食管癌（esophageal cancer，EC）是第8大常见癌症，也是全球癌症死亡的第6大原因，严重影响全球人类健康[1]。食管癌的5年生存率很低，约为12%～20%[2]。吸烟和饮酒是食管癌的两大危险因素[3-6]。此外，遗传易感性、体质量指数增加、必需微量营养素摄入、口腔感染和饮食改变等因素也是食管癌高发的诱因[7-10]。目前，食管癌的治疗采用包括手术、化学治疗、放射治疗和免疫靶向治疗在内的综合治疗为主[11]，但针对食管癌病因的干预方式较少，及时针对病因进行干预降低食管癌发生率，有助于改善食管癌患者的生存。
肠道菌群与人体新陈代谢、免疫调节和神经内分泌系统密切相关[12]。健康人90% 以上的细菌来自厚壁菌门和拟杆菌门，其次是疣微菌门、变形菌门和放线菌门，共占微生物的99%[13]。越来越多的证据表明，食管癌患者的特定细菌和细菌菌群失调，可通过破坏DNA、激活致癌信号通路、产生促瘤代谢物和抑制抗肿瘤免疫来促进食管癌进展[14]。Zhou等[15]发现，高丰度的产酸细菌（主要是乳酸杆菌、双歧杆菌、葡萄球菌和链球菌）可通过乳酸代谢失调促进致癌作用。Münch等[16]使用Barrett食管的动物模型发现，高脂肪饮食诱导的肠道微生物群变化导致促炎细胞因子和免疫细胞水平升高，继而导致促肿瘤免疫表型。肠道微生物可起保护作用，其扰动和水平降低能促进炎性反应和缩短生存时间[17]。根据这些研究，塑造肠道微生物群的组成可能有望实现有效和特异性的抗肿瘤免疫反应。基于此，我们从孟德尔遗传角度出发，对肠道菌群和食管癌的关系进行研究。
与观察性研究不同，孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）分析是使用遗传变异作为工具变量（instrumentalvariables，IVs）来推断暴露与结果之间的因果关系，遗传变异和结局之间不受混杂因素的影响，可作为研究肠道微生物与食管癌之间因果关系的一种新方法[18]。MR已被广泛用于研究肠道微生物与疾病之间的关联，包括癌症[19]、免疫性疾病[20]、代谢性疾病[21]。在该研究中，我们使用全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）的汇总统计数据进行双向MR分析，以评估肠道菌群和食管癌的因果关系。
1 资料与方法
1.1 研究设计
本研究将肠道菌群作为暴露因素，选取显著相关的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）作为IVs，食管癌作为结局变量。基于公开的GWAS汇总统计数据，使用双样本双向MR分析方法评估196个细菌分类群与食管癌之间的因果关系。使用异质性检验和水平多效性检验等分析方法验证结果的可靠性和稳定性。此外进行反向MR分析，以探究食管癌和与食管癌存在因果关系的肠道菌群之间是否存在反向因果关系。
本研究需遵循MR研究方法的3种关键假设：（1）IVs与肠道菌群之间存在显著关联；（2）IVs与肠道菌群-食管癌的所有混杂因素均不相关；（3）IVs只能通过肠道菌群影响食管癌，而不是通过其他任何途径；见图1。
图1
孟德尔随机化分析的假设图
1.2 数据来源
肠道菌群遗传数据来源于规模最大的MiBioGen联盟发表的GWAS，MiBioGen联盟收集了来自欧洲、美国等11个国家的18340例（欧洲血统13266例）受试者的16s RNA基因测序谱和基因分型数据，对肠道微生物组特征位点进行分析[22]。该分析共包括211个细菌分类群，属是最低的细菌分类水平，包括15个未知属，因此我们将196个细菌分类群纳入本次研究[23-24]。食管癌遗传数据来自GWAS摘要数据中的英国生物样本数据（UK Biobank），包括740例食管癌患者和372016例对照患者，均为欧洲血统。由于使用的是公开数据库，因此不再提供原始数据列表。
1.3 工具变量选择
