究，排除年龄大于85岁以上高龄患者，所有入选者随访时间不少于3年。全部患者的临床病理资料根据日本胃癌学会胃癌治疗规范第12版标准[8]进行综合评估。
1.2 主要试剂
鼠抗人CD133单克隆抗体（德国美天旎Miltenyi Biotec公司），鼠抗人CD44单克隆抗体（美国Abcam公司），ABC试剂及二抗购自中国上海碧云天公司，其他所需试剂及染料如双氧水、蒸馏水、PBS、二甲苯、枸橼酸、苏木精等免疫组化配套试剂均由上海市第三人民医院病理科提供。
1.3 胃癌组织中CD133及CD44蛋白表达的检测
1.3.1 检测方法
采用免疫组化SABC法。将用10%甲醛固定、石蜡包埋的胃癌组织标本切片（每份标本行4μm连续贴邻切片）置58～60℃烤箱中60 min，固定标本。二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。30% H2O2＋蒸馏水10份混合，室温处理10 min以除去内源性过氧化物酶，将切片浸入pH 6.0的0.01 mol/L柠檬酸缓冲液中，放于微波炉，中火3 min行抗原修复。随后用PBS冲洗3次；滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液，室温20 min后，甩去多余液体，不洗。滴加一抗，CD44单克隆抗体稀释度为1∶200，CD133单克隆抗体稀释度为1∶40。滴注一抗后，4℃过夜。PBS冲洗后滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，5～10 min。PBS冲洗后滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC），37℃20 min，PBS冲洗后用二氨基联苯胺（DAB）染色，取1 mL蒸馏水，加试剂盒中DAB显色剂ABC试剂各1滴，混匀后加至切片。室温下显色，镜下控制反应时间20 min。苏木精复染1 min。脱水、透明、封片。以试剂公司提供的已知阳性切片作为阳性对照，以PBS替代一抗作为阴性对照。
1.3.2 结果判定标准CD44及CD133蛋白表达
阳性细胞，其细胞膜染色均呈棕黄色。由两个病理科医师在未知临床病理资料下读取结果，并协商取得统一。结果判断标准：有棕褐色或棕黄色着色者为阳性。每张组织切片随机选5个高倍视野，计数500个细胞，其阳性细胞数＜5%者判为阴性，≥5%为阳性，其中5%～25%为弱阳性，25%～50%为中阳性，＞50%为强阳性。
1.4 统计学方法
采用SPSS 21.0软件行统计学处理。CD44和CD133蛋白的表达与胃癌临床病理特征间的关系行Pearson χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier方法；生存率的统计分析采用log-rank方法；影响预后的多因素分析采用Cox风险回归方法。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 胃癌组织中CD133及CD44蛋白表达检测结果
CD44及CD133蛋白在胃癌组织中均有广泛表达，光镜下见CD44和CD133蛋白主要定位表达于细胞膜，细胞浆可见少量CD44和CD133蛋白表达；而距胃癌原发灶边缘5 cm以上的正常胃黏膜组织中CD44和CD133蛋白表达为阴性（图 1）。本组100例胃癌患者中59例（59.0%）CD44蛋白呈阳性表达，49例（49.0%）CD133蛋白呈阳性表达。
图1
示胃癌原发灶及正常胃黏膜组织中CD44和CD133蛋白的表达。1A：胃癌组织中CD44蛋白呈阳性表达（SABC法×400）；1B：正常胃黏膜组织中CD44蛋白呈阴性表达（SABC法×100）；1C：胃癌组织中CD133蛋白呈阳性表达（SABC法×400）；1D：正常胃黏膜组织中CD133蛋白呈阴性表达（SABC法×100）
Figure1.
Expressions of CD44 and CD133 protein in gastric cancer and normal gastric mucosa tissues. 1A:Positive expression of CD44 in gastric cancer tissues (SABC×400); 1B:Negative expression of CD44 in normal gastric mucosa tissues (SABC×100);1C:Positive expression of CD133 in gastric cancer tissues (SABC×400);1D:Negative expression of CD133 in normal gastric mucosa tissues (SABC×100)
2.2 胃癌组织中CD44及CD133蛋白表达与胃癌临床病理特征间的关系
结果见表 1。由表 1可见，胃癌组织中CD44及CD133蛋白的表达与胃癌患者的年龄和性别无关（P＞0.05），但与肿瘤大小、组织学分级、血管浸润、淋巴管浸润、肿瘤T分期、N分期以及pTNM分期均有关（P＜0.05），其中，肿瘤直径越大、组织学分级越高、有血管浸润、有淋巴管浸润、有淋巴结转移、肿瘤浸润得越深以及pTNM分期越高，其CD44和CD133蛋白表达阳性率越高。
表1
胃癌组织中CD44和CD133蛋白的表达与胃癌患者的临床病理特征的关系
Table1.
