细胞外基质（extracellular matrix，ECM）为固有细胞提供独特的组织特异性微环境，具有组织结构和生化信号传导所需的功能。脱细胞基质（decellularized extracellular matrix，dECM）旨在去除介导免疫排斥的细胞，保留原组织结构和基质功能。dECM 在组织工程应用上受到广泛关注，已成为一种新兴且成熟的生物材料。本文总结了脱细胞方法的代表性方案，探讨了脱细胞组织衍生材料及生物墨水在胸心外科领域的最新应用，分析了目前 dECM 面临的问题和挑战，并展望了未来的发展趋势。
组织工程技术快速发展给组织或器官的修复与重建带来了新希望。一种生物相容性好，利于细胞生长与增殖的组织工程支架是成功构建组织工程器官的关键[1]。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是由细胞合成并分泌的多种生物大分子（如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖等）所构成的高度动态且精密有序的3D网状结构，是细胞特有的适宜生长的天然支架，为固有细胞创造了独特的组织特异性微环境[2]。此外，ECM 还提供了在具体组织发挥功能所必需的结构和生化信号，具有调节细胞增殖、分化、迁移、稳态和形态发生的功能[3-4]。
脱细胞技术被广泛应用于组织工程研究领域，脱细胞基质（decellularized extracellular matrix，dECM）的研究逐渐成为组织工程支架构建的热点方向[5-8]。脱细胞是从组织/器官去除细胞成分，同时保留结构和基质功能，并创建 ECM 衍生支架[9]。dECM 具有低免疫原性、利于细胞粘附、支持细胞分化及增殖，能够促进体内组织修复和再生，并为细胞生长提供较为理想的微环境[10]。dECM 的功能主要取决于供体组织脱细胞的有效性，以及组织或器官经脱细胞处理后保留的 ECM 特性。脱细胞骨、软骨、肌肉、肌腱、血管等简单组织和心、肝、肺、肾等复杂器官已经应用于组织工程和再生医学领域，大量相关研究涵盖了各种形式的 dECM （如水凝胶、生物墨水和多孔组织结构）及其应用取得了优异的成果，展现出了巨大的应用前景[11-12]。
dECM 生物材料是组织工程和再生医学的前沿领域。本文介绍了主流的脱细胞策略，探讨了脱细胞过程对组织或器官机械性能和生物特性的影响，总结了 dECM 主要应用形式，并调查了脱细胞组织/器官在胸心外科领域的应用研究。
1 脱细胞基质的制备和表征
组织或器官通过脱细胞处理，来破坏其中细胞的细胞膜，诱导细胞死亡，去除细胞成分[13]。常用的脱细胞方法有：物理方法、化学方法和生物方法等（表1）。为了确定组织或器官脱细胞的效果，Crapo 等[14]提出了评估 dECM 的最低标准，包括:（1）每 1 mg 干燥 ECM 中 dECM 必须含有少于 50 ng 的 DNA；（2）DNA 片段的长度少于200对核苷酸；（3）用 DAPI 或苏木精和伊红染色的组织切片不含有微量遗传物质。该标准确定了植入宿主机体后诱导免疫应答的阈值，降低了免疫排斥的发生。除了细胞 DNA 和遗传物质，还需要评估蛋白质和其他 ECM 成分（如胶原蛋白、糖胺聚糖和生长因子）以及机械性能（如拉伸强度、弹性模量、粘性模量和刚度）[15]。
表1
脱细胞基质的制备方法