研究预先根据全位点显著性阈值P＜5.0×10−8选择与肠道菌群相关的SNP，由于某些肠道菌群的SNP无法提取或个数<3个，因此我们放宽了阈值要求，根据P＜1.0×10−5选择显著相关的SNP[25-26]。根据以下质量控制条件进一步筛选SNP，以确保肠道菌群与食管癌之间存在因果关系的准确性：（1）排除暴露和结局样本之间等位基因不一致的SNP，如A/C；（2）去除回文SNP；（3）设置系数r2阈值0.001，设定区域宽度10000 kb，以排除连锁不平衡的干扰；（4）去除等位基因频率（minor allele frequency，MAF）<0.01的SNP；（5）通过phenoscanner网站（www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk）查询并去除与暴露-结局有关的混杂因素的SNP，包括吸烟、饮酒、体质量指数等[5, 27]，如 rs10167839（既往吸烟史），rs3734633（体质量指数）。MR-Egger回归和孟德尔随机多态性残差和离群值（Mendelian randomization pleiotropy residual sum and outlier，MR-PRESSO）检验潜在的水平多效性[28-29]。MR-Egger回归用于评估整体SNP的平均水平多效性，而MR-PRESSO可以检测每个异常SNP，并通过去除异常值来消除水平多效性，即通过去除具有水平多效性的SNP重新进行MR分析。对于显著相关的SNP，我们采用F统计量来评估所选择的遗传变量是否为弱IVs，F＞10表示遗传变量不存在弱IVs偏倚[30]，F统计量计算公式为R2（n−k−1）/k（1−R2），其中n代表暴露样本数量，k代表SNP的数量，R2代表SNP解释的变异的占比。
1.4 孟德尔随机化分析
本研究采用MR-随机或固定效应逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）、加权中位数估计（weighted median estimation，WME）、MR-Egger回归、单一模式（simple mode，SM）和加权模式（weighted mode，WM）5种方法验证196个类群的肠道菌群与食管癌之间是否存在因果关系。IVW方法是使用Wald比值法进行单个SNP的关联，然后再选择固定效应或随机效应模型对多个位点效应进行Meta汇总，能够提供最准确的效应估计值[18]。对于仅包含1个SNP的IVs，采用Wald比值法进行MR分析[31]。WME方法的前提是基于至少50%的IVs是有效假设，给出准确的评估结果[31]。MR-Egger回归考虑到截距项的存在，可以检测和调整水平多效性，如果不存在水平多效性，那么MR-Egger回归和IVW的结果基本一致[18]。SM和WM方法也是MR分析中的2种重要统计学方法[32]。本研究以IVW分析方法为主，其他方法作为补充。
1.5 敏感性分析
为进一步检验研究结果的准确性和稳定性，我们使用异质性检验、多效性水平检验和留一法（leave-one-out）进行敏感性分析。Cochrane’s Q 检验用于评估每个细菌相关的SNP的异质性，如果存在异质性（P≤0.05），则使用随机IVW方法；如果不存在异质性（P＞0.05），则使用固定IVW方法。留一法用于评估MR因果关系是否由单个SNP驱动。MR-Egger回归检验的截距项与0差异很大时，说明存在水平多效性[18, 33]，此时需要用MR-PRESSO剔除异常SNP来消除水平多效性，并重新进行MR分析。
1.6 统计学分析
本研究使用R软件（版本4.2.0）的TwosampleMR包和MR-PRESSO R包进行数据分析，P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 孟德尔随机化结果
