动脉导管未闭（patent ductus arteriosus，PDA）是常见的先天性心脏病（先心病）之一，约占所有先心病的20%[1-2]。PDA导致心肺功能改变，使心力衰竭、肺动脉高压、感染性心内膜炎等风险增加[3-4]。目前，经皮PDA介入封堵术在世界范围内得到广泛应用并逐渐成为PDA的首选治疗方法[5-6]。为研究PDA的介入治疗器材及病理生理改变，需要建立合适的动物模型，但既往小动物模型多采用转基因大鼠或小鼠[7]，费用昂贵，在血流动力学和病理生理等方面不能很好地模拟人类PDA，而且无法行介入封堵手术。既往研究[8-9]显示，犬的PDA动物模型建模成功率仅50%左右，这主要是由于既往建模方法存在手术创伤大、操作困难等缺点 [8, 10-14]。巴马小型猪的心脏解剖、血流动力学和病理生理等特点与人类相近，不但能模拟PDA对心肺功能的影响，而且可以进行经外周血管的封堵实验。本研究拟通过使用巴马小型猪自体颈静脉吻合至升主动脉和主肺动脉之间，建立一个简单、安全、可靠的PDA大动物模型，为PDA封堵器研制及先心病相关肺动脉高压研究提供稳定的动物平台。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性巴马小型猪5头，体重35.5～61.1（45.7±7.57）kg，术前经超声检查不合并心脏解剖异常。实验动物和实验场地均由中国医学科学院阜外医院西山实验基地大动物平台提供。
1.2 术前准备及麻醉
术前禁食8 h，全身麻醉后将动物仰卧位固定于手术台上，经口气管插管连接呼吸机，潮气量10 mL/kg，呼吸频率15次/min，术中根据血气结果适当调节呼吸机参数。根据超声评估颈静脉的合适节段作为目标血管并用记号笔标记（图1a）。手术区域消毒，铺无菌单。
图1
动脉导管未闭建模过程图
a：术前超声测量颈静脉（箭头所示）直径；b：丝线结扎颈静脉（箭头所示）近、远端；c：经戊二醛固定后的颈静脉；d：颈静脉（箭头所示）吻合于升主动脉（Ao）和主肺动脉（PA）之间
1.3 获取颈静脉
根据术前标记，于颈部中线偏右侧约2 cm做5 cm切口，游离右颈静脉，分别用7号丝线结扎近、远端（图1b），切断取下约3 cm长的颈静脉，尽量剥离颈静脉外膜组织，套于10 mL注射器针帽并置于0.625%戊二醛中固定15 min，生理盐水清洗干净后，无菌湿纱布包裹备用（图1c）。常规逐层缝合颈静脉切口。
1.4 模型制作
胸骨正中切口，劈开胸骨后牵开器撑开，剪开心包并悬吊，游离主、肺动脉间隔，静脉注射肝素100 U/kg，使活化凝血时间（activated clotting time，ACT）>250 s。侧壁钳阻断部分升主动脉后观察血压、心率等参数，血流动力学稳定后将处理好的颈静脉使用6-0 prolene线连续缝合，端侧吻合于升主动脉，确认吻合口无渗血后，使用哈巴狗夹夹闭颈静脉并移除主动脉侧壁钳。侧壁钳部分阻断主肺动脉近端，确认血流动力学稳定，使用6-0 prolene线将颈静脉另一侧端侧吻合于主肺动脉，打结前行吻合口排气完成最终吻合（图1d）。检查吻合口无出血后，通过超声或心血管造影确认PDA通畅情况。心包不缝合，留置1根心包引流管，仔细止血，钢丝闭合胸骨，逐层缝合肌肉及皮肤层，关胸。
1.5 术后管理
术后预防性使用抗生素1周（每次静脉滴注头孢呋辛钠1.5 g，2次/d）。术后即刻经胃管给予阿司匹林300 mg及氯吡格雷225 mg，术后第1天开始每日给予阿司匹林100 mg及氯吡格雷75 mg。视引流量情况于术后第2天左右拔除心包引流管。
