引用本文： 范洁, 陶泽, 李恒, 杨芬, 杨浩, 卢晓风. PDGFRβ 靶向性近红外荧光探针的制备及其在肺癌光学分子影像中的应用. 中国胸心血管外科临床杂志, 2021, 28(7): 841-848. doi: 10.7507/1007-4848.202104050 复制
医学影像学是肿瘤无创诊断所依赖的主要手段[1]。近年来，随着精准医学理念的不断深入发展，越来越多的分子影像技术被用于肿瘤的早期诊断和精准治疗方案的选择。事实上，肿瘤发生发展过程中，一些肿瘤相关分子的变化通常早于细胞和组织学水平的变化。因此，以识别这些肿瘤相关分子的特异性分子探针为基础，借助特定的影像设备产生高分辨分子影像，进而实现：（1）鉴别肿瘤及肿瘤微环境，为肿瘤早期诊断提供可靠依据[2]；（2）手术过程中准确指示肿瘤范围，指导外科医生精准切除肿瘤组织[3-4]；（3）鉴别肿瘤分子靶标，辅助筛选与之匹配的药物以实现肿瘤精准治疗[5-6]。由于具有传统医学影像学不可比拟的灵敏度和精确性，分子影像近年来在肿瘤诊断和治疗中越来越受到重视，大量分子影像探针被发展和应用[7]。
获得高分辨的分子影像需要借助分子影像探针及与之匹配的影像设备[8]。因此，分子影像探针往往又根据对应的影像设备分为超声、核磁共振、CT、正电子发射扫描（PET）及光学分子影像探针几大类[7]。外科手术迄今仍是肿瘤治疗的重要手段。但是，传统手术过程中，主要依赖外科医生通过触诊和肉眼观察辨别肿瘤组织，难以实现精准切除，肿瘤复发率高。因此，如何尽可能将肿瘤组织切除干净而又不损失过多正常组织是肿瘤外科手术面临的挑战。而通过实时影像指导手术是解决这一问题的可能途径。但所有依赖放射性同位素的显像手段均因辐射和设备复杂等问题而未能在术中广泛使用[9]。新近发展的光学分子影像技术对人体损伤小，设备相对简单，应用于术中指导医生精准切除肿瘤组织具有明显技术优势[10]。近年，越来越多的外科医生借助光学分子影像实施肿瘤外科手术。光学分子影像探针，尤其是肿瘤靶向性分子探针的研制也因此而备受关注[11]。
肿瘤靶向性分子影像探针是将造影剂用合适的方式与肿瘤靶向性分子连接而成。通常，造影剂和肿瘤靶向性分子需根据不同的肿瘤类型进行选择[12]。肺癌是全球发病人数最多、致死率最高的癌症[13]。尽管近年相应的诊断和治疗技术已明显提高，但肺癌的发生和致死率仍居高不下，仅 2018 年，全球就有肺癌新发病例 210 万，死亡 180 万。迄今为止，医疗界仍然共识，适时手术对提高肺癌治疗效果、延长患者生存期极为重要[2]。为了精准切除肺癌组织，研究者积极尝试利用光学分子影像进行术中导航并取得了一定进展[9, 14]。但是，前期研究选择的荧光素还存在组织穿透力弱，显像效果不佳的问题[15-16]，具有较强组织穿透力的近红外荧光染料可能是更佳的选择[9]。在选择肿瘤靶向性分子方面，已有研究主要是以靶向肿瘤细胞表面分子为主。事实上，人体组织中肿瘤细胞往往被大量基质细胞包裹，有可能极大地妨碍分子探针对肿瘤细胞的结合。因此，同时靶向肿瘤细胞和肿瘤基质细胞是肿瘤靶向性分子影像探针发展的新趋势[11]。
研究[17]发现，血小板衍生生长因子受体 β（platelet-derived growth factor receptor β，PDGFRβ）在人体肺癌组织大量表达。PDGFRβ 在肺癌组织中的高表达与预后不良密切相关[18-19]，提示 PDGFRβ 阳性细胞有促进肺癌发展或降低药效的作用，应尽量清除。因此，有必要制备 PDGFRβ 靶向性分子探针，并探索用其建立肺癌光学分子影像、辅助肺癌分子诊断及指导术中肺癌组织切除的可能性。根据这一设想，我们选择了 PDGFRβ 特异性亲和体 ZPDGFRβ[20]，将其与三聚结构域 tri 融合[21]，重组表达获得的蛋白 Z-tri 再与近红外荧光染料 CF750 进行偶联，制备成 PDGFRβ 靶向性光学分子探针CF750-Z-tri，并用其对肺癌移植瘤模型进行光学成像,进而评价其在肺癌分子影像中的应用潜力。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细菌和质粒
大肠杆菌 Escherichia coli（E. coli）Top10 菌株和 M15 菌株由实验室保存。pQE30 表达质粒为美国 QIAGEN 公司产品。
1.1.2 细胞株
人脑血管周细胞（human brain vascular pericytes，HBVP）购自美国 ScienCell 公司。人源 NCI-H292 肺癌细胞株、人源淋巴瘤 Raji 细胞株购自美国 ATCC（American Type Culture Collection）细胞库。
1.1.3 实验动物及伦理审查
实验中所用 Balb/c 雌性裸鼠（15~17g）购自北京华阜康生物科技公司，饲养于本院 SPF 级啮齿类动物实验中心。涉及的动物实验经四川大学华西医院实验动物伦理委员会审查批准，备案号为 20211075A。
1.2 方法
1.2.1 重组蛋白的制备
PDGFRβ 的特异性亲合体 ZPDGFRβ 由 Lindborg 等通过文库筛选获得[20]。为了提高其对 PDGFRβ 的亲和力，我们设计将其与来自于胶原蛋白的三聚结构域（trimerizing domain，tri）[21]通过连接子（G4S）3 融合，组建新的融合蛋白 Z-tri。根据融合蛋白的氨基酸序列，设计编码基因，委托江苏省心生物科技公司合成并通过 BamHⅠ和 SalⅠ克隆入 pQE30，转入 Top10 菌株中保存。