采用单纯的物理方法防止ECM结构的破坏，脱细胞过程久且效果不佳[16]。去污剂法旨在溶解细胞膜、解离 DNA 和破坏脂质-蛋白质相互作用，以达到脱细胞化的效果，但组织长时间的暴露对细胞毒性和成分的破坏较大[16]。酶通过切割细胞-细胞/ECM 相互作用和核酸来去除细胞和遗传物质。然而，单独的酶作用不能达到完全脱细胞，且长时间暴露会破坏 ECM 结构和蛋白质[17]。因此，研究者[18]尝试联合法提高组织/器官中细胞和遗传物质去除的效率以及基质有效成分的保留。主流的联合法是去污剂联合酶法（detergent-enzymatic method，DEM），有效去除细胞成分的同时减少对 ECM 的影响以及提高生长因子的保留，因此这种方法所制备的 dECM 不仅具有较低的免疫原性，还有良好的生物相容性与生物活性[19-20]。
为了缩短脱细胞的时间，进一步减少 ECM 有效成分的流失与破坏，研究者[21-23]尝试将物理方法与 DEM 相结合。Baiguera 等[24]将固定的气管放入灌流生物反应器中进行 DEM 脱细胞方案，与单纯的 DEM 相比，该法通过增加溶液扩散，去除细胞成分的同时有效缩短了脱细胞时间。Mazza 等[25]首次报道了 DEM 方案（胰蛋白酶-EDTA、SDS、Triton X-100、过氧乙酸和乙醇）处理肝脏左叶2周，结果显示 DNA 含量显著减少，细胞碎片的去除及组织结构的保留。Mazza 等[26]在 DEM 方案的基础上通过使用高搅拌速度，快速使肝组织立方体（125 mm3）脱细胞化，将完全脱细胞时间成功缩短至3 h。此外，真空辅助脱细胞加速脱细胞过程，并降低了长期保存引起的 dECM 缺失。Friedrich 等[27]在 508 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）的真空压力下结合 DEM 法，更快且有效制备脱细胞肌肉基质，其不仅具有较低的 DNA 含量，还保留了与原生组织相似的 ECM 成分、细胞相容性和生物力学特性。
因此，联合方案进行脱细胞能够缩短 ECM 暴露去污剂和处理的时间，以及开发的 dECM 不仅作为适宜的细胞载体，而且调节细胞行为和组织再生。目前研究了很多不同的脱细胞策略，但是由于组织/器官特异性，尚无个性化的脱细胞方案的共识，需要进一步研究制备理想的 dECM，支持细胞-细胞相互作用，使细胞可以粘附、增殖和分化，并适应复杂器官的结构要求。
2 脱细胞基质的应用形式
dECM 有两种应用形式：完整的器官支架和松散的 dECM 组织。整个器官脱细胞后保留3D结构和血管网络，其功能通过再细胞化重新实现[39-40]；另一种形式是通过分离纯化和灭菌的松散 dECM 组织制备的 dECM 粉末和水凝胶/生物墨水[41]。在需要结构和机械完整性的应用中，完整的 dECM 优于进一步处理的 dECM，但粉末处理的 dECM 提供了完整组织所不能提供的益处。包括填充区域并塑造组织缺损的形状，以及其顺应能力允许微创植入手术等。
脱细胞支架通过保留 ECM 有效成分和纤维结构以模拟体内微环境，并通过释放生物活性物质来促进内源性募集[42]。因此，研究者尝试将种子细胞接种到脱细胞支架来促进移植物再生。Ott 等[43]用含氧培养基灌注上皮细胞和内皮细胞接种的脱细胞肺支架，结果表明再细胞化肺移植物产生的气体交换稍低于原生肺，且无组织坏死。再生肺的功能恢复证明再细胞化移植物有重现组织器官自身功能的潜力，但需要进一步完善再生方案以更好的诱导细胞分化和功能恢复。移植物的血管形成有助于移植后的代谢循环和营养物质的分布，且避免移植塌陷、狭窄、感染和坏死。Tan 等[44]将脱细胞气管支架连续灌注血管内皮生长因子（VEGF），有效促进新生血管形成。血小板生长因子、VEGF和血管生成素等影响内皮细胞的迁移、分化和增殖，并促进血运重建。总之，在生物反应器中，自体/干细胞接种脱细胞移植物实现再细胞化。