根据IVs的筛选标准，对196个类群的肠道微生物的GWAS数据进行SNP筛选，所有SNP的F统计量均>10，不存在弱IVs偏倚，最终用于MR分析的是8个类群的72个SNP（SNP特征见附件表1，https://www.tcsurg.org/article/10.7507/1007-4848.202403016）。
IVW结果表明，8个类群的肠道微生物与食管癌存在因果关系，其中草酸杆菌科（P=0.023）、粪杆菌属（P=0.028）、塞内加尔菌属（P=0.006）和韦荣氏球菌属（P=0.018）可能是食管癌的危险因素，伯克霍尔德氏菌目（P=0.002）、真杆菌属氧化还原类（P=0.038）、罗姆布茨菌属（P=0.048）和苏黎世杆菌属（P=0.013）可能是食管癌的保护因素（表1）。图2显示了5种MR分析方法的研究结果，所有的Beta方向一致。
表1
MR分析的主要结果
图2
肠道菌群与食管癌孟德尔随机化分析的散点图
a～h：分别为伯克霍尔德氏菌目、草酸杆菌科、粪杆菌属、真杆菌属氧化还原类、罗姆布茨菌属、塞内加尔菌属、苏黎世杆菌属、韦荣氏球菌属与食管癌之间相关性的散点图；SNP：单核苷酸多态性
2.2 敏感性分析
对8个类群的肠道微生物进行Cochrane’s Q异质性检验，P均>0.05，即不存在异质性。MR-Egger回归检验的截距项和0进行统计检验，P均>0.05，MR-PRESSO检验未发现异常值，P＞0.05，表明不存在水平多效性（表2）。
表2
敏感性分析结果
留一法分析发现，纳入的IVs的效应值和总效应值大小较为接近，尚未发现对因果关系有显著影响的SNP（图3）。上述结果表明，8个类群的肠道微生物与食管癌之间的因果关系稳定。
图3
肠道菌群与食管癌的留一法敏感性分析结果
a～h：分别为伯克霍尔德氏菌目、草酸杆菌科、粪杆菌属、真杆菌属氧化还原类、罗姆布茨菌属、塞内加尔菌属、苏黎世杆菌属、韦荣氏球菌属与食管癌之间相关性的留一法敏感性分析
2.3 反向孟德尔随机化分析
以食管癌作为暴露，与食管癌有因果关系的肠道微生物（草酸杆菌科、粪杆菌属、塞内加尔菌属、韦荣氏球菌属、伯克霍尔德氏菌目、真杆菌属氧化还原类、罗姆布茨菌属、苏黎世杆菌属）作为结局进行了反向MR分析，研究并未发现显著的因果关系，表3仅展示IVW方法分析结果。敏感性分析未发现异质性和水平多效性的存在（表4）。
表3
反向MR分析结果
表4
反向MR的敏感性分析结果
3 讨论
本研究分析了肠道菌群与食管癌之间是否存在因果关系，结果表明，草酸杆菌科、粪杆菌属、塞内加尔菌属和韦荣氏球菌属与食管癌发病风险增加有关，而伯克霍尔德氏菌目、真杆菌属氧化还原类、罗姆布茨菌属和苏黎世杆菌属则是食管癌的保护因素。
肠道微生物可能通过多种机制影响食管癌，这些机制涉及人体免疫系统和信号通路之间的复杂作用[34-36]。一方面，肠道微生物主要通过炎症反应和富含生态失调的菌群产生致癌化合物来介导致癌效应[37-41]，如通过炎症反应产生的硝酸盐可促进肠杆菌科等兼性厌氧菌富集，引起微生物失调-炎症-微生物失调的恶性循环[42]。此外，粪肠球菌和粪梭杆菌分别会产生超氧化物和硫化氢，从而导致双链 DNA 断裂和染色体不稳定[42-43]；弯曲杆菌属和螺旋杆菌属通过产生遗传性毒性化合物（如细胞致死性扩张毒素和大肠杆菌素）来调节致癌作用[44-45]。虽然韦荣氏球菌属在食管癌中的作用机制研究较少，但研究[36, 46]已明确指出，与健康对照组相比，食管癌患者的韦荣氏球菌属丰度显著增加，这与本研究结果一致。另一方面，肠道微生物可能会通过产生短链脂肪酸（如丁酸盐）或调节抗肿瘤免疫力来介导肿瘤抑制作用[41]。真杆菌氧化还原类菌群通过合成丁酸盐抑制肿瘤进展[47-48]。伯克霍尔德氏菌可作为一种益生菌来调节肠道微生物群的多样性，从而提高抗肿瘤免疫力[49]。Deng 等[50]对23例食管癌患者进行的一项16s RNA 基因测序分析发现，食管癌患者的罗姆布茨菌属丰度较健康对照组显著增加，这与本研究结果［OR=0.999，95%CI（0.998，1.000），P=0.048］存在差异，有必要进行多中心对照试验和基础实验研究来探索罗姆布茨菌属的作用机制。