为了表达重组蛋白，将含有表达质粒的 Top10 菌株涂布于含有 100 μg/mL 氨苄西林（ampicillin，AMP）的 LB 固体培养基上，次日挑取单克隆，接种于含有相同浓度 AMP 的液体 LB 培养基中，于 37℃ 培养过夜。收集菌体提取质粒，用常规热激法将其转入表达菌 M15 中，再通过含有 AMP（100 μg/mL）和卡那霉素（Kanamycin，Kan，30 μg/mL）的双抗培养基筛选。获得的菌株再挑单克隆接种至含有 AMP 和 Kan 的 LB 液体培养基中，37℃ 培养至 A600nm 吸光值为 0.8~1.0，再加入 0.1 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG），继续于 24℃，120 rpm 振荡诱导培养过夜。次日离心收集菌体，用裂解液（500 mM 磷酸盐，pH 8.0；300 mM 氯化钠；10% 甘油；5 mM 咪唑）重悬后高压匀浆。破菌液 4℃，25000 g 离心 20 min，收集上清液，重复 4 次。再向上清液中加入 Ni-NTA 凝胶树脂，4℃ 结合 4~6 h。然后按照凝胶使用说明书对蛋白进行纯化。获得的蛋白在 4℃ 对 PBS（10 mM Na2HPO4；2 mM KH2PO4；137 mM NaCl；2.68 mM KCl，pH 7.4）透析过夜。蛋白浓度用美国 Bio-Rad 公司提供的 DC 试剂盒测定。
1.2.2 蛋白荧光标记
参考 Fan 等[22]描述的方法进行。Z-tri 蛋白用 PBS 稀释至 1.5 mg/mL，用碳酸氢钠调节至 pH 8.0 左右，Z-tri 与 CF750 染料（购自美国 Sigma 公司）或 FAM 染料按一定摩尔比混合，室温避光孵育 1 h。用透析法去除游离染料，通过电泳和荧光扫描检查蛋白是否标记上荧光染料。
1.2.3 蛋白电泳
蛋白纯度和蛋白荧光标记效率通过十二烷基磺酸钠丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）进行检测。分离胶浓度为 12.75%，浓缩胶浓度为 4%。样品中加入含有 β-巯基乙醇的样品处理液，沸水浴 10 min 后加入凝胶电泳。为检查蛋白是否标记上荧光染料，电泳结束后，凝胶先用荧光扫描仪成像，然后用考马斯亮蓝染色显示蛋白条带。用同时电泳的商品化分子量标准确定蛋白分子量。
1.2.4 流式细胞术检测蛋白对细胞的结合
周细胞 HBVP 用专用培养基，按细胞说明书提供的方法培养。NCI-H292 和 Raji 细胞用含 10% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的 RPMI1640 培养基，按 ATCC 官方网站提供的方法培养。为检测细胞表面 PDGFRβ 的表达，先将培养的细胞用胰酶消化，1 000 g离心 5 min，弃掉上清，再加入山羊抗人 PDGFRβ 抗体，室温孵育 1 h 后用含 0.5% FBS 的 PBS 洗两次。再加入绿色荧光标记的驴抗山羊二抗于室温孵育 0.5 h，洗涤两次后，用含 0.5% FBS 的 PBS 重悬后用于流式检测。为检测 Z-tri 蛋白对细胞的结合，将 150 nM FAM 标记的 Z-tri 与细胞于室温孵育 1 h，洗涤两次后即用流式检测。用无关的抗体作为同型对照。
1.2.5 免疫荧光检测 PDGFRβ 在移植瘤中的表达
Balb/c 雌性裸鼠背部皮下接种肿瘤细胞 NCI-H292（3×106个/只）或 Raji（7.5×106个/只），动态监测瘤体生长状态。确定成瘤后，定时测量瘤体长（length，L）和宽（eidth，W），按公式 V=L×W2/2 计算肿瘤体积（volume，V）。待瘤体生长至 100～200 mm3，处死小鼠剥取肿瘤，冰冻切片进行免疫荧光染色。按说明书推荐的浓度向肿瘤组织中加入山羊抗人 PDGFRβ 抗体，37℃ 避光孵育 1 h。PBS 洗涤后再加入驴抗山羊二抗，37℃ 避光孵育 0.5 h。用 DAPI 染液快速显示细胞核，然后于显微镜下观察拍照。
1.2.6 示踪法检测蛋白在瘤内的细胞分布
为了检测尾静脉注射的 Z-tri 蛋白是否能进入瘤体并结合到 PDGFRβ 阳性细胞上，按 1.2.5 描述的方法用 Balb/c 雌性裸鼠建立 NCI-H292 和 Raji 移植瘤模型。待瘤体长至 100～200 mm3，尾静脉注射 FAM 标记的 Z-tri（10 mg/kg），1 h 后处死小鼠剥取肿瘤，冰冻切片，按 1.2.5 描述的免疫荧光法显示 PDGFRβ 阳性细胞。通过 Z-tri 与 PDGFRβ 的共定位判断 Z-tri 是否结合到 PDGFRβ 阳性细胞上。同时，还可用 CD31 抗体，通过免疫荧光指示肿瘤血管内皮细胞。通过 Z-tri 与 CD31 的共定位，判断 Z-tri 的分布与肿瘤血管的关系。
1.2.7 光学成像显示肿瘤组织
按 1.2.5 描述的方法用 Balb/c 雌性裸鼠建立 NCI-H292 和 Raji 移植瘤模型。待瘤体长至 100～200 mm3，尾静脉注射 CF750 染料标记过的 Z-tri（6 mg/kg），然后于 1、2、4 和 6 h将小鼠置于活体成像仪中扫描，动态监测CF750-Z-tri 在移植瘤中的富集情况。观察结束后处死小鼠，迅速取出心、肝、脾、肺、肾、结肠、肌肉和肿瘤，按顺序整齐摆放于光学成像仪同时扫描。根据CF750-Z-tri 在上述脏器和组织中的分布情况，评价其是否有肿瘤特异性。