3D 打印技术将细胞、生物材料和生物活性因子组装成3D空间结构，以支持细胞生长和分化。dECM 水凝胶作为 3D 打印生物墨水可以调节细胞功能、组织再生和重塑[45-46]。Wu 等[47]利用脱细胞心肌组织在生理温度下自组装成纳米纤维水凝胶，以接种心肌细胞（CMS）和基质细胞衍生因子-1（SDF-1a），并注射到心肌梗死区域。结果显示水凝胶促进了内源性细胞的募集和血管形成，减少梗死面积和改善心脏功能。此外，随着微流控 3D 打印水凝胶支架的进步，水凝胶通过微通道的掺入功能实现对化学物质的精确控制和操作，并且促进了组织/器官的功能。Idaszek 等[48]设计了由生物墨水组成的细胞负载的微流体水凝胶支架，来模拟软骨的 ECM。水凝胶植入滑车关节损伤的大鼠，观察到分化的软骨细胞。通过微流控打印的新型生物墨水具有高细胞存活率和分辨率。因此，生物墨水代表了一种与天然组织高度相似的生物材料，支持了高细胞活力，增加了软骨形成和糖胺聚糖的含量。虽然 3D 打印还不能打印较大的结构，并且容易导致细胞活力下降甚至凋亡，但随着材料和工艺的开发以及生物功能的不断认知，3D 打印将大规模地生成功能性心脏、肝脏和肾脏等。
3 脱细胞基质在胸心外科领域的应用
基于 dECM 的生物制造技术越来越多地用于胸心外科组织工程领域。由于不同组织的厚度、密度、结构以及用途等存在差异，研究者需要选择个性化的脱细胞试剂和调整脱细胞方案。因此，虽然更复杂的组织工程支架正处于早期临床试验，但随着组织工程研究的进步，有望创建理想的移植替代物，为移植器官短缺提供新的解决办法。
3.1 心脏
心血管疾病是世界范围内主要的死亡原因[49]。由于缺乏合适的供体器官，以及存在排斥风险和终身免疫抑制治疗的困难，采用机械拉伸和电刺激的心脏组织工程应用在促进组织的搏动功能和传导方面显示出希望。Ott 等[50]首次通过冠状动脉对大鼠心脏灌注去污剂，用新生心肌细胞再细胞化后，心脏组织显示出对单步电刺激和收缩反应。为了改善移植物的机械性能，Seo 等[51]使用 scCO2 和乙醇共溶剂制备了 ECM 力学特性更好的脱细胞心脏组织，并且在大鼠皮下层观察到血管形成。因此，心脏 dECM 是一种有潜力治疗心脏缺血性疾病的生物医学材料。
目前集中于开发具有抗钙化特性的脱细胞心脏瓣膜，并利用 PCL内封装 VEGF 和表达骨保护素，来应对退行性钙化导致的自体心脏瓣膜衰竭[52-53]。Jang 等[45]制备了一种负载心脏祖细胞和 MSCs 的 hdECM 生物墨水。hdECM 生物墨水与 VEGF 的使用促进了血管形成，增强了心脏功能。此外，与传统的 Glu-DHV 相比，两性离子水凝胶（MPC）涂层瓣膜具有优越的抗钙化性能[54]。负载 VEGF 的 PEGDA-MPC-DHV 表现出减少钙化、较低的免疫反应和增强的再内皮化能力[52]。多功能水凝胶在改善生物瓣膜质量和心脏瓣膜钙化方面的潜力已被证实，可以解决与机械和生物瓣膜相关的限制，以寻求瓣膜性心脏病的有效治疗。
3.2 血管
组织和器官中的血管可以提供氧气和营养代谢物质，以修复和再生组织。由于缺乏血液供应会导致缺氧，因此移植物构建脉管系统是至关重要的。Gao 等[55]将负载内皮细胞的猪降主动脉 dECM 生物墨水结合阿托伐他汀的聚乳酸-乙醇酸（PLGA）微球来构建生物血管，可促进新生血管形成。为了准确模拟血管的三层空间特征和构建血管化通道，Xu 等[56]制备了负载 HUVECs 的内膜、负载人主动脉血管平滑肌细胞（HA-VSMCs）和 dECM 的中层以及负载人真皮成纤维细胞-新生儿（HDF-n）细胞的外膜的三层血管厚结构，这种血管的力学性能和血管结构与人天然主动脉相似，并且观察到血管形成。因此，具有多层次结构的血管化厚组织表现出更高的稳定性和生物相容性，证明了使用 3D 生物打印技术制造的移植物来模仿人体血管系统的结构和功能的可行性。为了观察血管生成过程，研究者构建了一个血管等效物的生物打印和灌注平台，以打印可调灌注的复杂血管结构，培养7 d的血管构建体形成了完整的内皮和细胞紧密连接[57]。结果证明血管移植物在促血管生成因子的刺激下表现出新生血管形成的能力，这为开发观察血管形成的先进模型奠定了基础。这些研究为血管组织工程提供了一条新的策略。