Relationship between the expressions of CD44 and CD133 protein and clinicopathologic features of patients with gastric cancer
CD44及CD133蛋白呈双阳性表达与胃癌临床病理特征的关系结果见表 2。由表 2可见，两者呈双阳性表达与患者的年龄及性别、肿瘤组织学分级以及血管浸润无关，但与肿瘤大小、淋巴管浸润、肿瘤T分期、N分期以及pTNM分期有关。其中，肿瘤直径越大（P=0.010），有淋巴管浸润（P=0.003），有淋巴结转移（P=0.045），肿瘤的浸润越深（P=0.041），pTNM分期越高（P=0.049），CD44+ CD133+双阳性表达率越高。
表2
CD44及CD133蛋白双阳性表达和胃癌患者临床病理特征的关系
Table2.
Relationship between co-expression of CD44 and CD133 protein and clinicopathologic features of patients with gastric cancer
2.3 CD44蛋白与CD133蛋白表达的关系
Spearman等级相关分析示CD44蛋白与CD133蛋白表达呈正相关关系（r=0.207，P=0.039）。
2.4 生存分析结果
本组患者均获3～5年随访，平均48个月。单因素分析显示，CD44阳性表达（P=0.005）、CD133阳性表达（P=0.002）及CD44+ CD133+双阳性表达（P＜0.001）与患者的3年生存率均有关，经log-rank法检验各组3年生存率差异具有统计学意义（P＜0.05）；与单一的CD44或CD133阳性表达相比，CD44和CD133双阳性表达提示预后更差（P＜0.001），见图 2。
图2
CD44和CD133蛋白单独表达以及共同表达与胃癌患者术后生存的关系。2A：CD44+者与CD44-者比较；2B：CD133+者与CD133-者比较；2C：CD44+CD133+者与其他患者比较，其他组包括CD44-CD133-、CD44+CD133-以及CD44-和CD133+者
Figure2.
Relationship between the survival postoperative patients of gastric cancer with expression of CD44 protein or CD133 protein or Co-expression of them. 2A:CD44+vs. CD44-; 2B:CD133+vs. CD133-; 2C:CD44+CD133+vs. Other group; Other group include the CD44-CD133-, CD44+CD133-, and CD44-CD133+ patients
胃癌组织中CD44及CD133双阳性表达的log-istic回归分析提示，CD44与CD133蛋白双阳性表达是淋巴结转移（P=0.038）的独立危险因素（表 3）。Cox风险回归多因素生存分析显示，淋巴结转移（P=0.006）及CD44和CD133双阳性表达（P=0.003）为影响患者术后生存的独立预后因素（表 4）。
表3
胃癌组织中CD44及CD133蛋白双阳性表达与胃癌患者临床病理特征关系的logistic回归分析结果
Table3.
Results of logistic regression analysis for relationship between co-expression of CD44 and CD133 and clinicopathologic features of patients with gastric cancer
表4
Cox回归模型多因素生存分析结果
Table4.
