引用本文： 张毅, 刘新梅, 周广起, 乔衍礼, 胡海洋, 刘宏生. β-氨基丙腈联合血管紧张素Ⅱ诱导大鼠主动脉夹层模型的建立. 中国胸心血管外科临床杂志, 2024, 31(1): 127-134. doi: 10.7507/1007-4848.202203068 复制
主动脉夹层（aortic dissection，AD）是临床上的一种危急重症，它是由多种因素造成主动脉内膜与部分中层发生撕裂，而后受到血管内血流的冲击，并沿着纵轴剥离形成相通或不通的主动脉壁真假两腔的分离状态[1]。在出现首发症状的AD患者中，治疗每延误1 h死亡率增加1%～2%[2]，24 h死亡率为33%，48 h死亡率可高达50%[1]，因此其诊断和治疗均面临巨大挑战。
此前对AD的关注多聚焦在主动脉血管壁撕裂后的诊断和治疗方面，而对疾病早期阶段的发生发展机制仍缺乏明确的认识。因此，探寻简便、稳定和有效的方法以建立AD动物模型对深入研究AD的发病机制具有重大意义。在本研究中，我们旨在通过β-氨基丙腈（β-aminopropionitrile，BAPN）联合血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ）诱导建立大鼠AD模型，并分析不同浓度或剂量的BAPN以及是否联合Ang-Ⅱ对SD大鼠主动脉或其他组织器官的影响及病理改变，以期寻找简便、稳定和有效的方法建立大鼠AD模型。
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂
选取3周龄SPF级雄性SD大鼠42只，购于济南朋悦实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK（鲁）20190003。BAPN购于上海易恩化学技术有限公司；Ang-Ⅱ购于Med Chem Express；微渗透压泵购于美国Alzet。
1.2 实验分组及干预方法
将大鼠按照完全随机法分为7组，即A组（0.25% BAPN组）、B组（0.40% BAPN组）、C组（0.80% BAPN组）、D组［1 g/（kg·d）BAPN组］、E组［1 g/（kg·d）BAPN+1 μg/（kg·min）生理盐水组］、F组［1 g/（kg·d）BAPN+1 μg/（kg·min）Ang-Ⅱ组］、G组（对照组），各组大鼠均经适应性喂养1周后开始干预，A、B、C、D、G组干预周期为4周，E、F组BAPN干预4周后，通过微渗透压泵分别泵入生理盐水和Ang-Ⅱ，持续5 d。由于大鼠处于成长期，体重变化较快，故D、E、F组根据其体重和饮水量变化每3 d重新配制BAPN饮用水，各组水瓶均使用锡纸包裹避光以避免BAPN长时间见光分解失效。研究期间各组大鼠均饲养于济宁医学院实验动物饲养中心，室温维持于25℃左右，每日12 h光照，每日观察大鼠精神状态，监测并记录大鼠饮水量、饮食量、体重，直至干预结束。研究期间各组大鼠均自由饮水，饮食无差别。
1.3 微渗透压泵的植入
E、F组经BAPN干预4周后，给予微渗透压泵皮下植入。F组微渗透压泵内为Ang-Ⅱ，E组为生理盐水。将Ang-Ⅱ或生理盐水注入微渗透压泵时需缓慢，避免产生气泡。注入完成的微渗透压泵置入37℃生理盐水中水浴4～6 h以将其激活。植入方法：使用2%戊巴比妥钠溶液按40 mg/kg标准以腹腔注射方式麻醉大鼠，后将大鼠俯卧并固定于固定板，选取颈部约4 cm2大小区域备皮，使用碘伏消毒后做一长约0.5 cm纵行切口，使用中弯钳分离皮下组织，分离出足够空间并植入微渗透压泵。植入时勿将微渗透压泵释放控制阀门朝向切口，以免造成药物渗漏。操作过程注意无菌。
1.4 主动脉获取及病理切片制作