1.6 经股静脉介入封堵
术后1周时超声确认PDA通畅后，动物全身麻醉仰卧固定于手术台。切开右腹股沟，分别游离股动脉、股静脉后穿刺置入鞘管，升主动脉造影明确PDA走行及通畅情况（图2a）。放射线引导下经右股静脉将网篮导丝置于肺动脉，经右股动脉置入6Fr MPA2导管及260 cm泥鳅导丝，泥鳅导丝通过PDA后在肺动脉内被网篮导丝抓捕，回撤网篮导丝至体外，通过泥鳅导丝建立股静脉-主肺动脉-PDA-升主动脉-股动脉轨道，经股静脉置入10Fr输送鞘至升主动脉，将PDA封堵器（上海形状记忆公司，图2b）收入装载鞘内，使用钢尺标记封堵器从刚穿出输送鞘至完全释放出来时输送钢缆的长度（图2c）。在超声引导下，先释放封堵器主动脉侧，拉紧成型线，回撤封堵器紧贴主动脉后，固定钢缆，回撤输送鞘管全部释放出封堵器，超声显示PDA处分流消失后，剪断并抽出成型线，完全释放封堵器，再次超声和升主动脉造影确定封堵完全后，拔除股动、静脉鞘管并逐层缝合切口。
图2
动脉导管未闭经皮介入封堵示意图
a：术前升主动脉（Ao）造影显示动脉导管未闭（箭头所示）通畅，主肺动脉（PA）同时显影；b：完全可吸收封堵器实物图，箭头所示为成型线；c：封堵器植入前使用钢尺标记封堵器从刚冒出输送鞘至完全释放出来时输送钢缆的长度
1.7 解剖学及组织学检查
术后即刻及术后1周，实验动物复查完超声和心血管造影后处死。取肺组织、PDA及其连接的大动脉，用生理盐水冲洗干净，使用10%甲醛溶液固定48 h。再经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片和苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后在显微镜下观察。
1.8 伦理审查
本研究经中国医学科学院阜外医院医学伦理委员会审批，批准号：0104-1-10-ZX（X）-30。
2 结果
2.1 建模情况
5头动物均顺利完成手术，1头动物即刻取材，4头动物饲养1周后生命体征正常，造模成功率100.0%。5头动物术前超声测量右颈外静脉直径（4.6±0.6）mm，获取颈静脉耗时（12.6±3.4）min。颈静脉与主动脉和肺动脉端侧吻合时间（13.2±1.6）min，未出现出血、血压难以维持等可能引起动物死亡的情况。手术台上PDA可触及明显连续性震颤，术后即刻及术后1周复查超声及心血管造影显示PDA血流通畅。
2.2 经股静脉PDA封堵情况
PDA通畅的2头实验动物顺利完成经股静脉PDA封堵术，从股静脉穿刺至拔除血管鞘的手术时间分别为52 min、43 min。术中导丝难以经肺动脉侧通过PDA进入主动脉内，但经主动脉侧通过PDA进入肺动脉侧可轻松建立封堵轨道。封堵后动物血流动力学平稳，造影显示动脉水平分流消失，无残余分流、心脏和血管损伤等并发症。
2.3 解剖学及组织学检查
实验动物术后即刻和术后1周取材，肉眼见PDA各吻合口通畅，PDA外形呈管状，其内未见血栓、吻合口瘘或膨出瘤形成（图3a～c）；术后1周HE染色见PDA内皮化良好（图3d）。术后1周双侧胸腔有不同程度粘连，肺组织呈鲜红色；与术后即刻取材动物相比，术后1周动物肺组织HE染色可见肺小动脉内膜及肌层增厚，肺间质增厚，肺泡内炎性渗出，中性粒细胞浸润（图4）。
图3
术后1周动脉导管未闭大体及组织学检查
a：动脉导管未闭外形呈管状，未见血栓、吻合口瘘或膨出瘤形成；b：吻合口主动脉侧（箭头所示）未见狭窄；c：肺动脉侧（箭头所示）未见狭窄；d：苏木精-伊红染色显示动脉导管未闭内膜光滑，有内皮细胞生长