3.3 肺
组织工程构建的生物肺通过气道、血管和气体交换组织来提供生理特性，减少免疫排斥反应的发生。肺脱细胞包括去污剂灌注气道和脉管系统。Ott 等[43]使用 0.1% SDS 和 1% Triton X-100 进行肺动脉灌注，再用 HUVECs 和大鼠胎肺细胞接种脱细胞肺支架。早期研究证明了脱细胞肺支架支持基本器官功能的能力，但对气道和血管网络造成损伤，导致肺渗漏和功能受限。
脱细胞肺支架需要恢复正常的气体交换以实现功能再生。Young 等[58]研究基底膜蛋白改善 dlECM 以形成适当的上皮和肺泡屏障。结果显示添加层粘连蛋白或纤连蛋白的 dlECM 恢复更好的肺泡上皮细胞屏障功能。目前温和的去污剂展现了减少肺组织 ECM 损伤的潜力。Obata 等[59]研究了天然脂肪酸和肥皂月桂酸钾（PL）作为肺生物工程去污剂的能力，PL-脱细胞支架提高大鼠细胞的去除和结构的保存，以及上皮细胞的均匀分布。此外，密集的血管循环网络可以进行生理血流和气体交换。研究证明了 Epac 激动剂改善内皮屏障功能和增加连接蛋白，有助于肺气-血屏障的形成[58, 60]。在气道和脉管系统再细胞化时允许适当的细胞分布，以实现气体交换、顺应性和正常的体内肺功能。组织工程技术的发展为肺脏移植提供了新的来源，体外再细胞化构建功能性的肺组织，以满足移植的需求。
3.4 气管
气道与空气相通，因此气管具有复杂的微环境。为了满足长段气管病变的临床需求，脱细胞气管支架是一个前沿的选择。Go 等[61]制备了脱细胞气管结合自体骨髓 MSCs 衍生的软骨细胞和自体上皮细胞的气管移植物，观察到较少的炎症反应。Zhong 等[62]根据此方案显示移植物未发生塌陷和破裂，仅有薄层粘连。
此外，生物墨水与内皮细胞和成纤维细胞的结合在气道上皮和血管网络之间构建了一个功能性气道界面。Park [63]使用猪源性气管粘膜（tmdECM）生物墨水制备功能性气道补片。tmdECM 具有多种血管生成因子，促进血管生成分化，形成稳定的血管网络。为了促进缺损气管的上皮再生，Park 等[64]开发了人下鼻甲间充质基质细胞（hTMSCs）负载气管粘膜（tmdECM）的生物墨水，来修复兔模型的气管缺损。结果显示，术后2个月，tmdECM 支架完全被上皮组织覆盖，而胶原支架+ hTMSCs 组则严重狭窄。免疫荧光显示基底细胞表达 KRT-14，提示基底细胞再生活跃。这些结果证实，生物打印气管移植物是一种合适的组织工程策略，可用于环形气管重建。未来 3D 生物打印有可能制作模拟复杂器官环境的高功能器官模型。
4 结论与展望
dECM 生物材料在组织工程和再生医学中获得了极大的研究关注。脱细胞心脏、肺和气管等移植物证明了其作为组织替代物的临床实用性。dECM 的多功能性允许开发各种生物材料形式，如粉末、水凝胶、生物墨水、薄片和 3D 结构等。组织工程应用 dECM 必须采用恒定且生物学上合适的 ECM，优化组织脱细胞方案，防止基质组成的改变，改善基于 dECM 的生物墨水的机械性能，避免生物体的免疫反应。尽管取得了重大进展，但仍然存在一些挑战。包括残留毒性去污剂，缺乏 dECM 标准化的灭菌和保存方式，尚未充分验证dECM 在体内的长期功能和安全性，需要改进脱细胞方法，需要解决 dECM 作为生物墨水进行 3D 打印时，打印质量、分辨率和功能性的问题，深入了解 dECM 如何影响细胞行为并优化其过程以提高再生效率，以及实现类似于天然组织的机械性能和 dECM 的规模化生产，并评估其成本效益，以促进移植物的临床转化。总之，dECM 作为一个前沿的平台，为干细胞和其他生物活性材料的整合提供了仿生环境，为未来支架的创建提供可行的模型并且在胸心外科组织工程领域有更加广阔的应用前景。