实验过程中如有大鼠死亡则及时解剖；干预结束后，存活大鼠通过给予戊巴比妥钠处死并及时解剖。解剖获取的主动脉置入10%福尔马林中保存。病理切片制作：主动脉标本经10%福尔马林固定48 h后使用乙醇溶液梯度脱水，后经二甲苯/无水乙醇混合溶液浸泡透明，将组织标本石蜡包埋、修剪后切片，切片厚度约6 μm，使用温箱45℃干燥，后使用二甲苯中脱蜡及乙醇溶液梯度水化。使用苏木精染液浸泡5 min，后使用0.5% 盐酸酒精溶液分化15 s后清水冲洗15 min，伊红染色液浸泡1 min后使用清水冲洗2 min，后放入乙醇溶液中梯度脱水，给予二甲苯透明，中性树胶封片。
1.5 统计学分析
统计学分析采用IBM SPSS 25.0软件进行。计量资料行正态性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（
±s）描述，组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料以中位数和上下四分位数［M（P25，P75）］描述，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料用构成比描述，组间比较采用Fisher确切概率法。P≤0.05为差异有统计学意义。
1.6 伦理审查
本研究已通过济宁医学院附属医院伦理委员会审核批准，审批号：2021C102。
2 结果
2.1 各组生存率和主动脉夹层发生率比较
BAPN干预4周时，A、B、C、D、E、F、G组中大鼠生存率分别为83.3%（5/6）、50.0%（3/6）、100.0%（6/6）、100.0%（6/6）、83.3%（5/6）、100.0%（6/6）、100.0%（6/6），各组生存率差异无统计学意义（P=0.108）；此时各组AD发生率均为0。E、F组植入微渗透压泵5 d后，生存率分别为83.3%（5/6）、0.0%，差异有统计学意义（P=0.008），AD发生率分别为0.0%、100.0%，差异有统计学意义（P=0.001）。F组83.3%（5/6）的大鼠死亡原因为AD破裂，16.7%（1/6）的大鼠死亡原因为AD形成。各组大鼠生存曲线见图1。
图1
各组大鼠生存曲线
a：A、B、C、D、G组大鼠生存曲线；b：E、F组大鼠生存曲线
2.2 各组饮食量、饮水量、体重和摄药量的比较
以A、B、C、D、G组研究BAPN对饮食量、饮水量和体重的影响。BAPN干预4周后，A、B、C、D组饮食量和饮水量均明显少于G组。A、B、C、D、G组饮食量分别为8.35 g、2.60 g、19.70 g、6.17 g、27.77 g，饮水量分别为16.25 mL、5.35 mL、28.65 mL、37.73 mL、53.27 mL；见图2。
图2
各组大鼠饮水量和饮食量变化趋势
a：饮水量变化趋势；b：饮食量变化趋势
适应性喂养前和BAPN干预前G组与各干预组大鼠体重差异无统计学意义（P＞0.05）。给予BAPN干预后，A、B、C、D组大鼠体重增长速度较G组明显减缓，其中BAPN对B组影响最大，A、D组次之，对C组影响最小；见图3a。BAPN干预4周后，G组［（293.90±21.11）g］与A组［105.20（99.45，133.70）g］、B组［（98.93±5.44）g］、C组［（195.43±4.40）g］、D组［133.00（121.35，146.08）g］体重差异有统计学意义（P＜0.05）；见表1。
表1
各实验节点G组与各干预组体重水平比较［
/M（P25，P75），g］
图3
各组大鼠体重和摄药量变化趋势
a：体重变化趋势；b：BAPN摄药量变化趋势；BAPN：β-氨基丙腈
BAPN干预伊始，A、B、C、D组摄药量分别为0.63 g/（kg·d）、0.93 g/（kg·d）、1.97 g/（kg·d）、1 g/（kg·d），C组＞D组＞B组＞A组，随大鼠的体重和饮水量的变化，A、B、C组摄药量逐渐下降，BAPN干预结束时，A、B、C、D组的摄药量分别为0.36 g/（kg·d）、0.22 g/（kg·d）、1.17 g/（kg·d）、1 g/（kg·d），C组＞D组＞A组＞B组；见图3。