图4
肺部组织学检查
与术后即刻取材动物（a～b）相比，术后1周动物（c～d）肺组织苏木精-伊红染色可见肺小动脉内膜及肌层增厚，肺间质增厚，肺泡内炎性渗出，中性粒细胞浸润；a、c：×10；b、d：×20
3 讨论
本研究选取自体颈静脉作为移植物分别与升主动脉与主肺动脉行端侧吻合，建立了相对符合PDA病理生理特点和血流动力学的大动物模型，并且使用完全可吸收封堵器完成2头动物的经股静脉PDA封堵术。本研究的优点：（1）相较使用人造血管建立PDA，使用自体血管取材方便，吻合后不容易出血，亦无需额外费用，降低实验成本。（2）相较于肋间切口，选择胸骨正中切口建立PDA模型，可降低手术对动物肺部的影响，最主要的是吻合口表浅，手术难度大大降低，并且减少出血、吻合口狭窄等并发症，提高建模成功率。本研究的难点在于：（1）巴马小型猪升主动脉、肺动脉分别自左心室、右心室发出后，很快转向背侧向深处走行，故游离暴露降主动脉和左肺动脉的难度非常大，但是正中切口经过心包悬吊、右心耳牵开和主肺间隔游离后，可提供足够的操作空间，需要注意的是使用侧壁钳部分阻断大动脉时，需要观察血压、心率等指标变化，尽量在血流动力学稳定的情况下有条不紊地进行血管吻合。（2）吻合血管的直径非常重要，血管过粗将引起分流过量导致动物心力衰竭死亡，血管过细易发生血管堵塞。本研究术前常规超声测量颈静脉直径，在游离、获取血管时操作尽量轻柔，避免过多刺激造成血管挛缩，最终获取的血管直径比较合适。（3）尽量避免影响PDA通畅性的因素。首先，本研究选用自体颈外静脉作为血管材料，从根源上避免人造血管促使血栓形成和易并发感染的缺点。其次，本研究使用戊二醛固定颈静脉，大大降低吻合难度和缩短手术时间，术中确切的吻合保证了血管的长期通畅。最后，由于小型猪凝血功能强，故PDA吻合前静脉使用肝素抗凝，并给予阿司匹林和氯吡格雷负荷量，PDA吻合后不中和肝素，并于术后第1天开始双抗治疗，足量的抗凝方案也是保证PDA通畅的一个重要原因。
本研究2头动物成功使用可降解PDA封堵器完成经股静脉介入封堵手术，该封堵器是PDO骨架，在放射线下不显影，在超声下可清晰显影[15-16]，但受巴马小型猪解剖条件限制，无论经胸超声还是食管超声，均很难完整显示PDA的走行，只能分别显示PDA主动脉或肺动脉侧血流情况，故本研究采用超声+放射线的引导方式，使用放射线建立封堵轨道，结合临床上“工作距离”的理念[17-18]，使用超声引导封堵器释放过程，最终顺利实现封堵器的稳妥放置。
本研究2头动物术后1周肺组织病理切片可见肺间质增厚、肺小动脉内膜及肌层增厚、中性粒细胞浸润等炎性改变，这提示肺血管在高流量和高压力的影响下发生了血管重构，初步形成了先心病左向右分流引起肺动脉高压的组织学改变[19]。如果使用小月龄动物并延长造模时间，相信可以更精准地模拟先心病相关肺动脉高压的病理生理改变[20]。
目前国内外尚无使用颈静脉行升主动脉与主肺动脉端侧吻合建立小型猪动物模型的报道。本研究通过优化手术材料和手术流程，建立简便、安全和稳定的动物模型。在此基础上，我们成功使用完全可吸收封堵器进行经外周血管的PDA封堵术，同时发现该动物模型可形成先心病相关肺动脉高压的病理生理改变，这为PDA介入封堵器材研发和先心病相关肺动脉高压研究打下坚实基础。
利益冲突：无。
作者贡献：李健、欧阳文斌、李文超、张敏负责实验操作，实验动物的围手术期管理，论文撰写；张凤文、庄东林、魏培坚、李航负责实验数据的采集、整理和分析；欧阳文斌、潘湘斌负责论文设计、审阅和修改，经费支持。