本研究首次表明苏黎世杆菌对食管癌具有保护作用。越来越多的研究表明，苏黎世杆菌与多种疾病有关，包括结肠癌[51]、食管上皮萎缩[52]、虹膜黄素病[52]、胃癌[53]、胰腺癌[54]和创伤后骨关节炎[55]。中草药抗癌鸡尾酒汤能引起苏黎世杆菌丰度显著提高，进而通过Th17途径激活免疫细胞，导致结肠癌细胞的破坏[51]。苏黎世杆菌与免疫调节细胞有关，或许这正是苏黎世杆菌对食管癌具有保护作用的原因，但其确切作用仍需进一步探索。值得注意的是，本研究发现了2种未报道过的与食管癌相关的细菌，即塞内加尔菌属和草酸杆菌科，它们都是食管癌的危险因素。目前研究仅发现塞内加尔菌属与慢性肾脏病[26]和多囊卵巢综合征[56]有关。草酸杆菌科与多种疾病相关，包括多囊卵巢综合征[57]、结直肠癌[58]、胆道癌[59]、炎症性肠病[60]和克罗恩病[60]等。虽然目前尚无文献揭示这2种细菌与食管癌之间的关系，但本研究提示它们可能是食管癌进展的危险因素，值得进一步探索研究。
本研究的主要优点是减少了混杂因素和反向因果关系对结果的干扰，这比观察性研究更具有说服力，提高了研究结果的可信度。然而，这项研究也存在一些局限性。首先，由于使用的数据是在线汇总统计数据，因此无法对包括性别在内的差异进行亚组分析，这可能会带来潜在偏倚。其次，为获得SNP，我们将遗传变异的阈值设定为 P＜1.0×10−5，可能会造成弱IVs偏倚。第三，虽然GWAS中的肠道菌群数据大多是欧洲血统，但必须考虑到人群分层干扰的可能性，从而导致估计结果偏倚和影响普遍性。
综上所述，本研究采用了双样本双向MR分析来探讨肠道菌群和食管癌的因果关系。研究结果表明二者存在因果关系。虽然肠道菌群在食管癌发病过程中的作用机制尚不清楚，但本研究为未来肠道菌群与食管癌之间的研究提供了参考。
利益冲突：无。
作者贡献：汪梦梦、高铭骏负责选题与研究设计，撰写论文；周嗣丁、田澍雨负责统计分析，论文修改；束余声、王霄霖负责文章审阅和定稿。
食管癌（esophageal cancer，EC）是第8大常见癌症，也是全球癌症死亡的第6大原因，严重影响全球人类健康[1]。食管癌的5年生存率很低，约为12%～20%[2]。吸烟和饮酒是食管癌的两大危险因素[3-6]。此外，遗传易感性、体质量指数增加、必需微量营养素摄入、口腔感染和饮食改变等因素也是食管癌高发的诱因[7-10]。目前，食管癌的治疗采用包括手术、化学治疗、放射治疗和免疫靶向治疗在内的综合治疗为主[11]，但针对食管癌病因的干预方式较少，及时针对病因进行干预降低食管癌发生率，有助于改善食管癌患者的生存。
肠道菌群与人体新陈代谢、免疫调节和神经内分泌系统密切相关[12]。健康人90% 以上的细菌来自厚壁菌门和拟杆菌门，其次是疣微菌门、变形菌门和放线菌门，共占微生物的99%[13]。越来越多的证据表明，食管癌患者的特定细菌和细菌菌群失调，可通过破坏DNA、激活致癌信号通路、产生促瘤代谢物和抑制抗肿瘤免疫来促进食管癌进展[14]。Zhou等[15]发现，高丰度的产酸细菌（主要是乳酸杆菌、双歧杆菌、葡萄球菌和链球菌）可通过乳酸代谢失调促进致癌作用。Münch等[16]使用Barrett食管的动物模型发现，高脂肪饮食诱导的肠道微生物群变化导致促炎细胞因子和免疫细胞水平升高，继而导致促肿瘤免疫表型。肠道微生物可起保护作用，其扰动和水平降低能促进炎性反应和缩短生存时间[17]。根据这些研究，塑造肠道微生物群的组成可能有望实现有效和特异性的抗肿瘤免疫反应。基于此，我们从孟德尔遗传角度出发，对肠道菌群和食管癌的关系进行研究。
与观察性研究不同，孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）分析是使用遗传变异作为工具变量（instrumentalvariables，IVs）来推断暴露与结果之间的因果关系，遗传变异和结局之间不受混杂因素的影响，可作为研究肠道微生物与食管癌之间因果关系的一种新方法[18]。MR已被广泛用于研究肠道微生物与疾病之间的关联，包括癌症[19]、免疫性疾病[20]、代谢性疾病[21]。在该研究中，我们使用全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）的汇总统计数据进行双向MR分析，以评估肠道菌群和食管癌的因果关系。