2.3 大鼠主动脉大体解剖及病理改变
对死亡大鼠行正中开胸可见胸腔内充满血凝块，血凝块完全包裹心脏，取出血凝块后仔细暴露AD破裂处；见图4。F组中6只（100.0%）大鼠发生AD，死亡时间为Ang-Ⅱ干预后第3～4 d，其中5只死因为AD破裂，其余1只为AD形成。
图4
大鼠解剖和全程主动脉
a：夹层破裂大鼠胸腔；b：正常大鼠的主动脉；c：因夹层破裂死亡大鼠的主动脉；d：形成夹层未破裂大鼠的主动脉
相较于正常大鼠主动脉，AD破裂大鼠与AD形成未破裂大鼠主动脉病理切片可见主动脉血管壁纤维组织增生伴玻璃样变、粘液样变；管壁内可见大量红细胞浸润，弹性纤维断裂、排列紊乱，伴假腔内血栓形成；见图5。
图5
大鼠主动脉HE染色
a：正常大鼠；b：夹层破裂大鼠；c：夹层形成未破裂大鼠
2.4 其他改变
精神状态的改变：A～F组大鼠均于BAPN干预后1周左右逐渐出现精神低落，日常多维持于俯卧位，喜静，不好动，对外界刺激缺乏敏感。
胃肠道的改变：A、B两组中分别有1只、2只大鼠发生肠梗阻，死亡时间分别为BAPN干预后第19 d、26 d、18 d，解剖可见肠道内残存大量粪便，伴部分肠道坏死，空肠、回肠严重胀气，直肠扩张。B组中2只大鼠均伴有直肠破裂，破裂部位分别位于直肠末段的前壁和后壁，可见粪便经直肠破裂处进入腹腔导致严重腹膜炎，进而引发严重肠粘连；见图6。破裂直肠病理切片可见肠壁连续性中断，黏膜层、黏膜下层和肌层可见扩张、充血、出血，伴肠壁全层炎细胞浸润；见图7。
图6
大鼠胃肠道改变
a：可见胃、肠胀气；b：直肠破裂大鼠可见腹腔内粪便和炎症；c：直肠前壁破裂；d：直肠后壁破裂
图7
破裂直肠HE染色
a～d：分别为不同放大倍数下破裂直肠HE染色图片；HE：苏木精-伊红染色
3 讨论
AD是心血管领域的危急重症之一，其发病率逐渐增高，并且近年来呈年轻化趋势。目前AD发生机制仍未完全明了，其内在的相互作用机制仍需进一步探索，因此需要一种稳定、简便的AD动物模型来为后续AD发病机制的研究奠定基础。
BAPN是赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）的不可逆性抑制剂，它可以抑制弹性蛋白和胶原蛋白的交联而导致主动脉壁的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）溶解，进而破坏主动脉壁结构的完整性而诱发AD[3-5]。自Wawzonek证明BAPN是香豌豆种子中导致AD的毒性因子后，BAPN被广泛用于AD动物模型的构建，包括火鸡、大鼠和小鼠等。Ang-Ⅱ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统中的主要效应因子，其不仅在血管生成和维持内皮细胞稳态中扮演了重要角色，还参与了血压的维持、炎症反应的触发，甚至血管损伤的过程[6-8]。极少有研究者单独应用Ang-Ⅱ诱导建立AD动物模型，而通常是在BAPN干预后加用以提升AD的发生率。
目前，针对SD大鼠AD模型的构建，研究者[9-16]之间对BAPN的给药方式和剂量甚至是否联合Ang-Ⅱ均持有不同观点，甚至相互矛盾；见表2。因此，在本研究中，我们旨在通过BAPN联合或不联合Ang-Ⅱ诱导建立SD大鼠AD模型，并分析不同浓度或剂量的BAPN以及是否联合Ang-Ⅱ对SD大鼠主动脉或其他组织器官的影响及病理改变，以期寻找简便、稳定和有效的方法建立SD大鼠AD模型。
表2
既往AD动物模型的诱导方式