Results of Cox proportional hazards model for survival analysis
3 讨论
肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的极少部分具有干细胞性质的细胞群体，具有自我更新能力和多向分化潜能。肿瘤干细胞学说认为，肿瘤干细胞是肿瘤形成及其不断生长的根源[9]。肿瘤干细胞最先发现在急性粒细胞白血病中。Bonnet等[10]成功分离出CD34+CD38-表型的急性髓细胞白血病（AML）细胞，并验证了极少量肿瘤干细胞在NOD/SCID小鼠体内的致瘤过程。研究肿瘤干细胞特异性以及相关的细胞表面标志物已成为近年的研究热点，而其中CD44与CD133是备受关注的肿瘤特异性标志物。CD133抗原是一个相对分子量为120×103的5次跨膜糖蛋白，包括细胞膜外的氨基末端、2个短的细胞内环和2个长的细胞外环以及细胞内的羧基末端，主要分布在细胞膜突部分。CD133在不同的肿瘤组织或胚胎组织中的表达情况不同，主要特异性表达于组织干细胞群或肿瘤干细胞亚群中[11]。CD44分子作为一种细胞黏附分子，其正常功能是介导淋巴细胞的归巢、淋巴细胞向炎症部位和黏膜相关淋巴组织归位、黏附细胞外基质等[12]。研究[13]发现，两者极可能在胃肠癌干细胞参与肿瘤侵袭以及转移机理中起重要作用，并与肿瘤的发生、侵袭、转移、耐药以及复发有密切关系。因此，深入了解CD44与CD133的分子生物学特性，对寻求有效的抗癌治疗尤其是对肿瘤干细胞的靶向治疗具有深远的意义。
对于这两种肿瘤干细胞标志物，有文献[14-15]报道称CD44与CD133可作为结直肠癌肿瘤干细胞良好的标志物，并且联合两者能更好地分选和纯化结直肠癌肿瘤干细胞。研究[16]发现，CD44与CD133在结直肠癌伴早期肝转移的患者中的表达明显高于不伴肝转移组，且经单因素与多因素生存分析表明，CD133与CD44的共表达程度与患者预后情况呈负相关，通过对患者的年龄、Dukes分期及淋巴结转移的多因素分析发现，CD133与CD44共表达是影响患者预后的独立因素，提示CD133与CD44在结肠癌伴早期肝转移的肿瘤细胞中的共表达可作为判断结肠癌早期肝转移的重要肿瘤标志物。研究[17-18]显示，CD44可作为非典型WNT信号通路的靶向基因，密切联系并参与肿瘤细胞生物学进程（如浸润、转移）及病理学过程。本课题组前期研究[19]发现，CXCR4能通过PI3K/Akt通路上调肿瘤起始细胞标志物CD133的表达；而CD133+细胞能促进胃癌增殖和侵袭能力的增强[20]。本实验应用免疫组化方法检测胃癌组织中CD44及CD133的表达，发现两者表达阳性率在有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组，且两者的阳性表达提示胃癌肿瘤分期较晚、患者预后差，是影响胃癌患者预后的独立因素。有研究[21-22]发现，多种肿瘤干细胞标志物的组合可进一步识别肿瘤干细胞表型，并可分离一种甚至多种致瘤亚群。因此，对CD44及CD133两种肿瘤干细胞标志物在胃癌肿瘤组织中的生物学功能、两者间共表达可能存在的交互作用的机理及其与临床病理特征的关系的研究备受瞩目。
本实验检测了CD44及CD133这两种肿瘤干细胞标志物在胃癌组织中的表达与分布情况。CD44阳性细胞细胞膜染色，CD133阳性细胞顶端膜染色，两者细胞浆均不染色。本实验检测胃癌组织中有59.0%的CD44以及49.0%的CD133呈阳性表达，这两种标志物主要高表达于癌巢区域，且其表达阳性率与肿瘤大小、组织学分级、血管浸润、淋巴管浸润、淋巴结转移以及肿瘤TMN分期均有关（P＜0.05），即肿瘤直径越大、组织学分级越高、有血管浸润、有淋巴管浸润、有淋巴结转移以及肿瘤浸润越深，其CD44和CD133表达阳性率越高。Cox回归分析发现，有淋巴结转移者以及CD44和CD133共表达提示患者的预后较差。该结果与国外相关文献[23-25]报道结果相一致。同时经Spearman等级相关分析发现，CD44蛋白的表达与CD133蛋白的表达呈正相关关系（r=0.207，P=0.039），提示CD44与CD133的表达可能存在一定的协同作用，通过某种机理将两者联合起来，从而促使肿瘤细胞的黏附力降低，迁移率提高，从而提高了肿瘤的侵袭与转移潜能。因此，两者的联合作用促进了肿瘤的浸润与转移。另外，与CD44或CD133单一预测因素相比，该两种标志物的共表达或更可能是一独立的预后判断因素。
综上所述，对CD44及CD133蛋白在癌组织中共表达的检测可能是预判肿瘤复发和转移的可行方法，并对胃癌转移和复发的机理研究提供初步的临床数据分析，进而为寻找新的靶向治疗提供新的潜在靶点。
