特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因不明的慢性、进行性肺间质疾病[1]。近年，IPF发病率及诊断率逐年上升[2]，但其具体机制仍不明确，机体内部因素（遗传易感性、胃食管反流、微生物共生失衡等）和外界环境暴露（吸烟、大气污染等）所致的肺稳态失衡在IPF发生发展中可能扮演关键角色[3-6]。
近年来肠道菌群与肺稳态相互作用在IPF研究中逐渐受到重视。肠道菌群通过调控免疫应答、能量代谢、物质交换等过程[7]，与肺稳态产生双向调节关系[8]。临床证据表明，肠道菌群比例失调与肺纤维化患者发病及病情加重有相关性[9]；动物实验[10-13]亦表明，两种肺纤维化动物模型均表现出肠道菌群多样性与丰度改变。调控肠道菌群或将成为IPF防治的新方向。然而，目前对于肠道菌群的认识仍然处于起步阶段，肠道菌群与IPF之间的因果关系仍然有待进一步明确。
孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）是遗传流行病学的一种新兴因果推断方法，将遗传变异作为工具变量（instrumental variables，IVs），依赖于均等、随机、独立分布的规则，有效规避了混杂因素和反向因果关系的影响，可探索临床研究中难以或不能进一步观察的暴露与结局之间的因果关系[14-16]。目前已有研究[17]利用MR探究了肠道菌群和慢性呼吸系统疾病（包括IPF）的因果关系，然而其缺乏双向验证，且未对两者关联机制进行深入探讨。因此，本研究采用全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）数据，运用两样本、双向MR分析方法，以单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）作为IVs，进一步探索肠道菌群与IPF之间的双向因果关系，为IPF研究提供新的生物标志物、治疗策略和理论基础。
1 资料与方法
1.1 数据来源
肠道菌群GWAS数据来自MiBioGen，包括9门、16纲、20目、35科和131属（
表1
研究纳入的GWAS信息
1.2 研究方法
MR是一种基于遗传变异，运用IVs进行分析的研究方法，包括以下3个核心假设（图1）：（1）最终用于因果分析的IVs必须与暴露因素密切相关；（2）IVs与影响暴露因素、结局因素的混杂因素没有直接关系；（3）IVs仅通过暴露因素影响结局因素，而不直接对结局产生作用。本研究首先以肠道菌群5个水平（门、纲、目、科和属）为暴露因素、IPF为结局进行双样本MR，研究肠道菌群对IPF的致病作用。随后，为进一步确认筛选所得肠道菌群与IPF之间的正反因果关系，对正向MR结果进行反向分析[18]：以IPF为暴露因素，肠道菌群为结局进行MR分析。
图1
孟德尔随机化分析假设模型图
1.3 工具变量的筛选与去除
以P<5×10−8为筛选条件[19]，从暴露因素中选择差异有统计学意义的SNPs作为初步筛选的IVs。设置连锁不平衡系数r2=0.001，区域宽度kb=10000，以消除连锁不平衡关系，保证SNPs相互独立，避免偏倚。使用PhenoScanner V2（
，其中R2=
，式中EAF为效果等位基因的频率，N为样本量，β为等位基因的效应值，SE为标准误差，若F<10提示该SNPs为弱IVs，对其进行剔除。在最后协调暴露和结局数据时，删除具有中间等位基因频率的回文SNPs。
1.4 统计学分析
所有数据分析与可视化均使用R语言（4.3.2）“Two-Sample-MR”和“MR-PRESSO”软件包。MR分析前剔除SNPs数目<3个的肠道菌群。将逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）作为主要MR分析方法。同时，采用加权中位数法（weighted median，WM）、简单众数法（simple mode，SM）、MR-Egger回归、加权众数法（weighted mode，WME）补充进行MR分析以评估IVW方法的稳健性。计算结果以比值比（odds ratio，OR）和95%置信区间（confidence interval，CI）表示。