本研究采用6种BAPN（和Ang-Ⅱ）干预方式构建SD大鼠AD模型。6个干预组中，仅F组［1 g/（kg·d）BAPN+1 μg/（kg·min）Ang-Ⅱ］成功构建大鼠AD模型，AD发生率高达100.0%（6/6）。我们发现通过BAPN联合Ang-Ⅱ可稳定构建大鼠AD模型，并通过组织病理学得到证实。本研究发现应用BAPN干预4周无法构建大鼠AD模型，这与先前研究结果不一致。而当对BAPN干预4周后的大鼠加用Ang-Ⅱ时，大鼠可在Ang-Ⅱ干预5 d内死亡，且死亡原因皆为AD破裂或AD形成。Izawa-Ishizawa等[17]发现内皮功能障碍是AD发生过程中的关键，并可导致以弹性纤维断裂为主要特征的主动脉退化。结合BAPN的作用机制，我们怀疑BAPN在构建大鼠AD模型中的作用可能主要以诱导AD形成前的状态为主，而通过Ang-Ⅱ进一步诱导AD形成。在BAPN干预后应用Ang-Ⅱ可观察到小鼠的血压升高，这也与部分AD患者发病时症状相类似。但对BAPN干预后的小鼠注射去甲肾上腺素并未显著增加AD的发生率，因此Ang-Ⅱ在小鼠AD模型构建中的作用可能不仅仅是升高血压[18]。仍需进一步的研究探索BAPN与Ang-Ⅱ在诱导大鼠AD中的作用机制。
BAPN在理论上可以抑制所有弹性蛋白与胶原蛋白的交联，并损害其组织器官功能。因此，BAPN在诱导AD的过程中不仅作用于主动脉，还可作用于其他组织器官并诱发相关的并发症。米色脂肪细胞存在于白色脂肪库中，在寒冷和肾上腺素的刺激下其可向棕色脂肪组织转化，增加产热[19]。BAPN可通过抑制LOX活性刺激腹股沟白色脂肪组织（inguinal white adipose tissue，iWAT）中米色脂肪的生成，并可增强iWAT和附睾白色脂肪组织因冷诱导所致的适应性产热。我们认为正是由于上述机制，导致本研究中干预组的体重增长显著少于对照组。Miana等[20]的研究也证实BAPN可以减少经饮食诱导的肥胖大鼠的体重增长并改善其代谢状态，与本研究发现相似。但BAPN所致的体重增长速度下降的程度似乎并不与BAPN的剂量呈正相关。本研究中A～D组摄药量为C组＞D组＞B组＞A组，但A～D组体重水平为C组＞D组＞A组＞B组。C组摄药量最高，但其体重水平同样最高；B组摄药量高于A组，其体重水平低于A组。我们猜测随着BAPN干预量增加，其对体重增长的影响逐渐增大，但到达一定水平后其影响逐渐减小，即存在某一干预量可使其影响达到峰值，但这一猜测还有待进一步研究证实。
胶原纤维的形态、方向、结构和含量在很大程度上决定了生物组织的微观力学，一旦这些结构遭到破坏，则可能会对相应器官功能造成负面影响。Siri等[21]通过对结直肠肠壁的亚层进行双轴拉伸试验，得到了结直肠黏膜下层作为远端结直肠承重结构的直接生物力学证据。虽然结直肠壁的黏膜下层相对较薄，仅占肠壁厚度的20%左右，但其所富含的胶原纤维是其维持结直肠承载区域的关键成分[22]。胶原纤维主要受成纤维细胞的调控，成纤维细胞的数量减少和功能受损可导致胶原纤维合成与分解的紊乱[23]。研究[24]通过对肠标本进行免疫荧光染色发现，LOX在高度分化的成纤维细胞和黏膜下层中均有表达，其中在成纤维细胞中高度表达。因此，我们怀疑本实验中2只大鼠出现肠破裂与BAPN损害肠黏膜下层有关。但本研究中肠破裂的发生率较低，因此其损伤机制还有待进一步研究。
综上所述，本研究发现应用1 g/（kg·d）BAPN饮用水给药联合1 g/（kg·min）Ang-Ⅱ 微渗透压泵给药的方法建立大鼠AD模型是可行的，并且具有简便、相对稳定、成本较低的特点。BAPN可显著影响大鼠的饮食量、饮水量和体重，但其影响程度均不与BAPN摄药量呈正相关，BAPN是否存在某一摄药量使其对大鼠生长发育的影响达到峰值尚需进一步研究。BAPN（或联合Ang-Ⅱ）可导致大鼠主动脉血管壁纤维组织增生伴玻璃样变、粘液样变；管壁内可见大量红细胞浸润，弹性纤维断裂、排列紊乱，伴假腔内血栓形成。BAPN除可影响大鼠主动脉组织外，还可对大鼠的精神状态和胃肠道造成影响。这也是SD大鼠AD模型建立过程的一种不稳定因素，如何平衡AD模型建立过程中BAPN对其他器官组织的影响还有待进一步研究。
利益冲突：无。