2 结果
2.1 Z-tri 在大肠杆菌中大量表达
为了制备足量蛋白，Z-tri 的编码基因被插入到 pQE30 质粒中构建了表达载体（图1a）。质粒载体转入表达菌株 M15，经 IPTG 诱导后，用 Ni-NTA 亲和层析法从大肠杆菌上清液中纯化出 Z-tri 蛋白。结果如图1b 所示，亲和层析纯化后的蛋白在还原 SDS-PAGE 电泳上显示为单一条带，说明其纯度高。根据分子量标准计算，Z-tri 的分子量大约为 14 KD，与预期分子量相符，说明我们利用大肠杆菌系统成功表达并制备了纯度较高的 Z-tri 融合蛋白。
图1
Z-tri 重组表达及分离纯化
a：表达质粒示意图；b：纯化产物 SDS-PAGE 电泳
2.2 Z-tri 容易被荧光染料标记
荧光染料在白光下易于猝灭。因此，快速、高效将荧光染料偶联到肿瘤靶向性分子上是制备光学影像分子探针的先决条件。将纯化的 Z-tri 蛋白，与 CF750 按分子比 1∶6 混合后，室温下避光孵育 1 h。电泳检查发现，与染料共同孵育后的 Z-tri 蛋白在凝胶上弥散分布，分子量比未与染料孵育的 Z-tri 蛋白大。将凝胶置于荧光扫描仪下发现，与 CF750 共同孵育后的 Z-tri 显示荧光，而未与 CF750 共同孵育的 Z-tri 无荧光（图2a）。这些结果说明 CF750 只需通过简单孵育，即可偶联到 Z-tri 上而制备分子探针CF750-Z-tri。用同样的方法，将 Z-tri 与 FAM 按照 1∶20 的摩尔比混合，也成功地将 FAM 偶联到 Z-tri 上，制备了分子探针FAM-Z-tri（图2b）。上述结果说明，荧光染料易于被偶联到 Z-tri 上，适合于制备光学分子探针。
图2
CF750-Z-tri（a） 和FAM-Z-tri（b）荧光分子探针的制备
2.3 荧光标记后的 Z-tri 能与体外培养的 PDGFRβ 阳性细胞结合
ZPDGFRβ 能够与 PDGFRβ 结合。但是，与三聚结构域 tri 融合并偶联上荧光染料后具有 PDGFRβ 结合能力，也是 Z-tri 能作为光学分子探针的先决条件之一。由于 CF750 产生的荧光不能在现有流式细胞仪上被检测，我们对FAM-Z-tri 进行检测，以推测CF750-Z-tri 对 PDGFRβ 的结合能力。结果发现，周细胞 HBVP 和 NCI-H292 肺癌细胞上表达 PDGFRβ，而 Raji 淋巴瘤细胞上不表达 PDGFRβ（图3a）。相应地，FAM-Z-tri 对 HBVP 和 NCI-H292 显示了明显的结合，而不结合 Raji 细胞（图3b）。这说明 Z-tri 能通过 PDGFRβ 与周细胞和肺癌细胞 NCI-H292 结合。荧光染料标记对 Z-tri 的细胞结合能力影响不大。
图3
PDGFRβ 表达（a）和 Z-tri 对细胞的结合（b）
2.4 荧光标记后的 Z-tri 能与移植瘤内 PDGFRβ 阳性细胞结合
利用 PDGFRβ 抗体，通过免疫荧光检测到在 NCI-H292 移植瘤中存在大量 PDGFRβ 阳性细胞，而 Raji 移植瘤中 PDGFRβ 阳性细胞很少（图4）。进一步分析发现，将FAM-Z-tri 通过尾静脉注入荷瘤小鼠，循环 1 h 后取瘤体，立即冰冻切片，并通过免疫荧光显示 PDGFRβ 阳性细胞。结果如图5a 所示，FAM-Z-tri 广泛分布于 NCI-H292 移植瘤内，尤其在 PDGFRβ 强阳性细胞上分布较多。进一步用 CD31 抗体显示肿瘤血管内皮细胞，结果发现大多数FAM-Z-tri 沿血管内皮细胞分布但不完全重合，提示FAM-Z-tri 主要分布在肿瘤血管周细胞上。而FAM-Z-tri 在 Raji 移植瘤内分布较少（图5b），这与 Raji 瘤内 PDGFRβ 阳性细胞较少（图4）的结果一致。这些结果提示，Z-tri 在瘤内主要分布在 PDGFRβ 强阳性细胞上。
图4
移植瘤内 PDGFRβ 阳性细胞
图5
荧光标记的 Z-tri 在 NCI-H292（a）和 Raji（b）移植瘤内的分布
2.5 荧光标记后的 Z-tri 能快速、清晰地显示 NCI-H292 肺癌细胞移植瘤
为了检测荧光标记的分子探针是否能显示移植瘤，CF750-Z-tri 通过尾静脉被注入荷瘤小鼠体内，然后定时用小动物活体光学成像系统监测瘤内荧光信号。结果如图6a 所示，给药 1 h 后 CF750-Z-tri 就在 NCI-H292 移植瘤内富集。6 h 内，CF750-Z-tri 在瘤内的累积量随时间延长而增多，且肿瘤组织和周围正常组织的边界清楚。这说明CF750-Z-tri 光学分子探针能够快速、清楚地显示 PDGFRβ 高表达的肺癌组织。活体成像观察结束后，处死小鼠取出正常脏器和组织与肿瘤同时进行扫描，比较CF750-Z-tri 的组织分布差异性。结果如图6b 所示，在 NCI-H292 肺癌移植瘤模型中，除肾脏外，CF750-Z-tri 在肿瘤组织中分布最多，在心、肝、脾、肺、结肠和肌肉中分布很少。肾脏是代谢器官，多数小分子物质都通过肾脏代谢。因此，CF750-Z-tri 在肾脏中的累积可能是代谢所致。这些结果说明CF750-Z-tri 确实能够在 PDGFRβ 阳性细胞较多的肺癌组织中富集。但是，在 PDGFRβ 阳性细胞很少的 Raji 淋巴瘤细胞移植瘤内，给药后 6 h 内通过活体成像均未监测到明显的CF750-Z-tri 富集。剥离脏器和组织扫描发现，与 NCI-H292 移植瘤模型相似，Raji 细胞荷瘤鼠的肾脏中有大量CF750-Z-tri，但瘤内确实未检测到。这些结果说明，CF750-Z-tri 分子探针对肿瘤组织的显像与 PDGFRβ 阳性细胞的数量有相关性，能够快速显示 PDGFRβ 阳性细胞数量较多的肺癌组织，可以用于肺癌光学分子影像。