Cochrane’s Q检验用于计算个体遗传变异估计值。使用孟德尔随机多态性残差和离群值（Mendelian randomization pleiotropy residual sum and outlier，MR-PRESSO）法，对SNP数目≥4个的肠道菌群进行离群值检验，若SNP数目<4，则默认不存在离群值。使用MR-Egger进行水平多效性测试。使用留一法（leave-one-out，LOO）逐一剔除SNPs后计算合并效应量，检验研究结果是否稳健。Cochrane’s Q、LOO检验中，P>0.05表示研究中SNPs无显著异质性。MR-PRESSO中，P>0.05表示未观察到离群值。MR-Egger回归中，P>0.05为研究中不存在水平多效性，从而满足MR的核心假设。使用Steiger检验分析方向性，以驳斥由反向因果关系引起的偏差，验证双向MR分析结果的可靠性。P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肠道菌群与特发性肺纤维化的因果关联
本研究发现6种肠道菌群与IPF发生相关：放线菌门（Actinobacteria），坏疽毒素梭状芽胞杆菌属（Erysipelatoclostridium），链球菌属（Streptococcus），双歧杆菌属（Bifidobacterium），瘤胃球菌属（Ruminococcus），泰氏菌属（Tyzzerella）。相关SNPs信息见附表1～2（https://www.tcsurg.org/article/10.7507/1007-4848.202403050）。
表2
肠道菌群对IPF的MR分析结果
IVW结果显示，放线菌门（OR=1.773，P<0.001）、坏疽毒素梭状芽胞杆菌属（OR=2.077，P=0.023）和链球菌属（OR=1.350，P=0.004）与IPF发病风险呈正相关；双歧杆菌属（OR=0.668，P<0.001）、瘤胃球菌属（OR=0.434，P=0.015）和泰氏菌属（OR=0.479，P=0.001）与IPF发病风险呈负相关。其余几种计算方法的效应方向与IVW基本一致，提示IVW结果具有良好的稳健性；见表2。
Cochrane’s Q检验显示，Q值在0.018～114.620之间，P>0.05，表明不存在异质性；MR-PRESSO结果P>0.05，表明不存在离群值；MR-Egger-intercept结果P>0.05，表明MR分析结果不存在水平多效性；Steiger检验结果显示，SNPs对暴露因素的影响大于对结局的影响，提示不存在反向因果关联；见表3。LOO检验结果显示，因果效应不受单个SNPs的影响，说明结果敏感性良好；见图2。
表3
MR的敏感性分析结果
图2
MR的留一法敏感性分析结果
a：放线菌门-IPF；b：坏疽毒素梭状芽胞杆菌属-IPF；c：链球菌属-IPF；d：双歧杆菌属-IPF；e：瘤胃球菌属-IPF；f：泰氏菌属-IPF；IPF：特发性肺纤维化；MR：孟德尔随机化
2.2 肠道菌群与特发性肺纤维化的反向因果关联
以IPF为暴露因素，肠道菌群为结局，进行反向MR分析，发现IPF对上述肠道菌群的改变并无显著影响（IVW法P>0.05）；见表4。
表4
反向MR分析结果
Cochrane's Q 检验显示，Q值在16.440～25.420之间，P>0.05，表明不存在异质性；MR-PRESSO结果P>0.05，表明不存在离群值。MR-Egger-intercept结果P>0.05，表明不存在水平多效性；见表5。LOO检验结果显示，因果效应不受单个SNPs影响；见图3。
表5
反向MR的敏感性分析结果
图3
反向MR的留一法敏感性分析结果
a：IPF-放线菌门；b：IPF-坏疽毒素梭状芽胞杆菌属；c：IPF-链球菌属；d：IPF-双歧杆菌属；e：IPF-瘤胃球菌属；f：IPF-泰氏菌属；IPF：特发性肺纤维化；MR：孟德尔随机化
3 讨论