利益冲突：无
作者贡献：陈浩负责检索文献、整理资料、撰写文章；朱剑炜负责制作表格、审阅与修改论文；史宏灿负责审阅与修改文章。
组织工程技术快速发展给组织或器官的修复与重建带来了新希望。一种生物相容性好，利于细胞生长与增殖的组织工程支架是成功构建组织工程器官的关键[1]。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是由细胞合成并分泌的多种生物大分子（如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖等）所构成的高度动态且精密有序的3D网状结构，是细胞特有的适宜生长的天然支架，为固有细胞创造了独特的组织特异性微环境[2]。此外，ECM 还提供了在具体组织发挥功能所必需的结构和生化信号，具有调节细胞增殖、分化、迁移、稳态和形态发生的功能[3-4]。
脱细胞技术被广泛应用于组织工程研究领域，脱细胞基质（decellularized extracellular matrix，dECM）的研究逐渐成为组织工程支架构建的热点方向[5-8]。脱细胞是从组织/器官去除细胞成分，同时保留结构和基质功能，并创建 ECM 衍生支架[9]。dECM 具有低免疫原性、利于细胞粘附、支持细胞分化及增殖，能够促进体内组织修复和再生，并为细胞生长提供较为理想的微环境[10]。dECM 的功能主要取决于供体组织脱细胞的有效性，以及组织或器官经脱细胞处理后保留的 ECM 特性。脱细胞骨、软骨、肌肉、肌腱、血管等简单组织和心、肝、肺、肾等复杂器官已经应用于组织工程和再生医学领域，大量相关研究涵盖了各种形式的 dECM （如水凝胶、生物墨水和多孔组织结构）及其应用取得了优异的成果，展现出了巨大的应用前景[11-12]。
dECM 生物材料是组织工程和再生医学的前沿领域。本文介绍了主流的脱细胞策略，探讨了脱细胞过程对组织或器官机械性能和生物特性的影响，总结了 dECM 主要应用形式，并调查了脱细胞组织/器官在胸心外科领域的应用研究。
1 脱细胞基质的制备和表征
组织或器官通过脱细胞处理，来破坏其中细胞的细胞膜，诱导细胞死亡，去除细胞成分[13]。常用的脱细胞方法有：物理方法、化学方法和生物方法等（表1）。为了确定组织或器官脱细胞的效果，Crapo 等[14]提出了评估 dECM 的最低标准，包括:（1）每 1 mg 干燥 ECM 中 dECM 必须含有少于 50 ng 的 DNA；（2）DNA 片段的长度少于200对核苷酸；（3）用 DAPI 或苏木精和伊红染色的组织切片不含有微量遗传物质。该标准确定了植入宿主机体后诱导免疫应答的阈值，降低了免疫排斥的发生。除了细胞 DNA 和遗传物质，还需要评估蛋白质和其他 ECM 成分（如胶原蛋白、糖胺聚糖和生长因子）以及机械性能（如拉伸强度、弹性模量、粘性模量和刚度）[15]。
表1
脱细胞基质的制备方法
采用单纯的物理方法防止ECM结构的破坏，脱细胞过程久且效果不佳[16]。去污剂法旨在溶解细胞膜、解离 DNA 和破坏脂质-蛋白质相互作用，以达到脱细胞化的效果，但组织长时间的暴露对细胞毒性和成分的破坏较大[16]。酶通过切割细胞-细胞/ECM 相互作用和核酸来去除细胞和遗传物质。然而，单独的酶作用不能达到完全脱细胞，且长时间暴露会破坏 ECM 结构和蛋白质[17]。因此，研究者[18]尝试联合法提高组织/器官中细胞和遗传物质去除的效率以及基质有效成分的保留。主流的联合法是去污剂联合酶法（detergent-enzymatic method，DEM），有效去除细胞成分的同时减少对 ECM 的影响以及提高生长因子的保留，因此这种方法所制备的 dECM 不仅具有较低的免疫原性，还有良好的生物相容性与生物活性[19-20]。