图6
基于 CF750-Z-tri 的移植瘤模型光学分子影像
a：活体成像；b：器官/组织成像
3 讨论
通过手术切除病变组织是肿瘤治疗的重要环节。但传统手术过程中，主要依赖外科医生通过触诊或肉眼观察辨别肿瘤组织，经验性强，容易导致切除不干净或过度切除。因此，如何精准切除肿瘤组织是外科手术面临的挑战之一。实时影像导航可能是解决该难题的有效方法。因此，自医学影像技术建立后，不少研究者对术中实时影像导航进行了探索。放射影像是目前最成熟的肿瘤显像方法，很早就被用于包括肺癌手术切除在内的术中导航[23]。但是，除放射性同位素的辐射作用外，放射影像术中导航还受到设备限制。比如，PET 具有很高的灵敏度，也能够检测深部组织而被广泛用于实体瘤诊断。但是，大型 PET 设备基本不可能用于术中导航。有人尝试利用手持小型 PET 探头进行术中导航，但又面临着探头太小、捕获的放射性信号不足等问题[24]。而基于荧光探针的光学影像技术，因无辐射，且对设备要求低而逐渐成为术中导航使用的主流方法[9, 25- 26]。
显像剂无疑是探针的重要组成部分。早期用于肺癌术中导航的光学显像剂主要是荧光素，如异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）等。这些荧光素的发射波长较短（<600 nm），组织穿透能力弱，只能显示很浅的肿瘤组织。加之正常组织中自发荧光强，信噪比低。因此，该类荧光探针的显像效果不好[15-16]。新近研究发现，荧光染料发射波长越长，组织穿透能力越强，正常组织背景越低，更容易获得高清图像。比如，近红外染料吲哚菁绿（indocyanine green，ICG），发射波长达到 800 nm，已广泛用于肿瘤的术中导航[27]。课题组前期工作中使用一种新的近红外染料 CF750，发射波长为 750 nm，也具有良好的成像效果[22]。由于课题组已建立成熟的偶联技术，本研究也选择 CF750 作为显像剂。但是，与 ICG 不同的是，CF750 尚未获批临床使用，临床安全性还需进一步评价。最近，国内学者还研制了波长更长的近红外染料，产生图像的信噪比更高[28]。这些染料也可在未来的工作中使用。
一些荧光染料，如 ICG，能够被肿瘤细胞大量摄取而可直接用于肿瘤显像。但是，为了增强其靶向性，研究者更倾向于将这些荧光染料与肿瘤靶向分子偶联制备成影像探针[12]。因此，肿瘤靶向分子的选择又成为分子影像探针制备过程中的重要环节。理论上讲，只要是在肿瘤微环境中高表达的分子均可作为靶标分子。但这些分子可能分别或同时高表达于肿瘤细胞和肿瘤基质细胞。早期的研究主要选择直接靶向肿瘤细胞[11]。但事实上，人体肿瘤组织中，肿瘤细胞往往被大量基质细胞包裹。这些细胞极有可能妨碍分子探针与肿瘤细胞的结合，因而直接靶向肿瘤细胞的探针显像效果不一定好。比如在肺癌组织中，就存在大量高表达 PDGFRβ 的基质细胞[17]。本研究也证实肺癌细胞 NCI-H292 裸鼠移植瘤高表达 PDGFRβ（图4）。这些信息提示，PDGFRβ 也可能作为肺癌分子探针的靶标。更有研究发现，PDGFRβ 的高表达是肺癌预后不良的独立因素，提示手术治疗时更应尽可能清除这些 PDGFRβ 阳性细胞。尽管 PDGFRβ 可能高表达于某些肿瘤细胞，但肿瘤新生血管周细胞和成纤维细胞等基质细胞则是组成型表达 PDGFRβ[29]。而且，肿瘤新生血管和成纤维细胞往往在肿瘤生长前缘更丰富。因此，若以 PDGFRβ 为靶标，可能更准确地显示肿瘤组织的边缘。若能制备出 PDGFRβ 靶向性分子探针，借助光学分子影像术中导航，可能更有利于指导将肿瘤组织切除干净。
根据这一设想，本研究选择了能特异性结合 PDGFRβ 的亲和体 ZPDGFRβ 与近红外染料 CF750 偶联，制备了CF750-Z-tri 分子探针。结果发现，尾静脉注射该分子探针 1 h 后，即可显示 NCI-H292 肺癌细胞裸鼠移植瘤。随着时间延长，瘤内荧光信号逐渐增强，但肿瘤组织与正常组织的边界清楚。6 h 后处死小鼠，取出重要脏器，发现CF750-Z-tri 主要富集于瘤体和肾脏。CF750-Z-tri 在肾脏中累积较多的主要原因在于其分子量较小，主要通过肾脏代谢。而瘤体中的富集说明CF750-Z-tri 具有肿瘤靶向性，能够清楚地显示肿瘤组织。当然，为了观察方便，本研究选择了裸鼠皮下移植瘤模型对该探针进行了测试。后续研究中还应该选择肺癌原位模型及转移模型进行成像，进而指导手术切除。在肿瘤靶向分子的选择中，已有研究通常选择靶向性和特异性很好的抗体及抗体片段。这些分子，尤其是完整抗体分子量大，对实体瘤的穿透能力弱。加之其半衰期长，需要更长时间代谢，难以在短时间内获得高清图像[30]。而本研究选择的亲和体分子，对靶标分子的亲和力和特异性与抗体相似，但分子量只有 7 KD，是完整抗体（150 KD）的 1/20，肿瘤组织穿透性更强，代谢更快，能够在数小时内产生并维持高清影像[31]。即便将其改造后分子量有所增大，但仍属于小分子蛋白。基于这些蛋白制备的荧光分子探针，用于肿瘤组织切除的术中导航别具优势。
利益冲突：无。