本研究运用全球最大的肠道菌群数据库MiBioGen和芬兰联盟发布的IPF统计数据，进行了两样本、双向MR分析，鉴定出6种与IPF发病具有因果关联的肠道菌群，包括：放线菌门、坏疽毒素梭状芽胞杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属、泰氏菌属，而IPF对上述肠道菌群不存在反向因果调节作用。
放线菌门是肠道主要菌群之一，在肠道稳态中起重要作用。放线菌是革兰氏阳性、多分支杆菌、非运动、非孢子形成和厌氧菌，双歧杆菌是其中最具代表的菌群。放线菌门与多种疾病有关，在抑郁状态、慢性疲劳综合征、溃疡性结肠炎、银屑病等多种疾病中具有显著改善作用[24-25]。研究发现，放线菌门在慢性阻塞性肺疾病[26]、SARS-CoV-2[27]、急性呼吸窘迫综合征[28]等呼吸系统疾病的发生发展中也有重要作用。在IPF患者肺泡灌洗液中，放线菌门丰度显著上调，证实放线菌门与IPF密切相关[29]。本研究则为二者的因果关联提供了实证依据。
坏疽毒素梭状芽胞杆菌属是革兰氏阳性、专性厌氧杆菌，是一种机会性病原体，免疫系统受损或患有癌症[30]、糖尿病等慢性疾病的宿主是其易感人群。此外，坏疽毒素梭状芽胞杆菌属与某些创伤后感染有关，引发坏死性筋膜炎甚至败血症[31]。研究[32]发现，坏疽毒素梭状芽胞杆菌属在急性期和恢复期SARS-CoV-2患者肠道中富集并诱导慢性炎症。此外，下调坏疽毒素梭状芽胞杆菌属丰度可能使克罗恩病相关肺损伤患者潜在获益[33]。先前的一项MR分析[34]发现赭色嗜酸内肠菌属也存在潜在的促肺癌发生作用。上述证据表明，坏疽毒素梭状芽胞杆菌属在呼吸系统疾病发生发展中扮演重要角色，尽管尚无直接证据，但本研究提示其或许在IPF发生中也具有重要作用，值得进一步研究。
链球菌属是最常见的革兰氏阳性、化脓性球菌之一，广泛分布于人体鼻咽、胃肠道等处，是人类口腔和呼吸道中最主要的共生和机会性菌群[35]。致病性链球菌可引起多种化脓性炎症及超敏反应性疾病。研究发现，链球菌属是食管鳞癌[36]、自身免疫性甲状腺疾病[37]、原发性胆汁性肝硬化[38]的主要危险因素。作为呼吸道主要共生菌群，链球菌在肺部相关疾病中同样重要，可通过IL-22表达缺陷促使慢性阻塞性肺疾病恶化[39]，还可通过血栓形成[40]、血管炎症[41]等途径诱发肺部继发恶性肿瘤。此外，IPF患者的无进展生存期、用力肺活量等与链球菌属丰度相关[42]，且链球菌感染可通过释放肺炎球菌溶血素触发肺纤维化的进展[43]。可见，链球菌属与IPF的发生发展密切相关，上述证据进一步证实了本研究的发现。
双歧杆菌属广泛存在于消化道、阴道和口腔等生物环境中，可发挥生物屏障、营养支持、抗肿瘤、免疫增强等多种作用。双歧杆菌可通过“脑-肠轴”对老年小鼠的神经元再生发挥促进作用，从而改善年龄相关性大脑疾病[44]；双歧杆菌属丰度在老年高脂血症患者肠道内显著下调，暗示其对老年人群血脂代谢亦具有调控作用[45]。双歧杆菌可改善香烟暴露导致的小鼠肺部炎症[46]，减轻肠系膜缺血-再灌注引起的肺损伤[47]。体内试验[48]发现，双歧杆菌丰度更高的博莱霉素小鼠模型肺部纤维化程度更低，提示双歧杆菌对肺纤维化也具有一定的改善作用，这与本研究结果一致。
瘤胃球菌属是一种革兰氏阳性厌氧菌，最早于胃部发现，与机体新陈代谢密切相关。瘤胃球菌属对机体具有双向调节作用：即可通过降解纤维素、抗性淀粉等复合碳水化合物参与新陈代谢，促进机体正常生理功能的发挥，又与消化、神经、免疫等多系统疾病的发生发展相关[49]。研究[50-53]表明，瘤胃球菌属是肠-肺轴微生物串扰的重要标志物，在肺炎、急性肺损伤、哮喘等多种肺部疾病中丰度异常。相较正常大鼠，在肺纤维化动物模型中，瘤胃球菌丰度显著下降，提示瘤胃球菌或许是肺纤维化的保护因素[54]，这与本研究结果一致。
泰氏菌属是近年发现的新菌属，属于厚壁菌门的梭菌纲，主要富集于肠道，参与宿主的能量代谢、维生素合成等生物学过程。研究表明，泰式菌属可能与妊娠期糖尿病[55]、结肠炎[56]、脂肪肝[57]和慢性阻塞性肺疾病[58]等的发生相关。尽管尚无研究提示泰式菌属与IPF发生发展相关，但泰式菌属可调节机体能量代谢，而糖脂代谢异常在IPF的发生发展中亦具有重要作用[59-60]。据此推测，泰式菌属可能通过能量代谢途径参与IPF的发生发展。