动脉导管未闭（patent ductus arteriosus，PDA）是常见的先天性心脏病（先心病）之一，约占所有先心病的20%[1-2]。PDA导致心肺功能改变，使心力衰竭、肺动脉高压、感染性心内膜炎等风险增加[3-4]。目前，经皮PDA介入封堵术在世界范围内得到广泛应用并逐渐成为PDA的首选治疗方法[5-6]。为研究PDA的介入治疗器材及病理生理改变，需要建立合适的动物模型，但既往小动物模型多采用转基因大鼠或小鼠[7]，费用昂贵，在血流动力学和病理生理等方面不能很好地模拟人类PDA，而且无法行介入封堵手术。既往研究[8-9]显示，犬的PDA动物模型建模成功率仅50%左右，这主要是由于既往建模方法存在手术创伤大、操作困难等缺点 [8, 10-14]。巴马小型猪的心脏解剖、血流动力学和病理生理等特点与人类相近，不但能模拟PDA对心肺功能的影响，而且可以进行经外周血管的封堵实验。本研究拟通过使用巴马小型猪自体颈静脉吻合至升主动脉和主肺动脉之间，建立一个简单、安全、可靠的PDA大动物模型，为PDA封堵器研制及先心病相关肺动脉高压研究提供稳定的动物平台。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性巴马小型猪5头，体重35.5～61.1（45.7±7.57）kg，术前经超声检查不合并心脏解剖异常。实验动物和实验场地均由中国医学科学院阜外医院西山实验基地大动物平台提供。
1.2 术前准备及麻醉
术前禁食8 h，全身麻醉后将动物仰卧位固定于手术台上，经口气管插管连接呼吸机，潮气量10 mL/kg，呼吸频率15次/min，术中根据血气结果适当调节呼吸机参数。根据超声评估颈静脉的合适节段作为目标血管并用记号笔标记（图1a）。手术区域消毒，铺无菌单。
图1
动脉导管未闭建模过程图
a：术前超声测量颈静脉（箭头所示）直径；b：丝线结扎颈静脉（箭头所示）近、远端；c：经戊二醛固定后的颈静脉；d：颈静脉（箭头所示）吻合于升主动脉（Ao）和主肺动脉（PA）之间
1.3 获取颈静脉
根据术前标记，于颈部中线偏右侧约2 cm做5 cm切口，游离右颈静脉，分别用7号丝线结扎近、远端（图1b），切断取下约3 cm长的颈静脉，尽量剥离颈静脉外膜组织，套于10 mL注射器针帽并置于0.625%戊二醛中固定15 min，生理盐水清洗干净后，无菌湿纱布包裹备用（图1c）。常规逐层缝合颈静脉切口。
1.4 模型制作
胸骨正中切口，劈开胸骨后牵开器撑开，剪开心包并悬吊，游离主、肺动脉间隔，静脉注射肝素100 U/kg，使活化凝血时间（activated clotting time，ACT）>250 s。侧壁钳阻断部分升主动脉后观察血压、心率等参数，血流动力学稳定后将处理好的颈静脉使用6-0 prolene线连续缝合，端侧吻合于升主动脉，确认吻合口无渗血后，使用哈巴狗夹夹闭颈静脉并移除主动脉侧壁钳。侧壁钳部分阻断主肺动脉近端，确认血流动力学稳定，使用6-0 prolene线将颈静脉另一侧端侧吻合于主肺动脉，打结前行吻合口排气完成最终吻合（图1d）。检查吻合口无出血后，通过超声或心血管造影确认PDA通畅情况。心包不缝合，留置1根心包引流管，仔细止血，钢丝闭合胸骨，逐层缝合肌肉及皮肤层，关胸。
1.5 术后管理
术后预防性使用抗生素1周（每次静脉滴注头孢呋辛钠1.5 g，2次/d）。术后即刻经胃管给予阿司匹林300 mg及氯吡格雷225 mg，术后第1天开始每日给予阿司匹林100 mg及氯吡格雷75 mg。视引流量情况于术后第2天左右拔除心包引流管。