1 资料与方法
1.1 研究设计
本研究将肠道菌群作为暴露因素，选取显著相关的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）作为IVs，食管癌作为结局变量。基于公开的GWAS汇总统计数据，使用双样本双向MR分析方法评估196个细菌分类群与食管癌之间的因果关系。使用异质性检验和水平多效性检验等分析方法验证结果的可靠性和稳定性。此外进行反向MR分析，以探究食管癌和与食管癌存在因果关系的肠道菌群之间是否存在反向因果关系。
本研究需遵循MR研究方法的3种关键假设：（1）IVs与肠道菌群之间存在显著关联；（2）IVs与肠道菌群-食管癌的所有混杂因素均不相关；（3）IVs只能通过肠道菌群影响食管癌，而不是通过其他任何途径；见图1。
图1
孟德尔随机化分析的假设图
1.2 数据来源
肠道菌群遗传数据来源于规模最大的MiBioGen联盟发表的GWAS，MiBioGen联盟收集了来自欧洲、美国等11个国家的18340例（欧洲血统13266例）受试者的16s RNA基因测序谱和基因分型数据，对肠道微生物组特征位点进行分析[22]。该分析共包括211个细菌分类群，属是最低的细菌分类水平，包括15个未知属，因此我们将196个细菌分类群纳入本次研究[23-24]。食管癌遗传数据来自GWAS摘要数据中的英国生物样本数据（UK Biobank），包括740例食管癌患者和372016例对照患者，均为欧洲血统。由于使用的是公开数据库，因此不再提供原始数据列表。
1.3 工具变量选择
研究预先根据全位点显著性阈值P＜5.0×10−8选择与肠道菌群相关的SNP，由于某些肠道菌群的SNP无法提取或个数<3个，因此我们放宽了阈值要求，根据P＜1.0×10−5选择显著相关的SNP[25-26]。根据以下质量控制条件进一步筛选SNP，以确保肠道菌群与食管癌之间存在因果关系的准确性：（1）排除暴露和结局样本之间等位基因不一致的SNP，如A/C；（2）去除回文SNP；（3）设置系数r2阈值0.001，设定区域宽度10000 kb，以排除连锁不平衡的干扰；（4）去除等位基因频率（minor allele frequency，MAF）<0.01的SNP；（5）通过phenoscanner网站（www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk）查询并去除与暴露-结局有关的混杂因素的SNP，包括吸烟、饮酒、体质量指数等[5, 27]，如 rs10167839（既往吸烟史），rs3734633（体质量指数）。MR-Egger回归和孟德尔随机多态性残差和离群值（Mendelian randomization pleiotropy residual sum and outlier，MR-PRESSO）检验潜在的水平多效性[28-29]。MR-Egger回归用于评估整体SNP的平均水平多效性，而MR-PRESSO可以检测每个异常SNP，并通过去除异常值来消除水平多效性，即通过去除具有水平多效性的SNP重新进行MR分析。对于显著相关的SNP，我们采用F统计量来评估所选择的遗传变量是否为弱IVs，F＞10表示遗传变量不存在弱IVs偏倚[30]，F统计量计算公式为R2（n−k−1）/k（1−R2），其中n代表暴露样本数量，k代表SNP的数量，R2代表SNP解释的变异的占比。
1.4 孟德尔随机化分析