值得注意的是，将本研究与此前发表的MR研究[17]进行比较，发现两项研究结果存在较大差异，见图4。其原因可能是数据来源及方法学上的异质性。对于两项研究，我们采取求同存异的态度，认为两项研究结果可互为补充，作为外部验证，如两项研究都发现瘤胃球菌属与IPF发生显著相关，促使我们更加关注这一菌群在IPF中的作用，期待未来开展更多相关研究进行探索。
图4
本研究与既往研究[17]结果比较
本研究具有以下创新性：（1）本研究从肠-肺轴出发，以肠道菌群为暴露因素，讨论其与IPF之间的因果作用，具有较强的理论和临床价值；（2）本研究以大样本GWAS统计数据为研究基础，对肠道菌群与IPF的因果关系进行了探索；（3）本研究采用两样本、双向MR方法，通过严格的IVs筛选、多样化的分析方法及规范的质量控制标准评估肠道菌群和IPF的双向因果关联，结果具有稳定性和可靠性。
本研究亦存在一定的局限性：（1）目前可用的GWAS数据多源于欧洲人群，本研究对中国人群的适用性有待考证；（2）GWAS统计数据较为笼统，未包括各样本的一般信息，如年龄、性别、受教育程度等，可能造成潜在的非线形关系；（3）有必要进一步结合多组学数据深入挖掘肠道菌群介导IPF发生发展的生物学机制[51]。
综上所述，我们采用两样本、双向MR方法，探究了肠道菌群与IPF之间的双向因果关系，发现放线菌门、坏疽毒素梭状芽胞杆菌属和链球菌属可增加IPF发病风险，而双歧杆菌属、瘤胃球菌属和泰氏菌属可降低IPF发病风险。在未来的研究中，可聚焦上述菌群深入探索IPF发生发展的病理机制。
利益冲突：无。
作者贡献：吴宣諭负责选题与研究设计，数据分析，论文撰写与修改；肖祥负责方法整合，数据整理与分析，论文撰写与修改；陈嘉靖、于晓敏负责论文审阅与校对；杨晗负责论文设计和整体修改。
特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因不明的慢性、进行性肺间质疾病[1]。近年，IPF发病率及诊断率逐年上升[2]，但其具体机制仍不明确，机体内部因素（遗传易感性、胃食管反流、微生物共生失衡等）和外界环境暴露（吸烟、大气污染等）所致的肺稳态失衡在IPF发生发展中可能扮演关键角色[3-6]。
近年来肠道菌群与肺稳态相互作用在IPF研究中逐渐受到重视。肠道菌群通过调控免疫应答、能量代谢、物质交换等过程[7]，与肺稳态产生双向调节关系[8]。临床证据表明，肠道菌群比例失调与肺纤维化患者发病及病情加重有相关性[9]；动物实验[10-13]亦表明，两种肺纤维化动物模型均表现出肠道菌群多样性与丰度改变。调控肠道菌群或将成为IPF防治的新方向。然而，目前对于肠道菌群的认识仍然处于起步阶段，肠道菌群与IPF之间的因果关系仍然有待进一步明确。
孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）是遗传流行病学的一种新兴因果推断方法，将遗传变异作为工具变量（instrumental variables，IVs），依赖于均等、随机、独立分布的规则，有效规避了混杂因素和反向因果关系的影响，可探索临床研究中难以或不能进一步观察的暴露与结局之间的因果关系[14-16]。目前已有研究[17]利用MR探究了肠道菌群和慢性呼吸系统疾病（包括IPF）的因果关系，然而其缺乏双向验证，且未对两者关联机制进行深入探讨。因此，本研究采用全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）数据，运用两样本、双向MR分析方法，以单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）作为IVs，进一步探索肠道菌群与IPF之间的双向因果关系，为IPF研究提供新的生物标志物、治疗策略和理论基础。
1 资料与方法