作者贡献：范洁负责探针制备及成像，论文撰写；陶泽负责细胞结合测试；李恒负责肿瘤模型建立；杨芬负责凝胶电泳；杨浩负责质量控制与数据分析；卢晓风负责课题设计及论文撰写。
医学影像学是肿瘤无创诊断所依赖的主要手段[1]。近年来，随着精准医学理念的不断深入发展，越来越多的分子影像技术被用于肿瘤的早期诊断和精准治疗方案的选择。事实上，肿瘤发生发展过程中，一些肿瘤相关分子的变化通常早于细胞和组织学水平的变化。因此，以识别这些肿瘤相关分子的特异性分子探针为基础，借助特定的影像设备产生高分辨分子影像，进而实现：（1）鉴别肿瘤及肿瘤微环境，为肿瘤早期诊断提供可靠依据[2]；（2）手术过程中准确指示肿瘤范围，指导外科医生精准切除肿瘤组织[3-4]；（3）鉴别肿瘤分子靶标，辅助筛选与之匹配的药物以实现肿瘤精准治疗[5-6]。由于具有传统医学影像学不可比拟的灵敏度和精确性，分子影像近年来在肿瘤诊断和治疗中越来越受到重视，大量分子影像探针被发展和应用[7]。
获得高分辨的分子影像需要借助分子影像探针及与之匹配的影像设备[8]。因此，分子影像探针往往又根据对应的影像设备分为超声、核磁共振、CT、正电子发射扫描（PET）及光学分子影像探针几大类[7]。外科手术迄今仍是肿瘤治疗的重要手段。但是，传统手术过程中，主要依赖外科医生通过触诊和肉眼观察辨别肿瘤组织，难以实现精准切除，肿瘤复发率高。因此，如何尽可能将肿瘤组织切除干净而又不损失过多正常组织是肿瘤外科手术面临的挑战。而通过实时影像指导手术是解决这一问题的可能途径。但所有依赖放射性同位素的显像手段均因辐射和设备复杂等问题而未能在术中广泛使用[9]。新近发展的光学分子影像技术对人体损伤小，设备相对简单，应用于术中指导医生精准切除肿瘤组织具有明显技术优势[10]。近年，越来越多的外科医生借助光学分子影像实施肿瘤外科手术。光学分子影像探针，尤其是肿瘤靶向性分子探针的研制也因此而备受关注[11]。
肿瘤靶向性分子影像探针是将造影剂用合适的方式与肿瘤靶向性分子连接而成。通常，造影剂和肿瘤靶向性分子需根据不同的肿瘤类型进行选择[12]。肺癌是全球发病人数最多、致死率最高的癌症[13]。尽管近年相应的诊断和治疗技术已明显提高，但肺癌的发生和致死率仍居高不下，仅 2018 年，全球就有肺癌新发病例 210 万，死亡 180 万。迄今为止，医疗界仍然共识，适时手术对提高肺癌治疗效果、延长患者生存期极为重要[2]。为了精准切除肺癌组织，研究者积极尝试利用光学分子影像进行术中导航并取得了一定进展[9, 14]。但是，前期研究选择的荧光素还存在组织穿透力弱，显像效果不佳的问题[15-16]，具有较强组织穿透力的近红外荧光染料可能是更佳的选择[9]。在选择肿瘤靶向性分子方面，已有研究主要是以靶向肿瘤细胞表面分子为主。事实上，人体组织中肿瘤细胞往往被大量基质细胞包裹，有可能极大地妨碍分子探针对肿瘤细胞的结合。因此，同时靶向肿瘤细胞和肿瘤基质细胞是肿瘤靶向性分子影像探针发展的新趋势[11]。
研究[17]发现，血小板衍生生长因子受体 β（platelet-derived growth factor receptor β，PDGFRβ）在人体肺癌组织大量表达。PDGFRβ 在肺癌组织中的高表达与预后不良密切相关[18-19]，提示 PDGFRβ 阳性细胞有促进肺癌发展或降低药效的作用，应尽量清除。因此，有必要制备 PDGFRβ 靶向性分子探针，并探索用其建立肺癌光学分子影像、辅助肺癌分子诊断及指导术中肺癌组织切除的可能性。根据这一设想，我们选择了 PDGFRβ 特异性亲和体 ZPDGFRβ[20]，将其与三聚结构域 tri 融合[21]，重组表达获得的蛋白 Z-tri 再与近红外荧光染料 CF750 进行偶联，制备成 PDGFRβ 靶向性光学分子探针CF750-Z-tri，并用其对肺癌移植瘤模型进行光学成像,进而评价其在肺癌分子影像中的应用潜力。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细菌和质粒
大肠杆菌 Escherichia coli（E. coli）Top10 菌株和 M15 菌株由实验室保存。pQE30 表达质粒为美国 QIAGEN 公司产品。
1.1.2 细胞株
人脑血管周细胞（human brain vascular pericytes，HBVP）购自美国 ScienCell 公司。人源 NCI-H292 肺癌细胞株、人源淋巴瘤 Raji 细胞株购自美国 ATCC（American Type Culture Collection）细胞库。
1.1.3 实验动物及伦理审查
实验中所用 Balb/c 雌性裸鼠（15~17g）购自北京华阜康生物科技公司，饲养于本院 SPF 级啮齿类动物实验中心。涉及的动物实验经四川大学华西医院实验动物伦理委员会审查批准，备案号为 20211075A。
1.2 方法
1.2.1 重组蛋白的制备
PDGFRβ 的特异性亲合体 ZPDGFRβ 由 Lindborg 等通过文库筛选获得[20]。为了提高其对 PDGFRβ 的亲和力，我们设计将其与来自于胶原蛋白的三聚结构域（trimerizing domain，tri）[21]通过连接子（G4S）3 融合，组建新的融合蛋白 Z-tri。根据融合蛋白的氨基酸序列，设计编码基因，委托江苏省心生物科技公司合成并通过 BamHⅠ和 SalⅠ克隆入 pQE30，转入 Top10 菌株中保存。