本研究采用MR-随机或固定效应逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）、加权中位数估计（weighted median estimation，WME）、MR-Egger回归、单一模式（simple mode，SM）和加权模式（weighted mode，WM）5种方法验证196个类群的肠道菌群与食管癌之间是否存在因果关系。IVW方法是使用Wald比值法进行单个SNP的关联，然后再选择固定效应或随机效应模型对多个位点效应进行Meta汇总，能够提供最准确的效应估计值[18]。对于仅包含1个SNP的IVs，采用Wald比值法进行MR分析[31]。WME方法的前提是基于至少50%的IVs是有效假设，给出准确的评估结果[31]。MR-Egger回归考虑到截距项的存在，可以检测和调整水平多效性，如果不存在水平多效性，那么MR-Egger回归和IVW的结果基本一致[18]。SM和WM方法也是MR分析中的2种重要统计学方法[32]。本研究以IVW分析方法为主，其他方法作为补充。
1.5 敏感性分析
为进一步检验研究结果的准确性和稳定性，我们使用异质性检验、多效性水平检验和留一法（leave-one-out）进行敏感性分析。Cochrane’s Q 检验用于评估每个细菌相关的SNP的异质性，如果存在异质性（P≤0.05），则使用随机IVW方法；如果不存在异质性（P＞0.05），则使用固定IVW方法。留一法用于评估MR因果关系是否由单个SNP驱动。MR-Egger回归检验的截距项与0差异很大时，说明存在水平多效性[18, 33]，此时需要用MR-PRESSO剔除异常SNP来消除水平多效性，并重新进行MR分析。
1.6 统计学分析
本研究使用R软件（版本4.2.0）的TwosampleMR包和MR-PRESSO R包进行数据分析，P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 孟德尔随机化结果
根据IVs的筛选标准，对196个类群的肠道微生物的GWAS数据进行SNP筛选，所有SNP的F统计量均>10，不存在弱IVs偏倚，最终用于MR分析的是8个类群的72个SNP（SNP特征见附件表1，https://www.tcsurg.org/article/10.7507/1007-4848.202403016）。
IVW结果表明，8个类群的肠道微生物与食管癌存在因果关系，其中草酸杆菌科（P=0.023）、粪杆菌属（P=0.028）、塞内加尔菌属（P=0.006）和韦荣氏球菌属（P=0.018）可能是食管癌的危险因素，伯克霍尔德氏菌目（P=0.002）、真杆菌属氧化还原类（P=0.038）、罗姆布茨菌属（P=0.048）和苏黎世杆菌属（P=0.013）可能是食管癌的保护因素（表1）。图2显示了5种MR分析方法的研究结果，所有的Beta方向一致。
表1
MR分析的主要结果
图2
肠道菌群与食管癌孟德尔随机化分析的散点图
a～h：分别为伯克霍尔德氏菌目、草酸杆菌科、粪杆菌属、真杆菌属氧化还原类、罗姆布茨菌属、塞内加尔菌属、苏黎世杆菌属、韦荣氏球菌属与食管癌之间相关性的散点图；SNP：单核苷酸多态性
2.2 敏感性分析
对8个类群的肠道微生物进行Cochrane’s Q异质性检验，P均>0.05，即不存在异质性。MR-Egger回归检验的截距项和0进行统计检验，P均>0.05，MR-PRESSO检验未发现异常值，P＞0.05，表明不存在水平多效性（表2）。
表2
敏感性分析结果
留一法分析发现，纳入的IVs的效应值和总效应值大小较为接近，尚未发现对因果关系有显著影响的SNP（图3）。上述结果表明，8个类群的肠道微生物与食管癌之间的因果关系稳定。
图3
肠道菌群与食管癌的留一法敏感性分析结果
a～h：分别为伯克霍尔德氏菌目、草酸杆菌科、粪杆菌属、真杆菌属氧化还原类、罗姆布茨菌属、塞内加尔菌属、苏黎世杆菌属、韦荣氏球菌属与食管癌之间相关性的留一法敏感性分析
2.3 反向孟德尔随机化分析