为了缩短脱细胞的时间，进一步减少 ECM 有效成分的流失与破坏，研究者[21-23]尝试将物理方法与 DEM 相结合。Baiguera 等[24]将固定的气管放入灌流生物反应器中进行 DEM 脱细胞方案，与单纯的 DEM 相比，该法通过增加溶液扩散，去除细胞成分的同时有效缩短了脱细胞时间。Mazza 等[25]首次报道了 DEM 方案（胰蛋白酶-EDTA、SDS、Triton X-100、过氧乙酸和乙醇）处理肝脏左叶2周，结果显示 DNA 含量显著减少，细胞碎片的去除及组织结构的保留。Mazza 等[26]在 DEM 方案的基础上通过使用高搅拌速度，快速使肝组织立方体（125 mm3）脱细胞化，将完全脱细胞时间成功缩短至3 h。此外，真空辅助脱细胞加速脱细胞过程，并降低了长期保存引起的 dECM 缺失。Friedrich 等[27]在 508 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）的真空压力下结合 DEM 法，更快且有效制备脱细胞肌肉基质，其不仅具有较低的 DNA 含量，还保留了与原生组织相似的 ECM 成分、细胞相容性和生物力学特性。
因此，联合方案进行脱细胞能够缩短 ECM 暴露去污剂和处理的时间，以及开发的 dECM 不仅作为适宜的细胞载体，而且调节细胞行为和组织再生。目前研究了很多不同的脱细胞策略，但是由于组织/器官特异性，尚无个性化的脱细胞方案的共识，需要进一步研究制备理想的 dECM，支持细胞-细胞相互作用，使细胞可以粘附、增殖和分化，并适应复杂器官的结构要求。
2 脱细胞基质的应用形式
dECM 有两种应用形式：完整的器官支架和松散的 dECM 组织。整个器官脱细胞后保留3D结构和血管网络，其功能通过再细胞化重新实现[39-40]；另一种形式是通过分离纯化和灭菌的松散 dECM 组织制备的 dECM 粉末和水凝胶/生物墨水[41]。在需要结构和机械完整性的应用中，完整的 dECM 优于进一步处理的 dECM，但粉末处理的 dECM 提供了完整组织所不能提供的益处。包括填充区域并塑造组织缺损的形状，以及其顺应能力允许微创植入手术等。
脱细胞支架通过保留 ECM 有效成分和纤维结构以模拟体内微环境，并通过释放生物活性物质来促进内源性募集[42]。因此，研究者尝试将种子细胞接种到脱细胞支架来促进移植物再生。Ott 等[43]用含氧培养基灌注上皮细胞和内皮细胞接种的脱细胞肺支架，结果表明再细胞化肺移植物产生的气体交换稍低于原生肺，且无组织坏死。再生肺的功能恢复证明再细胞化移植物有重现组织器官自身功能的潜力，但需要进一步完善再生方案以更好的诱导细胞分化和功能恢复。移植物的血管形成有助于移植后的代谢循环和营养物质的分布，且避免移植塌陷、狭窄、感染和坏死。Tan 等[44]将脱细胞气管支架连续灌注血管内皮生长因子（VEGF），有效促进新生血管形成。血小板生长因子、VEGF和血管生成素等影响内皮细胞的迁移、分化和增殖，并促进血运重建。总之，在生物反应器中，自体/干细胞接种脱细胞移植物实现再细胞化。