为了表达重组蛋白，将含有表达质粒的 Top10 菌株涂布于含有 100 μg/mL 氨苄西林（ampicillin，AMP）的 LB 固体培养基上，次日挑取单克隆，接种于含有相同浓度 AMP 的液体 LB 培养基中，于 37℃ 培养过夜。收集菌体提取质粒，用常规热激法将其转入表达菌 M15 中，再通过含有 AMP（100 μg/mL）和卡那霉素（Kanamycin，Kan，30 μg/mL）的双抗培养基筛选。获得的菌株再挑单克隆接种至含有 AMP 和 Kan 的 LB 液体培养基中，37℃ 培养至 A600nm 吸光值为 0.8~1.0，再加入 0.1 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG），继续于 24℃，120 rpm 振荡诱导培养过夜。次日离心收集菌体，用裂解液（500 mM 磷酸盐，pH 8.0；300 mM 氯化钠；10% 甘油；5 mM 咪唑）重悬后高压匀浆。破菌液 4℃，25000 g 离心 20 min，收集上清液，重复 4 次。再向上清液中加入 Ni-NTA 凝胶树脂，4℃ 结合 4~6 h。然后按照凝胶使用说明书对蛋白进行纯化。获得的蛋白在 4℃ 对 PBS（10 mM Na2HPO4；2 mM KH2PO4；137 mM NaCl；2.68 mM KCl，pH 7.4）透析过夜。蛋白浓度用美国 Bio-Rad 公司提供的 DC 试剂盒测定。
1.2.2 蛋白荧光标记
参考 Fan 等[22]描述的方法进行。Z-tri 蛋白用 PBS 稀释至 1.5 mg/mL，用碳酸氢钠调节至 pH 8.0 左右，Z-tri 与 CF750 染料（购自美国 Sigma 公司）或 FAM 染料按一定摩尔比混合，室温避光孵育 1 h。用透析法去除游离染料，通过电泳和荧光扫描检查蛋白是否标记上荧光染料。
1.2.3 蛋白电泳
蛋白纯度和蛋白荧光标记效率通过十二烷基磺酸钠丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）进行检测。分离胶浓度为 12.75%，浓缩胶浓度为 4%。样品中加入含有 β-巯基乙醇的样品处理液，沸水浴 10 min 后加入凝胶电泳。为检查蛋白是否标记上荧光染料，电泳结束后，凝胶先用荧光扫描仪成像，然后用考马斯亮蓝染色显示蛋白条带。用同时电泳的商品化分子量标准确定蛋白分子量。
1.2.4 流式细胞术检测蛋白对细胞的结合
周细胞 HBVP 用专用培养基，按细胞说明书提供的方法培养。NCI-H292 和 Raji 细胞用含 10% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的 RPMI1640 培养基，按 ATCC 官方网站提供的方法培养。为检测细胞表面 PDGFRβ 的表达，先将培养的细胞用胰酶消化，1 000 g离心 5 min，弃掉上清，再加入山羊抗人 PDGFRβ 抗体，室温孵育 1 h 后用含 0.5% FBS 的 PBS 洗两次。再加入绿色荧光标记的驴抗山羊二抗于室温孵育 0.5 h，洗涤两次后，用含 0.5% FBS 的 PBS 重悬后用于流式检测。为检测 Z-tri 蛋白对细胞的结合，将 150 nM FAM 标记的 Z-tri 与细胞于室温孵育 1 h，洗涤两次后即用流式检测。用无关的抗体作为同型对照。
1.2.5 免疫荧光检测 PDGFRβ 在移植瘤中的表达
Balb/c 雌性裸鼠背部皮下接种肿瘤细胞 NCI-H292（3×106个/只）或 Raji（7.5×106个/只），动态监测瘤体生长状态。确定成瘤后，定时测量瘤体长（length，L）和宽（eidth，W），按公式 V=L×W2/2 计算肿瘤体积（volume，V）。待瘤体生长至 100～200 mm3，处死小鼠剥取肿瘤，冰冻切片进行免疫荧光染色。按说明书推荐的浓度向肿瘤组织中加入山羊抗人 PDGFRβ 抗体，37℃ 避光孵育 1 h。PBS 洗涤后再加入驴抗山羊二抗，37℃ 避光孵育 0.5 h。用 DAPI 染液快速显示细胞核，然后于显微镜下观察拍照。
1.2.6 示踪法检测蛋白在瘤内的细胞分布
为了检测尾静脉注射的 Z-tri 蛋白是否能进入瘤体并结合到 PDGFRβ 阳性细胞上，按 1.2.5 描述的方法用 Balb/c 雌性裸鼠建立 NCI-H292 和 Raji 移植瘤模型。待瘤体长至 100～200 mm3，尾静脉注射 FAM 标记的 Z-tri（10 mg/kg），1 h 后处死小鼠剥取肿瘤，冰冻切片，按 1.2.5 描述的免疫荧光法显示 PDGFRβ 阳性细胞。通过 Z-tri 与 PDGFRβ 的共定位判断 Z-tri 是否结合到 PDGFRβ 阳性细胞上。同时，还可用 CD31 抗体，通过免疫荧光指示肿瘤血管内皮细胞。通过 Z-tri 与 CD31 的共定位，判断 Z-tri 的分布与肿瘤血管的关系。
1.2.7 光学成像显示肿瘤组织
按 1.2.5 描述的方法用 Balb/c 雌性裸鼠建立 NCI-H292 和 Raji 移植瘤模型。待瘤体长至 100～200 mm3，尾静脉注射 CF750 染料标记过的 Z-tri（6 mg/kg），然后于 1、2、4 和 6 h将小鼠置于活体成像仪中扫描，动态监测CF750-Z-tri 在移植瘤中的富集情况。观察结束后处死小鼠，迅速取出心、肝、脾、肺、肾、结肠、肌肉和肿瘤，按顺序整齐摆放于光学成像仪同时扫描。根据CF750-Z-tri 在上述脏器和组织中的分布情况，评价其是否有肿瘤特异性。
2 结果
2.1 Z-tri 在大肠杆菌中大量表达