1.6 经股静脉介入封堵
术后1周时超声确认PDA通畅后，动物全身麻醉仰卧固定于手术台。切开右腹股沟，分别游离股动脉、股静脉后穿刺置入鞘管，升主动脉造影明确PDA走行及通畅情况（图2a）。放射线引导下经右股静脉将网篮导丝置于肺动脉，经右股动脉置入6Fr MPA2导管及260 cm泥鳅导丝，泥鳅导丝通过PDA后在肺动脉内被网篮导丝抓捕，回撤网篮导丝至体外，通过泥鳅导丝建立股静脉-主肺动脉-PDA-升主动脉-股动脉轨道，经股静脉置入10Fr输送鞘至升主动脉，将PDA封堵器（上海形状记忆公司，图2b）收入装载鞘内，使用钢尺标记封堵器从刚穿出输送鞘至完全释放出来时输送钢缆的长度（图2c）。在超声引导下，先释放封堵器主动脉侧，拉紧成型线，回撤封堵器紧贴主动脉后，固定钢缆，回撤输送鞘管全部释放出封堵器，超声显示PDA处分流消失后，剪断并抽出成型线，完全释放封堵器，再次超声和升主动脉造影确定封堵完全后，拔除股动、静脉鞘管并逐层缝合切口。
图2
动脉导管未闭经皮介入封堵示意图
a：术前升主动脉（Ao）造影显示动脉导管未闭（箭头所示）通畅，主肺动脉（PA）同时显影；b：完全可吸收封堵器实物图，箭头所示为成型线；c：封堵器植入前使用钢尺标记封堵器从刚冒出输送鞘至完全释放出来时输送钢缆的长度
1.7 解剖学及组织学检查
术后即刻及术后1周，实验动物复查完超声和心血管造影后处死。取肺组织、PDA及其连接的大动脉，用生理盐水冲洗干净，使用10%甲醛溶液固定48 h。再经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片和苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后在显微镜下观察。
1.8 伦理审查
本研究经中国医学科学院阜外医院医学伦理委员会审批，批准号：0104-1-10-ZX（X）-30。
2 结果
2.1 建模情况
5头动物均顺利完成手术，1头动物即刻取材，4头动物饲养1周后生命体征正常，造模成功率100.0%。5头动物术前超声测量右颈外静脉直径（4.6±0.6）mm，获取颈静脉耗时（12.6±3.4）min。颈静脉与主动脉和肺动脉端侧吻合时间（13.2±1.6）min，未出现出血、血压难以维持等可能引起动物死亡的情况。手术台上PDA可触及明显连续性震颤，术后即刻及术后1周复查超声及心血管造影显示PDA血流通畅。
2.2 经股静脉PDA封堵情况
PDA通畅的2头实验动物顺利完成经股静脉PDA封堵术，从股静脉穿刺至拔除血管鞘的手术时间分别为52 min、43 min。术中导丝难以经肺动脉侧通过PDA进入主动脉内，但经主动脉侧通过PDA进入肺动脉侧可轻松建立封堵轨道。封堵后动物血流动力学平稳，造影显示动脉水平分流消失，无残余分流、心脏和血管损伤等并发症。
2.3 解剖学及组织学检查
实验动物术后即刻和术后1周取材，肉眼见PDA各吻合口通畅，PDA外形呈管状，其内未见血栓、吻合口瘘或膨出瘤形成（图3a～c）；术后1周HE染色见PDA内皮化良好（图3d）。术后1周双侧胸腔有不同程度粘连，肺组织呈鲜红色；与术后即刻取材动物相比，术后1周动物肺组织HE染色可见肺小动脉内膜及肌层增厚，肺间质增厚，肺泡内炎性渗出，中性粒细胞浸润（图4）。
图3
术后1周动脉导管未闭大体及组织学检查
a：动脉导管未闭外形呈管状，未见血栓、吻合口瘘或膨出瘤形成；b：吻合口主动脉侧（箭头所示）未见狭窄；c：肺动脉侧（箭头所示）未见狭窄；d：苏木精-伊红染色显示动脉导管未闭内膜光滑，有内皮细胞生长