1.1 数据来源
肠道菌群GWAS数据来自MiBioGen，包括9门、16纲、20目、35科和131属（
表1
研究纳入的GWAS信息
1.2 研究方法
MR是一种基于遗传变异，运用IVs进行分析的研究方法，包括以下3个核心假设（图1）：（1）最终用于因果分析的IVs必须与暴露因素密切相关；（2）IVs与影响暴露因素、结局因素的混杂因素没有直接关系；（3）IVs仅通过暴露因素影响结局因素，而不直接对结局产生作用。本研究首先以肠道菌群5个水平（门、纲、目、科和属）为暴露因素、IPF为结局进行双样本MR，研究肠道菌群对IPF的致病作用。随后，为进一步确认筛选所得肠道菌群与IPF之间的正反因果关系，对正向MR结果进行反向分析[18]：以IPF为暴露因素，肠道菌群为结局进行MR分析。
图1
孟德尔随机化分析假设模型图
1.3 工具变量的筛选与去除
以P<5×10−8为筛选条件[19]，从暴露因素中选择差异有统计学意义的SNPs作为初步筛选的IVs。设置连锁不平衡系数r2=0.001，区域宽度kb=10000，以消除连锁不平衡关系，保证SNPs相互独立，避免偏倚。使用PhenoScanner V2（，其中R2=，式中EAF为效果等位基因的频率，N为样本量，β为等位基因的效应值，SE为标准误差，若F<10提示该SNPs为弱IVs，对其进行剔除。在最后协调暴露和结局数据时，删除具有中间等位基因频率的回文SNPs。
1.4 统计学分析
所有数据分析与可视化均使用R语言（4.3.2）“Two-Sample-MR”和“MR-PRESSO”软件包。MR分析前剔除SNPs数目<3个的肠道菌群。将逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）作为主要MR分析方法。同时，采用加权中位数法（weighted median，WM）、简单众数法（simple mode，SM）、MR-Egger回归、加权众数法（weighted mode，WME）补充进行MR分析以评估IVW方法的稳健性。计算结果以比值比（odds ratio，OR）和95%置信区间（confidence interval，CI）表示。
Cochrane’s Q检验用于计算个体遗传变异估计值。使用孟德尔随机多态性残差和离群值（Mendelian randomization pleiotropy residual sum and outlier，MR-PRESSO）法，对SNP数目≥4个的肠道菌群进行离群值检验，若SNP数目<4，则默认不存在离群值。使用MR-Egger进行水平多效性测试。使用留一法（leave-one-out，LOO）逐一剔除SNPs后计算合并效应量，检验研究结果是否稳健。Cochrane’s Q、LOO检验中，P>0.05表示研究中SNPs无显著异质性。MR-PRESSO中，P>0.05表示未观察到离群值。MR-Egger回归中，P>0.05为研究中不存在水平多效性，从而满足MR的核心假设。使用Steiger检验分析方向性，以驳斥由反向因果关系引起的偏差，验证双向MR分析结果的可靠性。P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肠道菌群与特发性肺纤维化的因果关联
本研究发现6种肠道菌群与IPF发生相关：放线菌门（Actinobacteria），坏疽毒素梭状芽胞杆菌属（Erysipelatoclostridium），链球菌属（Streptococcus），双歧杆菌属（Bifidobacterium），瘤胃球菌属（Ruminococcus），泰氏菌属（Tyzzerella）。相关SNPs信息见附表1～2（https://www.tcsurg.org/article/10.7507/1007-4848.202403050）。
表2
肠道菌群对IPF的MR分析结果