为了制备足量蛋白，Z-tri 的编码基因被插入到 pQE30 质粒中构建了表达载体（图1a）。质粒载体转入表达菌株 M15，经 IPTG 诱导后，用 Ni-NTA 亲和层析法从大肠杆菌上清液中纯化出 Z-tri 蛋白。结果如图1b 所示，亲和层析纯化后的蛋白在还原 SDS-PAGE 电泳上显示为单一条带，说明其纯度高。根据分子量标准计算，Z-tri 的分子量大约为 14 KD，与预期分子量相符，说明我们利用大肠杆菌系统成功表达并制备了纯度较高的 Z-tri 融合蛋白。
图1
Z-tri 重组表达及分离纯化
a：表达质粒示意图；b：纯化产物 SDS-PAGE 电泳
2.2 Z-tri 容易被荧光染料标记
荧光染料在白光下易于猝灭。因此，快速、高效将荧光染料偶联到肿瘤靶向性分子上是制备光学影像分子探针的先决条件。将纯化的 Z-tri 蛋白，与 CF750 按分子比 1∶6 混合后，室温下避光孵育 1 h。电泳检查发现，与染料共同孵育后的 Z-tri 蛋白在凝胶上弥散分布，分子量比未与染料孵育的 Z-tri 蛋白大。将凝胶置于荧光扫描仪下发现，与 CF750 共同孵育后的 Z-tri 显示荧光，而未与 CF750 共同孵育的 Z-tri 无荧光（图2a）。这些结果说明 CF750 只需通过简单孵育，即可偶联到 Z-tri 上而制备分子探针CF750-Z-tri。用同样的方法，将 Z-tri 与 FAM 按照 1∶20 的摩尔比混合，也成功地将 FAM 偶联到 Z-tri 上，制备了分子探针FAM-Z-tri（图2b）。上述结果说明，荧光染料易于被偶联到 Z-tri 上，适合于制备光学分子探针。
图2
CF750-Z-tri（a） 和FAM-Z-tri（b）荧光分子探针的制备
2.3 荧光标记后的 Z-tri 能与体外培养的 PDGFRβ 阳性细胞结合
ZPDGFRβ 能够与 PDGFRβ 结合。但是，与三聚结构域 tri 融合并偶联上荧光染料后具有 PDGFRβ 结合能力，也是 Z-tri 能作为光学分子探针的先决条件之一。由于 CF750 产生的荧光不能在现有流式细胞仪上被检测，我们对FAM-Z-tri 进行检测，以推测CF750-Z-tri 对 PDGFRβ 的结合能力。结果发现，周细胞 HBVP 和 NCI-H292 肺癌细胞上表达 PDGFRβ，而 Raji 淋巴瘤细胞上不表达 PDGFRβ（图3a）。相应地，FAM-Z-tri 对 HBVP 和 NCI-H292 显示了明显的结合，而不结合 Raji 细胞（图3b）。这说明 Z-tri 能通过 PDGFRβ 与周细胞和肺癌细胞 NCI-H292 结合。荧光染料标记对 Z-tri 的细胞结合能力影响不大。
图3
PDGFRβ 表达（a）和 Z-tri 对细胞的结合（b）
2.4 荧光标记后的 Z-tri 能与移植瘤内 PDGFRβ 阳性细胞结合
利用 PDGFRβ 抗体，通过免疫荧光检测到在 NCI-H292 移植瘤中存在大量 PDGFRβ 阳性细胞，而 Raji 移植瘤中 PDGFRβ 阳性细胞很少（图4）。进一步分析发现，将FAM-Z-tri 通过尾静脉注入荷瘤小鼠，循环 1 h 后取瘤体，立即冰冻切片，并通过免疫荧光显示 PDGFRβ 阳性细胞。结果如图5a 所示，FAM-Z-tri 广泛分布于 NCI-H292 移植瘤内，尤其在 PDGFRβ 强阳性细胞上分布较多。进一步用 CD31 抗体显示肿瘤血管内皮细胞，结果发现大多数FAM-Z-tri 沿血管内皮细胞分布但不完全重合，提示FAM-Z-tri 主要分布在肿瘤血管周细胞上。而FAM-Z-tri 在 Raji 移植瘤内分布较少（图5b），这与 Raji 瘤内 PDGFRβ 阳性细胞较少（图4）的结果一致。这些结果提示，Z-tri 在瘤内主要分布在 PDGFRβ 强阳性细胞上。
图4
移植瘤内 PDGFRβ 阳性细胞
图5
荧光标记的 Z-tri 在 NCI-H292（a）和 Raji（b）移植瘤内的分布
2.5 荧光标记后的 Z-tri 能快速、清晰地显示 NCI-H292 肺癌细胞移植瘤
为了检测荧光标记的分子探针是否能显示移植瘤，CF750-Z-tri 通过尾静脉被注入荷瘤小鼠体内，然后定时用小动物活体光学成像系统监测瘤内荧光信号。结果如图6a 所示，给药 1 h 后 CF750-Z-tri 就在 NCI-H292 移植瘤内富集。6 h 内，CF750-Z-tri 在瘤内的累积量随时间延长而增多，且肿瘤组织和周围正常组织的边界清楚。这说明CF750-Z-tri 光学分子探针能够快速、清楚地显示 PDGFRβ 高表达的肺癌组织。活体成像观察结束后，处死小鼠取出正常脏器和组织与肿瘤同时进行扫描，比较CF750-Z-tri 的组织分布差异性。结果如图6b 所示，在 NCI-H292 肺癌移植瘤模型中，除肾脏外，CF750-Z-tri 在肿瘤组织中分布最多，在心、肝、脾、肺、结肠和肌肉中分布很少。肾脏是代谢器官，多数小分子物质都通过肾脏代谢。因此，CF750-Z-tri 在肾脏中的累积可能是代谢所致。这些结果说明CF750-Z-tri 确实能够在 PDGFRβ 阳性细胞较多的肺癌组织中富集。但是，在 PDGFRβ 阳性细胞很少的 Raji 淋巴瘤细胞移植瘤内，给药后 6 h 内通过活体成像均未监测到明显的CF750-Z-tri 富集。剥离脏器和组织扫描发现，与 NCI-H292 移植瘤模型相似，Raji 细胞荷瘤鼠的肾脏中有大量CF750-Z-tri，但瘤内确实未检测到。这些结果说明，CF750-Z-tri 分子探针对肿瘤组织的显像与 PDGFRβ 阳性细胞的数量有相关性，能够快速显示 PDGFRβ 阳性细胞数量较多的肺癌组织，可以用于肺癌光学分子影像。