3D 打印技术将细胞、生物材料和生物活性因子组装成3D空间结构，以支持细胞生长和分化。dECM 水凝胶作为 3D 打印生物墨水可以调节细胞功能、组织再生和重塑[45-46]。Wu 等[47]利用脱细胞心肌组织在生理温度下自组装成纳米纤维水凝胶，以接种心肌细胞（CMS）和基质细胞衍生因子-1（SDF-1a），并注射到心肌梗死区域。结果显示水凝胶促进了内源性细胞的募集和血管形成，减少梗死面积和改善心脏功能。此外，随着微流控 3D 打印水凝胶支架的进步，水凝胶通过微通道的掺入功能实现对化学物质的精确控制和操作，并且促进了组织/器官的功能。Idaszek 等[48]设计了由生物墨水组成的细胞负载的微流体水凝胶支架，来模拟软骨的 ECM。水凝胶植入滑车关节损伤的大鼠，观察到分化的软骨细胞。通过微流控打印的新型生物墨水具有高细胞存活率和分辨率。因此，生物墨水代表了一种与天然组织高度相似的生物材料，支持了高细胞活力，增加了软骨形成和糖胺聚糖的含量。虽然 3D 打印还不能打印较大的结构，并且容易导致细胞活力下降甚至凋亡，但随着材料和工艺的开发以及生物功能的不断认知，3D 打印将大规模地生成功能性心脏、肝脏和肾脏等。
3 脱细胞基质在胸心外科领域的应用
基于 dECM 的生物制造技术越来越多地用于胸心外科组织工程领域。由于不同组织的厚度、密度、结构以及用途等存在差异，研究者需要选择个性化的脱细胞试剂和调整脱细胞方案。因此，虽然更复杂的组织工程支架正处于早期临床试验，但随着组织工程研究的进步，有望创建理想的移植替代物，为移植器官短缺提供新的解决办法。
3.1 心脏
心血管疾病是世界范围内主要的死亡原因[49]。由于缺乏合适的供体器官，以及存在排斥风险和终身免疫抑制治疗的困难，采用机械拉伸和电刺激的心脏组织工程应用在促进组织的搏动功能和传导方面显示出希望。Ott 等[50]首次通过冠状动脉对大鼠心脏灌注去污剂，用新生心肌细胞再细胞化后，心脏组织显示出对单步电刺激和收缩反应。为了改善移植物的机械性能，Seo 等[51]使用 scCO2 和乙醇共溶剂制备了 ECM 力学特性更好的脱细胞心脏组织，并且在大鼠皮下层观察到血管形成。因此，心脏 dECM 是一种有潜力治疗心脏缺血性疾病的生物医学材料。
目前集中于开发具有抗钙化特性的脱细胞心脏瓣膜，并利用 PCL内封装 VEGF 和表达骨保护素，来应对退行性钙化导致的自体心脏瓣膜衰竭[52-53]。Jang 等[45]制备了一种负载心脏祖细胞和 MSCs 的 hdECM 生物墨水。hdECM 生物墨水与 VEGF 的使用促进了血管形成，增强了心脏功能。此外，与传统的 Glu-DHV 相比，两性离子水凝胶（MPC）涂层瓣膜具有优越的抗钙化性能[54]。负载 VEGF 的 PEGDA-MPC-DHV 表现出减少钙化、较低的免疫反应和增强的再内皮化能力[52]。多功能水凝胶在改善生物瓣膜质量和心脏瓣膜钙化方面的潜力已被证实，可以解决与机械和生物瓣膜相关的限制，以寻求瓣膜性心脏病的有效治疗。
3.2 血管
组织和器官中的血管可以提供氧气和营养代谢物质，以修复和再生组织。由于缺乏血液供应会导致缺氧，因此移植物构建脉管系统是至关重要的。Gao 等[55]将负载内皮细胞的猪降主动脉 dECM 生物墨水结合阿托伐他汀的聚乳酸-乙醇酸（PLGA）微球来构建生物血管，可促进新生血管形成。为了准确模拟血管的三层空间特征和构建血管化通道，Xu 等[56]制备了负载 HUVECs 的内膜、负载人主动脉血管平滑肌细胞（HA-VSMCs）和 dECM 的中层以及负载人真皮成纤维细胞-新生儿（HDF-n）细胞的外膜的三层血管厚结构，这种血管的力学性能和血管结构与人天然主动脉相似，并且观察到血管形成。因此，具有多层次结构的血管化厚组织表现出更高的稳定性和生物相容性，证明了使用 3D 生物打印技术制造的移植物来模仿人体血管系统的结构和功能的可行性。为了观察血管生成过程，研究者构建了一个血管等效物的生物打印和灌注平台，以打印可调灌注的复杂血管结构，培养7 d的血管构建体形成了完整的内皮和细胞紧密连接[57]。结果证明血管移植物在促血管生成因子的刺激下表现出新生血管形成的能力，这为开发观察血管形成的先进模型奠定了基础。这些研究为血管组织工程提供了一条新的策略。
3.3 肺