IVW结果显示，放线菌门（OR=1.773，P<0.001）、坏疽毒素梭状芽胞杆菌属（OR=2.077，P=0.023）和链球菌属（OR=1.350，P=0.004）与IPF发病风险呈正相关；双歧杆菌属（OR=0.668，P<0.001）、瘤胃球菌属（OR=0.434，P=0.015）和泰氏菌属（OR=0.479，P=0.001）与IPF发病风险呈负相关。其余几种计算方法的效应方向与IVW基本一致，提示IVW结果具有良好的稳健性；见表2。
Cochrane’s Q检验显示，Q值在0.018～114.620之间，P>0.05，表明不存在异质性；MR-PRESSO结果P>0.05，表明不存在离群值；MR-Egger-intercept结果P>0.05，表明MR分析结果不存在水平多效性；Steiger检验结果显示，SNPs对暴露因素的影响大于对结局的影响，提示不存在反向因果关联；见表3。LOO检验结果显示，因果效应不受单个SNPs的影响，说明结果敏感性良好；见图2。
表3
MR的敏感性分析结果
图2
MR的留一法敏感性分析结果
a：放线菌门-IPF；b：坏疽毒素梭状芽胞杆菌属-IPF；c：链球菌属-IPF；d：双歧杆菌属-IPF；e：瘤胃球菌属-IPF；f：泰氏菌属-IPF；IPF：特发性肺纤维化；MR：孟德尔随机化
2.2 肠道菌群与特发性肺纤维化的反向因果关联
以IPF为暴露因素，肠道菌群为结局，进行反向MR分析，发现IPF对上述肠道菌群的改变并无显著影响（IVW法P>0.05）；见表4。
表4
反向MR分析结果
Cochrane's Q 检验显示，Q值在16.440～25.420之间，P>0.05，表明不存在异质性；MR-PRESSO结果P>0.05，表明不存在离群值。MR-Egger-intercept结果P>0.05，表明不存在水平多效性；见表5。LOO检验结果显示，因果效应不受单个SNPs影响；见图3。
表5
反向MR的敏感性分析结果
图3
反向MR的留一法敏感性分析结果
a：IPF-放线菌门；b：IPF-坏疽毒素梭状芽胞杆菌属；c：IPF-链球菌属；d：IPF-双歧杆菌属；e：IPF-瘤胃球菌属；f：IPF-泰氏菌属；IPF：特发性肺纤维化；MR：孟德尔随机化
3 讨论
本研究运用全球最大的肠道菌群数据库MiBioGen和芬兰联盟发布的IPF统计数据，进行了两样本、双向MR分析，鉴定出6种与IPF发病具有因果关联的肠道菌群，包括：放线菌门、坏疽毒素梭状芽胞杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属、泰氏菌属，而IPF对上述肠道菌群不存在反向因果调节作用。
放线菌门是肠道主要菌群之一，在肠道稳态中起重要作用。放线菌是革兰氏阳性、多分支杆菌、非运动、非孢子形成和厌氧菌，双歧杆菌是其中最具代表的菌群。放线菌门与多种疾病有关，在抑郁状态、慢性疲劳综合征、溃疡性结肠炎、银屑病等多种疾病中具有显著改善作用[24-25]。研究发现，放线菌门在慢性阻塞性肺疾病[26]、SARS-CoV-2[27]、急性呼吸窘迫综合征[28]等呼吸系统疾病的发生发展中也有重要作用。在IPF患者肺泡灌洗液中，放线菌门丰度显著上调，证实放线菌门与IPF密切相关[29]。本研究则为二者的因果关联提供了实证依据。
坏疽毒素梭状芽胞杆菌属是革兰氏阳性、专性厌氧杆菌，是一种机会性病原体，免疫系统受损或患有癌症[30]、糖尿病等慢性疾病的宿主是其易感人群。此外，坏疽毒素梭状芽胞杆菌属与某些创伤后感染有关，引发坏死性筋膜炎甚至败血症[31]。研究[32]发现，坏疽毒素梭状芽胞杆菌属在急性期和恢复期SARS-CoV-2患者肠道中富集并诱导慢性炎症。此外，下调坏疽毒素梭状芽胞杆菌属丰度可能使克罗恩病相关肺损伤患者潜在获益[33]。先前的一项MR分析[34]发现赭色嗜酸内肠菌属也存在潜在的促肺癌发生作用。上述证据表明，坏疽毒素梭状芽胞杆菌属在呼吸系统疾病发生发展中扮演重要角色，尽管尚无直接证据，但本研究提示其或许在IPF发生中也具有重要作用，值得进一步研究。