图4
肺部组织学检查
与术后即刻取材动物（a～b）相比，术后1周动物（c～d）肺组织苏木精-伊红染色可见肺小动脉内膜及肌层增厚，肺间质增厚，肺泡内炎性渗出，中性粒细胞浸润；a、c：×10；b、d：×20
3 讨论
本研究选取自体颈静脉作为移植物分别与升主动脉与主肺动脉行端侧吻合，建立了相对符合PDA病理生理特点和血流动力学的大动物模型，并且使用完全可吸收封堵器完成2头动物的经股静脉PDA封堵术。本研究的优点：（1）相较使用人造血管建立PDA，使用自体血管取材方便，吻合后不容易出血，亦无需额外费用，降低实验成本。（2）相较于肋间切口，选择胸骨正中切口建立PDA模型，可降低手术对动物肺部的影响，最主要的是吻合口表浅，手术难度大大降低，并且减少出血、吻合口狭窄等并发症，提高建模成功率。本研究的难点在于：（1）巴马小型猪升主动脉、肺动脉分别自左心室、右心室发出后，很快转向背侧向深处走行，故游离暴露降主动脉和左肺动脉的难度非常大，但是正中切口经过心包悬吊、右心耳牵开和主肺间隔游离后，可提供足够的操作空间，需要注意的是使用侧壁钳部分阻断大动脉时，需要观察血压、心率等指标变化，尽量在血流动力学稳定的情况下有条不紊地进行血管吻合。（2）吻合血管的直径非常重要，血管过粗将引起分流过量导致动物心力衰竭死亡，血管过细易发生血管堵塞。本研究术前常规超声测量颈静脉直径，在游离、获取血管时操作尽量轻柔，避免过多刺激造成血管挛缩，最终获取的血管直径比较合适。（3）尽量避免影响PDA通畅性的因素。首先，本研究选用自体颈外静脉作为血管材料，从根源上避免人造血管促使血栓形成和易并发感染的缺点。其次，本研究使用戊二醛固定颈静脉，大大降低吻合难度和缩短手术时间，术中确切的吻合保证了血管的长期通畅。最后，由于小型猪凝血功能强，故PDA吻合前静脉使用肝素抗凝，并给予阿司匹林和氯吡格雷负荷量，PDA吻合后不中和肝素，并于术后第1天开始双抗治疗，足量的抗凝方案也是保证PDA通畅的一个重要原因。
本研究2头动物成功使用可降解PDA封堵器完成经股静脉介入封堵手术，该封堵器是PDO骨架，在放射线下不显影，在超声下可清晰显影[15-16]，但受巴马小型猪解剖条件限制，无论经胸超声还是食管超声，均很难完整显示PDA的走行，只能分别显示PDA主动脉或肺动脉侧血流情况，故本研究采用超声+放射线的引导方式，使用放射线建立封堵轨道，结合临床上“工作距离”的理念[17-18]，使用超声引导封堵器释放过程，最终顺利实现封堵器的稳妥放置。
本研究2头动物术后1周肺组织病理切片可见肺间质增厚、肺小动脉内膜及肌层增厚、中性粒细胞浸润等炎性改变，这提示肺血管在高流量和高压力的影响下发生了血管重构，初步形成了先心病左向右分流引起肺动脉高压的组织学改变[19]。如果使用小月龄动物并延长造模时间，相信可以更精准地模拟先心病相关肺动脉高压的病理生理改变[20]。
目前国内外尚无使用颈静脉行升主动脉与主肺动脉端侧吻合建立小型猪动物模型的报道。本研究通过优化手术材料和手术流程，建立简便、安全和稳定的动物模型。在此基础上，我们成功使用完全可吸收封堵器进行经外周血管的PDA封堵术，同时发现该动物模型可形成先心病相关肺动脉高压的病理生理改变，这为PDA介入封堵器材研发和先心病相关肺动脉高压研究打下坚实基础。
利益冲突：无。
作者贡献：李健、欧阳文斌、李文超、张敏负责实验操作，实验动物的围手术期管理，论文撰写；张凤文、庄东林、魏培坚、李航负责实验数据的采集、整理和分析；欧阳文斌、潘湘斌负责论文设计、审阅和修改，经费支持。