作者贡献：张毅、刘新梅、周广起、胡海洋负责实验操作，实验数据收集分析；张毅、刘新梅负责文章撰写和修改；乔衍礼、刘宏生负责实验设计和文章审阅。
主动脉夹层（aortic dissection，AD）是临床上的一种危急重症，它是由多种因素造成主动脉内膜与部分中层发生撕裂，而后受到血管内血流的冲击，并沿着纵轴剥离形成相通或不通的主动脉壁真假两腔的分离状态[1]。在出现首发症状的AD患者中，治疗每延误1 h死亡率增加1%～2%[2]，24 h死亡率为33%，48 h死亡率可高达50%[1]，因此其诊断和治疗均面临巨大挑战。
此前对AD的关注多聚焦在主动脉血管壁撕裂后的诊断和治疗方面，而对疾病早期阶段的发生发展机制仍缺乏明确的认识。因此，探寻简便、稳定和有效的方法以建立AD动物模型对深入研究AD的发病机制具有重大意义。在本研究中，我们旨在通过β-氨基丙腈（β-aminopropionitrile，BAPN）联合血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ）诱导建立大鼠AD模型，并分析不同浓度或剂量的BAPN以及是否联合Ang-Ⅱ对SD大鼠主动脉或其他组织器官的影响及病理改变，以期寻找简便、稳定和有效的方法建立大鼠AD模型。
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂
选取3周龄SPF级雄性SD大鼠42只，购于济南朋悦实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK（鲁）20190003。BAPN购于上海易恩化学技术有限公司；Ang-Ⅱ购于Med Chem Express；微渗透压泵购于美国Alzet。
1.2 实验分组及干预方法
将大鼠按照完全随机法分为7组，即A组（0.25% BAPN组）、B组（0.40% BAPN组）、C组（0.80% BAPN组）、D组［1 g/（kg·d）BAPN组］、E组［1 g/（kg·d）BAPN+1 μg/（kg·min）生理盐水组］、F组［1 g/（kg·d）BAPN+1 μg/（kg·min）Ang-Ⅱ组］、G组（对照组），各组大鼠均经适应性喂养1周后开始干预，A、B、C、D、G组干预周期为4周，E、F组BAPN干预4周后，通过微渗透压泵分别泵入生理盐水和Ang-Ⅱ，持续5 d。由于大鼠处于成长期，体重变化较快，故D、E、F组根据其体重和饮水量变化每3 d重新配制BAPN饮用水，各组水瓶均使用锡纸包裹避光以避免BAPN长时间见光分解失效。研究期间各组大鼠均饲养于济宁医学院实验动物饲养中心，室温维持于25℃左右，每日12 h光照，每日观察大鼠精神状态，监测并记录大鼠饮水量、饮食量、体重，直至干预结束。研究期间各组大鼠均自由饮水，饮食无差别。
1.3 微渗透压泵的植入
E、F组经BAPN干预4周后，给予微渗透压泵皮下植入。F组微渗透压泵内为Ang-Ⅱ，E组为生理盐水。将Ang-Ⅱ或生理盐水注入微渗透压泵时需缓慢，避免产生气泡。注入完成的微渗透压泵置入37℃生理盐水中水浴4～6 h以将其激活。植入方法：使用2%戊巴比妥钠溶液按40 mg/kg标准以腹腔注射方式麻醉大鼠，后将大鼠俯卧并固定于固定板，选取颈部约4 cm2大小区域备皮，使用碘伏消毒后做一长约0.5 cm纵行切口，使用中弯钳分离皮下组织，分离出足够空间并植入微渗透压泵。植入时勿将微渗透压泵释放控制阀门朝向切口，以免造成药物渗漏。操作过程注意无菌。
1.4 主动脉获取及病理切片制作
实验过程中如有大鼠死亡则及时解剖；干预结束后，存活大鼠通过给予戊巴比妥钠处死并及时解剖。解剖获取的主动脉置入10%福尔马林中保存。病理切片制作：主动脉标本经10%福尔马林固定48 h后使用乙醇溶液梯度脱水，后经二甲苯/无水乙醇混合溶液浸泡透明，将组织标本石蜡包埋、修剪后切片，切片厚度约6 μm，使用温箱45℃干燥，后使用二甲苯中脱蜡及乙醇溶液梯度水化。使用苏木精染液浸泡5 min，后使用0.5% 盐酸酒精溶液分化15 s后清水冲洗15 min，伊红染色液浸泡1 min后使用清水冲洗2 min，后放入乙醇溶液中梯度脱水，给予二甲苯透明，中性树胶封片。