图6
基于 CF750-Z-tri 的移植瘤模型光学分子影像
a：活体成像；b：器官/组织成像
3 讨论
通过手术切除病变组织是肿瘤治疗的重要环节。但传统手术过程中，主要依赖外科医生通过触诊或肉眼观察辨别肿瘤组织，经验性强，容易导致切除不干净或过度切除。因此，如何精准切除肿瘤组织是外科手术面临的挑战之一。实时影像导航可能是解决该难题的有效方法。因此，自医学影像技术建立后，不少研究者对术中实时影像导航进行了探索。放射影像是目前最成熟的肿瘤显像方法，很早就被用于包括肺癌手术切除在内的术中导航[23]。但是，除放射性同位素的辐射作用外，放射影像术中导航还受到设备限制。比如，PET 具有很高的灵敏度，也能够检测深部组织而被广泛用于实体瘤诊断。但是，大型 PET 设备基本不可能用于术中导航。有人尝试利用手持小型 PET 探头进行术中导航，但又面临着探头太小、捕获的放射性信号不足等问题[24]。而基于荧光探针的光学影像技术，因无辐射，且对设备要求低而逐渐成为术中导航使用的主流方法[9, 25- 26]。
显像剂无疑是探针的重要组成部分。早期用于肺癌术中导航的光学显像剂主要是荧光素，如异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）等。这些荧光素的发射波长较短（<600 nm），组织穿透能力弱，只能显示很浅的肿瘤组织。加之正常组织中自发荧光强，信噪比低。因此，该类荧光探针的显像效果不好[15-16]。新近研究发现，荧光染料发射波长越长，组织穿透能力越强，正常组织背景越低，更容易获得高清图像。比如，近红外染料吲哚菁绿（indocyanine green，ICG），发射波长达到 800 nm，已广泛用于肿瘤的术中导航[27]。课题组前期工作中使用一种新的近红外染料 CF750，发射波长为 750 nm，也具有良好的成像效果[22]。由于课题组已建立成熟的偶联技术，本研究也选择 CF750 作为显像剂。但是，与 ICG 不同的是，CF750 尚未获批临床使用，临床安全性还需进一步评价。最近，国内学者还研制了波长更长的近红外染料，产生图像的信噪比更高[28]。这些染料也可在未来的工作中使用。
一些荧光染料，如 ICG，能够被肿瘤细胞大量摄取而可直接用于肿瘤显像。但是，为了增强其靶向性，研究者更倾向于将这些荧光染料与肿瘤靶向分子偶联制备成影像探针[12]。因此，肿瘤靶向分子的选择又成为分子影像探针制备过程中的重要环节。理论上讲，只要是在肿瘤微环境中高表达的分子均可作为靶标分子。但这些分子可能分别或同时高表达于肿瘤细胞和肿瘤基质细胞。早期的研究主要选择直接靶向肿瘤细胞[11]。但事实上，人体肿瘤组织中，肿瘤细胞往往被大量基质细胞包裹。这些细胞极有可能妨碍分子探针与肿瘤细胞的结合，因而直接靶向肿瘤细胞的探针显像效果不一定好。比如在肺癌组织中，就存在大量高表达 PDGFRβ 的基质细胞[17]。本研究也证实肺癌细胞 NCI-H292 裸鼠移植瘤高表达 PDGFRβ（图4）。这些信息提示，PDGFRβ 也可能作为肺癌分子探针的靶标。更有研究发现，PDGFRβ 的高表达是肺癌预后不良的独立因素，提示手术治疗时更应尽可能清除这些 PDGFRβ 阳性细胞。尽管 PDGFRβ 可能高表达于某些肿瘤细胞，但肿瘤新生血管周细胞和成纤维细胞等基质细胞则是组成型表达 PDGFRβ[29]。而且，肿瘤新生血管和成纤维细胞往往在肿瘤生长前缘更丰富。因此，若以 PDGFRβ 为靶标，可能更准确地显示肿瘤组织的边缘。若能制备出 PDGFRβ 靶向性分子探针，借助光学分子影像术中导航，可能更有利于指导将肿瘤组织切除干净。
根据这一设想，本研究选择了能特异性结合 PDGFRβ 的亲和体 ZPDGFRβ 与近红外染料 CF750 偶联，制备了CF750-Z-tri 分子探针。结果发现，尾静脉注射该分子探针 1 h 后，即可显示 NCI-H292 肺癌细胞裸鼠移植瘤。随着时间延长，瘤内荧光信号逐渐增强，但肿瘤组织与正常组织的边界清楚。6 h 后处死小鼠，取出重要脏器，发现CF750-Z-tri 主要富集于瘤体和肾脏。CF750-Z-tri 在肾脏中累积较多的主要原因在于其分子量较小，主要通过肾脏代谢。而瘤体中的富集说明CF750-Z-tri 具有肿瘤靶向性，能够清楚地显示肿瘤组织。当然，为了观察方便，本研究选择了裸鼠皮下移植瘤模型对该探针进行了测试。后续研究中还应该选择肺癌原位模型及转移模型进行成像，进而指导手术切除。在肿瘤靶向分子的选择中，已有研究通常选择靶向性和特异性很好的抗体及抗体片段。这些分子，尤其是完整抗体分子量大，对实体瘤的穿透能力弱。加之其半衰期长，需要更长时间代谢，难以在短时间内获得高清图像[30]。而本研究选择的亲和体分子，对靶标分子的亲和力和特异性与抗体相似，但分子量只有 7 KD，是完整抗体（150 KD）的 1/20，肿瘤组织穿透性更强，代谢更快，能够在数小时内产生并维持高清影像[31]。即便将其改造后分子量有所增大，但仍属于小分子蛋白。基于这些蛋白制备的荧光分子探针，用于肿瘤组织切除的术中导航别具优势。
利益冲突：无。
作者贡献：范洁负责探针制备及成像，论文撰写；陶泽负责细胞结合测试；李恒负责肿瘤模型建立；杨芬负责凝胶电泳；杨浩负责质量控制与数据分析；卢晓风负责课题设计及论文撰写。