以食管癌作为暴露，与食管癌有因果关系的肠道微生物（草酸杆菌科、粪杆菌属、塞内加尔菌属、韦荣氏球菌属、伯克霍尔德氏菌目、真杆菌属氧化还原类、罗姆布茨菌属、苏黎世杆菌属）作为结局进行了反向MR分析，研究并未发现显著的因果关系，表3仅展示IVW方法分析结果。敏感性分析未发现异质性和水平多效性的存在（表4）。
表3
反向MR分析结果
表4
反向MR的敏感性分析结果
3 讨论
本研究分析了肠道菌群与食管癌之间是否存在因果关系，结果表明，草酸杆菌科、粪杆菌属、塞内加尔菌属和韦荣氏球菌属与食管癌发病风险增加有关，而伯克霍尔德氏菌目、真杆菌属氧化还原类、罗姆布茨菌属和苏黎世杆菌属则是食管癌的保护因素。
肠道微生物可能通过多种机制影响食管癌，这些机制涉及人体免疫系统和信号通路之间的复杂作用[34-36]。一方面，肠道微生物主要通过炎症反应和富含生态失调的菌群产生致癌化合物来介导致癌效应[37-41]，如通过炎症反应产生的硝酸盐可促进肠杆菌科等兼性厌氧菌富集，引起微生物失调-炎症-微生物失调的恶性循环[42]。此外，粪肠球菌和粪梭杆菌分别会产生超氧化物和硫化氢，从而导致双链 DNA 断裂和染色体不稳定[42-43]；弯曲杆菌属和螺旋杆菌属通过产生遗传性毒性化合物（如细胞致死性扩张毒素和大肠杆菌素）来调节致癌作用[44-45]。虽然韦荣氏球菌属在食管癌中的作用机制研究较少，但研究[36, 46]已明确指出，与健康对照组相比，食管癌患者的韦荣氏球菌属丰度显著增加，这与本研究结果一致。另一方面，肠道微生物可能会通过产生短链脂肪酸（如丁酸盐）或调节抗肿瘤免疫力来介导肿瘤抑制作用[41]。真杆菌氧化还原类菌群通过合成丁酸盐抑制肿瘤进展[47-48]。伯克霍尔德氏菌可作为一种益生菌来调节肠道微生物群的多样性，从而提高抗肿瘤免疫力[49]。Deng 等[50]对23例食管癌患者进行的一项16s RNA 基因测序分析发现，食管癌患者的罗姆布茨菌属丰度较健康对照组显著增加，这与本研究结果［OR=0.999，95%CI（0.998，1.000），P=0.048］存在差异，有必要进行多中心对照试验和基础实验研究来探索罗姆布茨菌属的作用机制。
本研究首次表明苏黎世杆菌对食管癌具有保护作用。越来越多的研究表明，苏黎世杆菌与多种疾病有关，包括结肠癌[51]、食管上皮萎缩[52]、虹膜黄素病[52]、胃癌[53]、胰腺癌[54]和创伤后骨关节炎[55]。中草药抗癌鸡尾酒汤能引起苏黎世杆菌丰度显著提高，进而通过Th17途径激活免疫细胞，导致结肠癌细胞的破坏[51]。苏黎世杆菌与免疫调节细胞有关，或许这正是苏黎世杆菌对食管癌具有保护作用的原因，但其确切作用仍需进一步探索。值得注意的是，本研究发现了2种未报道过的与食管癌相关的细菌，即塞内加尔菌属和草酸杆菌科，它们都是食管癌的危险因素。目前研究仅发现塞内加尔菌属与慢性肾脏病[26]和多囊卵巢综合征[56]有关。草酸杆菌科与多种疾病相关，包括多囊卵巢综合征[57]、结直肠癌[58]、胆道癌[59]、炎症性肠病[60]和克罗恩病[60]等。虽然目前尚无文献揭示这2种细菌与食管癌之间的关系，但本研究提示它们可能是食管癌进展的危险因素，值得进一步探索研究。
本研究的主要优点是减少了混杂因素和反向因果关系对结果的干扰，这比观察性研究更具有说服力，提高了研究结果的可信度。然而，这项研究也存在一些局限性。首先，由于使用的数据是在线汇总统计数据，因此无法对包括性别在内的差异进行亚组分析，这可能会带来潜在偏倚。其次，为获得SNP，我们将遗传变异的阈值设定为 P＜1.0×10−5，可能会造成弱IVs偏倚。第三，虽然GWAS中的肠道菌群数据大多是欧洲血统，但必须考虑到人群分层干扰的可能性，从而导致估计结果偏倚和影响普遍性。
综上所述，本研究采用了双样本双向MR分析来探讨肠道菌群和食管癌的因果关系。研究结果表明二者存在因果关系。虽然肠道菌群在食管癌发病过程中的作用机制尚不清楚，但本研究为未来肠道菌群与食管癌之间的研究提供了参考。
利益冲突：无。
作者贡献：汪梦梦、高铭骏负责选题与研究设计，撰写论文；周嗣丁、田澍雨负责统计分析，论文修改；束余声、王霄霖负责文章审阅和定稿。