1.5 统计学分析
统计学分析采用IBM SPSS 25.0软件进行。计量资料行正态性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）描述，组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料以中位数和上下四分位数［M（P25，P75）］描述，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料用构成比描述，组间比较采用Fisher确切概率法。P≤0.05为差异有统计学意义。
1.6 伦理审查
本研究已通过济宁医学院附属医院伦理委员会审核批准，审批号：2021C102。
2 结果
2.1 各组生存率和主动脉夹层发生率比较
BAPN干预4周时，A、B、C、D、E、F、G组中大鼠生存率分别为83.3%（5/6）、50.0%（3/6）、100.0%（6/6）、100.0%（6/6）、83.3%（5/6）、100.0%（6/6）、100.0%（6/6），各组生存率差异无统计学意义（P=0.108）；此时各组AD发生率均为0。E、F组植入微渗透压泵5 d后，生存率分别为83.3%（5/6）、0.0%，差异有统计学意义（P=0.008），AD发生率分别为0.0%、100.0%，差异有统计学意义（P=0.001）。F组83.3%（5/6）的大鼠死亡原因为AD破裂，16.7%（1/6）的大鼠死亡原因为AD形成。各组大鼠生存曲线见图1。
图1
各组大鼠生存曲线
a：A、B、C、D、G组大鼠生存曲线；b：E、F组大鼠生存曲线
2.2 各组饮食量、饮水量、体重和摄药量的比较
以A、B、C、D、G组研究BAPN对饮食量、饮水量和体重的影响。BAPN干预4周后，A、B、C、D组饮食量和饮水量均明显少于G组。A、B、C、D、G组饮食量分别为8.35 g、2.60 g、19.70 g、6.17 g、27.77 g，饮水量分别为16.25 mL、5.35 mL、28.65 mL、37.73 mL、53.27 mL；见图2。
图2
各组大鼠饮水量和饮食量变化趋势
a：饮水量变化趋势；b：饮食量变化趋势
适应性喂养前和BAPN干预前G组与各干预组大鼠体重差异无统计学意义（P＞0.05）。给予BAPN干预后，A、B、C、D组大鼠体重增长速度较G组明显减缓，其中BAPN对B组影响最大，A、D组次之，对C组影响最小；见图3a。BAPN干预4周后，G组［（293.90±21.11）g］与A组［105.20（99.45，133.70）g］、B组［（98.93±5.44）g］、C组［（195.43±4.40）g］、D组［133.00（121.35，146.08）g］体重差异有统计学意义（P＜0.05）；见表1。
表1
各实验节点G组与各干预组体重水平比较［/M（P25，P75），g］
图3
各组大鼠体重和摄药量变化趋势
a：体重变化趋势；b：BAPN摄药量变化趋势；BAPN：β-氨基丙腈
BAPN干预伊始，A、B、C、D组摄药量分别为0.63 g/（kg·d）、0.93 g/（kg·d）、1.97 g/（kg·d）、1 g/（kg·d），C组＞D组＞B组＞A组，随大鼠的体重和饮水量的变化，A、B、C组摄药量逐渐下降，BAPN干预结束时，A、B、C、D组的摄药量分别为0.36 g/（kg·d）、0.22 g/（kg·d）、1.17 g/（kg·d）、1 g/（kg·d），C组＞D组＞A组＞B组；见图3。
2.3 大鼠主动脉大体解剖及病理改变