链球菌属是最常见的革兰氏阳性、化脓性球菌之一，广泛分布于人体鼻咽、胃肠道等处，是人类口腔和呼吸道中最主要的共生和机会性菌群[35]。致病性链球菌可引起多种化脓性炎症及超敏反应性疾病。研究发现，链球菌属是食管鳞癌[36]、自身免疫性甲状腺疾病[37]、原发性胆汁性肝硬化[38]的主要危险因素。作为呼吸道主要共生菌群，链球菌在肺部相关疾病中同样重要，可通过IL-22表达缺陷促使慢性阻塞性肺疾病恶化[39]，还可通过血栓形成[40]、血管炎症[41]等途径诱发肺部继发恶性肿瘤。此外，IPF患者的无进展生存期、用力肺活量等与链球菌属丰度相关[42]，且链球菌感染可通过释放肺炎球菌溶血素触发肺纤维化的进展[43]。可见，链球菌属与IPF的发生发展密切相关，上述证据进一步证实了本研究的发现。
双歧杆菌属广泛存在于消化道、阴道和口腔等生物环境中，可发挥生物屏障、营养支持、抗肿瘤、免疫增强等多种作用。双歧杆菌可通过“脑-肠轴”对老年小鼠的神经元再生发挥促进作用，从而改善年龄相关性大脑疾病[44]；双歧杆菌属丰度在老年高脂血症患者肠道内显著下调，暗示其对老年人群血脂代谢亦具有调控作用[45]。双歧杆菌可改善香烟暴露导致的小鼠肺部炎症[46]，减轻肠系膜缺血-再灌注引起的肺损伤[47]。体内试验[48]发现，双歧杆菌丰度更高的博莱霉素小鼠模型肺部纤维化程度更低，提示双歧杆菌对肺纤维化也具有一定的改善作用，这与本研究结果一致。
瘤胃球菌属是一种革兰氏阳性厌氧菌，最早于胃部发现，与机体新陈代谢密切相关。瘤胃球菌属对机体具有双向调节作用：即可通过降解纤维素、抗性淀粉等复合碳水化合物参与新陈代谢，促进机体正常生理功能的发挥，又与消化、神经、免疫等多系统疾病的发生发展相关[49]。研究[50-53]表明，瘤胃球菌属是肠-肺轴微生物串扰的重要标志物，在肺炎、急性肺损伤、哮喘等多种肺部疾病中丰度异常。相较正常大鼠，在肺纤维化动物模型中，瘤胃球菌丰度显著下降，提示瘤胃球菌或许是肺纤维化的保护因素[54]，这与本研究结果一致。
泰氏菌属是近年发现的新菌属，属于厚壁菌门的梭菌纲，主要富集于肠道，参与宿主的能量代谢、维生素合成等生物学过程。研究表明，泰式菌属可能与妊娠期糖尿病[55]、结肠炎[56]、脂肪肝[57]和慢性阻塞性肺疾病[58]等的发生相关。尽管尚无研究提示泰式菌属与IPF发生发展相关，但泰式菌属可调节机体能量代谢，而糖脂代谢异常在IPF的发生发展中亦具有重要作用[59-60]。据此推测，泰式菌属可能通过能量代谢途径参与IPF的发生发展。
值得注意的是，将本研究与此前发表的MR研究[17]进行比较，发现两项研究结果存在较大差异，见图4。其原因可能是数据来源及方法学上的异质性。对于两项研究，我们采取求同存异的态度，认为两项研究结果可互为补充，作为外部验证，如两项研究都发现瘤胃球菌属与IPF发生显著相关，促使我们更加关注这一菌群在IPF中的作用，期待未来开展更多相关研究进行探索。
图4
本研究与既往研究[17]结果比较
本研究具有以下创新性：（1）本研究从肠-肺轴出发，以肠道菌群为暴露因素，讨论其与IPF之间的因果作用，具有较强的理论和临床价值；（2）本研究以大样本GWAS统计数据为研究基础，对肠道菌群与IPF的因果关系进行了探索；（3）本研究采用两样本、双向MR方法，通过严格的IVs筛选、多样化的分析方法及规范的质量控制标准评估肠道菌群和IPF的双向因果关联，结果具有稳定性和可靠性。
本研究亦存在一定的局限性：（1）目前可用的GWAS数据多源于欧洲人群，本研究对中国人群的适用性有待考证；（2）GWAS统计数据较为笼统，未包括各样本的一般信息，如年龄、性别、受教育程度等，可能造成潜在的非线形关系；（3）有必要进一步结合多组学数据深入挖掘肠道菌群介导IPF发生发展的生物学机制[51]。
综上所述，我们采用两样本、双向MR方法，探究了肠道菌群与IPF之间的双向因果关系，发现放线菌门、坏疽毒素梭状芽胞杆菌属和链球菌属可增加IPF发病风险，而双歧杆菌属、瘤胃球菌属和泰氏菌属可降低IPF发病风险。在未来的研究中，可聚焦上述菌群深入探索IPF发生发展的病理机制。
利益冲突：无。
作者贡献：吴宣諭负责选题与研究设计，数据分析，论文撰写与修改；肖祥负责方法整合，数据整理与分析，论文撰写与修改；陈嘉靖、于晓敏负责论文审阅与校对；杨晗负责论文设计和整体修改。