组织工程构建的生物肺通过气道、血管和气体交换组织来提供生理特性，减少免疫排斥反应的发生。肺脱细胞包括去污剂灌注气道和脉管系统。Ott 等[43]使用 0.1% SDS 和 1% Triton X-100 进行肺动脉灌注，再用 HUVECs 和大鼠胎肺细胞接种脱细胞肺支架。早期研究证明了脱细胞肺支架支持基本器官功能的能力，但对气道和血管网络造成损伤，导致肺渗漏和功能受限。
脱细胞肺支架需要恢复正常的气体交换以实现功能再生。Young 等[58]研究基底膜蛋白改善 dlECM 以形成适当的上皮和肺泡屏障。结果显示添加层粘连蛋白或纤连蛋白的 dlECM 恢复更好的肺泡上皮细胞屏障功能。目前温和的去污剂展现了减少肺组织 ECM 损伤的潜力。Obata 等[59]研究了天然脂肪酸和肥皂月桂酸钾（PL）作为肺生物工程去污剂的能力，PL-脱细胞支架提高大鼠细胞的去除和结构的保存，以及上皮细胞的均匀分布。此外，密集的血管循环网络可以进行生理血流和气体交换。研究证明了 Epac 激动剂改善内皮屏障功能和增加连接蛋白，有助于肺气-血屏障的形成[58, 60]。在气道和脉管系统再细胞化时允许适当的细胞分布，以实现气体交换、顺应性和正常的体内肺功能。组织工程技术的发展为肺脏移植提供了新的来源，体外再细胞化构建功能性的肺组织，以满足移植的需求。
3.4 气管
气道与空气相通，因此气管具有复杂的微环境。为了满足长段气管病变的临床需求，脱细胞气管支架是一个前沿的选择。Go 等[61]制备了脱细胞气管结合自体骨髓 MSCs 衍生的软骨细胞和自体上皮细胞的气管移植物，观察到较少的炎症反应。Zhong 等[62]根据此方案显示移植物未发生塌陷和破裂，仅有薄层粘连。
此外，生物墨水与内皮细胞和成纤维细胞的结合在气道上皮和血管网络之间构建了一个功能性气道界面。Park [63]使用猪源性气管粘膜（tmdECM）生物墨水制备功能性气道补片。tmdECM 具有多种血管生成因子，促进血管生成分化，形成稳定的血管网络。为了促进缺损气管的上皮再生，Park 等[64]开发了人下鼻甲间充质基质细胞（hTMSCs）负载气管粘膜（tmdECM）的生物墨水，来修复兔模型的气管缺损。结果显示，术后2个月，tmdECM 支架完全被上皮组织覆盖，而胶原支架+ hTMSCs 组则严重狭窄。免疫荧光显示基底细胞表达 KRT-14，提示基底细胞再生活跃。这些结果证实，生物打印气管移植物是一种合适的组织工程策略，可用于环形气管重建。未来 3D 生物打印有可能制作模拟复杂器官环境的高功能器官模型。
4 结论与展望
dECM 生物材料在组织工程和再生医学中获得了极大的研究关注。脱细胞心脏、肺和气管等移植物证明了其作为组织替代物的临床实用性。dECM 的多功能性允许开发各种生物材料形式，如粉末、水凝胶、生物墨水、薄片和 3D 结构等。组织工程应用 dECM 必须采用恒定且生物学上合适的 ECM，优化组织脱细胞方案，防止基质组成的改变，改善基于 dECM 的生物墨水的机械性能，避免生物体的免疫反应。尽管取得了重大进展，但仍然存在一些挑战。包括残留毒性去污剂，缺乏 dECM 标准化的灭菌和保存方式，尚未充分验证dECM 在体内的长期功能和安全性，需要改进脱细胞方法，需要解决 dECM 作为生物墨水进行 3D 打印时，打印质量、分辨率和功能性的问题，深入了解 dECM 如何影响细胞行为并优化其过程以提高再生效率，以及实现类似于天然组织的机械性能和 dECM 的规模化生产，并评估其成本效益，以促进移植物的临床转化。总之，dECM 作为一个前沿的平台，为干细胞和其他生物活性材料的整合提供了仿生环境，为未来支架的创建提供可行的模型并且在胸心外科组织工程领域有更加广阔的应用前景。
利益冲突：无
作者贡献：陈浩负责检索文献、整理资料、撰写文章；朱剑炜负责制作表格、审阅与修改论文；史宏灿负责审阅与修改文章。