对死亡大鼠行正中开胸可见胸腔内充满血凝块，血凝块完全包裹心脏，取出血凝块后仔细暴露AD破裂处；见图4。F组中6只（100.0%）大鼠发生AD，死亡时间为Ang-Ⅱ干预后第3～4 d，其中5只死因为AD破裂，其余1只为AD形成。
图4
大鼠解剖和全程主动脉
a：夹层破裂大鼠胸腔；b：正常大鼠的主动脉；c：因夹层破裂死亡大鼠的主动脉；d：形成夹层未破裂大鼠的主动脉
相较于正常大鼠主动脉，AD破裂大鼠与AD形成未破裂大鼠主动脉病理切片可见主动脉血管壁纤维组织增生伴玻璃样变、粘液样变；管壁内可见大量红细胞浸润，弹性纤维断裂、排列紊乱，伴假腔内血栓形成；见图5。
图5
大鼠主动脉HE染色
a：正常大鼠；b：夹层破裂大鼠；c：夹层形成未破裂大鼠
2.4 其他改变
精神状态的改变：A～F组大鼠均于BAPN干预后1周左右逐渐出现精神低落，日常多维持于俯卧位，喜静，不好动，对外界刺激缺乏敏感。
胃肠道的改变：A、B两组中分别有1只、2只大鼠发生肠梗阻，死亡时间分别为BAPN干预后第19 d、26 d、18 d，解剖可见肠道内残存大量粪便，伴部分肠道坏死，空肠、回肠严重胀气，直肠扩张。B组中2只大鼠均伴有直肠破裂，破裂部位分别位于直肠末段的前壁和后壁，可见粪便经直肠破裂处进入腹腔导致严重腹膜炎，进而引发严重肠粘连；见图6。破裂直肠病理切片可见肠壁连续性中断，黏膜层、黏膜下层和肌层可见扩张、充血、出血，伴肠壁全层炎细胞浸润；见图7。
图6
大鼠胃肠道改变
a：可见胃、肠胀气；b：直肠破裂大鼠可见腹腔内粪便和炎症；c：直肠前壁破裂；d：直肠后壁破裂
图7
破裂直肠HE染色
a～d：分别为不同放大倍数下破裂直肠HE染色图片；HE：苏木精-伊红染色
3 讨论
AD是心血管领域的危急重症之一，其发病率逐渐增高，并且近年来呈年轻化趋势。目前AD发生机制仍未完全明了，其内在的相互作用机制仍需进一步探索，因此需要一种稳定、简便的AD动物模型来为后续AD发病机制的研究奠定基础。
BAPN是赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）的不可逆性抑制剂，它可以抑制弹性蛋白和胶原蛋白的交联而导致主动脉壁的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）溶解，进而破坏主动脉壁结构的完整性而诱发AD[3-5]。自Wawzonek证明BAPN是香豌豆种子中导致AD的毒性因子后，BAPN被广泛用于AD动物模型的构建，包括火鸡、大鼠和小鼠等。Ang-Ⅱ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统中的主要效应因子，其不仅在血管生成和维持内皮细胞稳态中扮演了重要角色，还参与了血压的维持、炎症反应的触发，甚至血管损伤的过程[6-8]。极少有研究者单独应用Ang-Ⅱ诱导建立AD动物模型，而通常是在BAPN干预后加用以提升AD的发生率。
目前，针对SD大鼠AD模型的构建，研究者[9-16]之间对BAPN的给药方式和剂量甚至是否联合Ang-Ⅱ均持有不同观点，甚至相互矛盾；见表2。因此，在本研究中，我们旨在通过BAPN联合或不联合Ang-Ⅱ诱导建立SD大鼠AD模型，并分析不同浓度或剂量的BAPN以及是否联合Ang-Ⅱ对SD大鼠主动脉或其他组织器官的影响及病理改变，以期寻找简便、稳定和有效的方法建立SD大鼠AD模型。
表2
既往AD动物模型的诱导方式
本研究采用6种BAPN（和Ang-Ⅱ）干预方式构建SD大鼠AD模型。6个干预组中，仅F组［1 g/（kg·d）BAPN+1 μg/（kg·min）Ang-Ⅱ］成功构建大鼠AD模型，AD发生率高达100.0%（6/6）。我们发现通过BAPN联合Ang-Ⅱ可稳定构建大鼠AD模型，并通过组织病理学得到证实。本研究发现应用BAPN干预4周无法构建大鼠AD模型，这与先前研究结果不一致。而当对BAPN干预4周后的大鼠加用Ang-Ⅱ时，大鼠可在Ang-Ⅱ干预5 d内死亡，且死亡原因皆为AD破裂或AD形成。Izawa-Ishizawa等[17]发现内皮功能障碍是AD发生过程中的关键，并可导致以弹性纤维断裂为主要特征的主动脉退化。结合BAPN的作用机制，我们怀疑BAPN在构建大鼠AD模型中的作用可能主要以诱导AD形成前的状态为主，而通过Ang-Ⅱ进一步诱导AD形成。在BAPN干预后应用Ang-Ⅱ可观察到小鼠的血压升高，这也与部分AD患者发病时症状相类似。但对BAPN干预后的小鼠注射去甲肾上腺素并未显著增加AD的发生率，因此Ang-Ⅱ在小鼠AD模型构建中的作用可能不仅仅是升高血压[18]。仍需进一步的研究探索BAPN与Ang-Ⅱ在诱导大鼠AD中的作用机制。
BAPN在理论上可以抑制所有弹性蛋白与胶原蛋白的交联，并损害其组织器官功能。因此，BAPN在诱导AD的过程中不仅作用于主动脉，还可作用于其他组织器官并诱发相关的并发症。米色脂肪细胞存在于白色脂肪库中，在寒冷和肾上腺素的刺激下其可向棕色脂肪组织转化，增加产热[19]。BAPN可通过抑制LOX活性刺激腹股沟白色脂肪组织（inguinal white adipose tissue，iWAT）中米色脂肪的生成，并可增强iWAT和附睾白色脂肪组织因冷诱导所致的适应性产热。我们认为正是由于上述机制，导致本研究中干预组的体重增长显著少于对照组。Miana等[20]的研究也证实BAPN可以减少经饮食诱导的肥胖大鼠的体重增长并改善其代谢状态，与本研究发现相似。但BAPN所致的体重增长速度下降的程度似乎并不与BAPN的剂量呈正相关。本研究中A～D组摄药量为C组＞D组＞B组＞A组，但A～D组体重水平为C组＞D组＞A组＞B组。C组摄药量最高，但其体重水平同样最高；B组摄药量高于A组，其体重水平低于A组。我们猜测随着BAPN干预量增加，其对体重增长的影响逐渐增大，但到达一定水平后其影响逐渐减小，即存在某一干预量可使其影响达到峰值，但这一猜测还有待进一步研究证实。
胶原纤维的形态、方向、结构和含量在很大程度上决定了生物组织的微观力学，一旦这些结构遭到破坏，则可能会对相应器官功能造成负面影响。Siri等[21]通过对结直肠肠壁的亚层进行双轴拉伸试验，得到了结直肠黏膜下层作为远端结直肠承重结构的直接生物力学证据。虽然结直肠壁的黏膜下层相对较薄，仅占肠壁厚度的20%左右，但其所富含的胶原纤维是其维持结直肠承载区域的关键成分[22]。胶原纤维主要受成纤维细胞的调控，成纤维细胞的数量减少和功能受损可导致胶原纤维合成与分解的紊乱[23]。研究[24]通过对肠标本进行免疫荧光染色发现，LOX在高度分化的成纤维细胞和黏膜下层中均有表达，其中在成纤维细胞中高度表达。因此，我们怀疑本实验中2只大鼠出现肠破裂与BAPN损害肠黏膜下层有关。但本研究中肠破裂的发生率较低，因此其损伤机制还有待进一步研究。
综上所述，本研究发现应用1 g/（kg·d）BAPN饮用水给药联合1 g/（kg·min）Ang-Ⅱ 微渗透压泵给药的方法建立大鼠AD模型是可行的，并且具有简便、相对稳定、成本较低的特点。BAPN可显著影响大鼠的饮食量、饮水量和体重，但其影响程度均不与BAPN摄药量呈正相关，BAPN是否存在某一摄药量使其对大鼠生长发育的影响达到峰值尚需进一步研究。BAPN（或联合Ang-Ⅱ）可导致大鼠主动脉血管壁纤维组织增生伴玻璃样变、粘液样变；管壁内可见大量红细胞浸润，弹性纤维断裂、排列紊乱，伴假腔内血栓形成。BAPN除可影响大鼠主动脉组织外，还可对大鼠的精神状态和胃肠道造成影响。这也是SD大鼠AD模型建立过程的一种不稳定因素，如何平衡AD模型建立过程中BAPN对其他器官组织的影响还有待进一步研究。
利益冲突：无。
作者贡献：张毅、刘新梅、周广起、胡海洋负责实验操作，实验数据收集分析；张毅、刘新梅负责文章撰写和修改；乔衍礼、刘宏生负责实验设计和文章审阅。
