引用本文： 李杰, 李政, 李斌, 余琦瑶, 毛文杰, 孟于琪, 朱多杰, 冯海明, 尹泚, 肖翠. 敲减 DUS4L 对人 A549 肺腺癌细胞基因表达调控的影响及差异基因分析. 中国胸心血管外科临床杂志, 2022, 29(6): 761-769. doi: 10.7507/1007-4848.202102059 复制
恶性肿瘤已经成为严重威胁人类健康的主要公共卫生问题之一。根据 2020 年世界卫生组织国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）研究数据显示，在所有癌症类型中，肺癌仍然是死亡率最高的恶性肿瘤，发病率居乳腺癌之下。2020 年全球新发肺癌病例约 220 万，因肺癌死亡约 176 万，占所有因肿瘤死亡人数的 18%[1]。近年来肺腺癌发病率不断上升，目前已经超越肺鳞状细胞癌（鳞癌）成为肺癌中最常见的病理类型[2]。在过去几十年中，尽管国内外对于肺癌的治疗方案层出不穷，如分子靶向治疗、立体定向放射治疗（stereotactic radiotherapy，SBRT）、免疫治疗等，并且成功拯救了成千上万的肺癌患者[3-4]，但是由于早期肺癌发病隐匿，难以诊断，约 70% 患者在确诊时就已经到了癌症后期（Ⅲ～Ⅳ期），导致肺癌患者 5 年生存率仅不到 20%[5]。由癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、国际癌症基因组联盟（International Cancer Genome Consortium，ICGC）等数据库开展的研究，最终产生了大量的基因组数据，这些数据清楚地表明，与其它肺癌亚型相比，肺腺癌与明显的基因组改变有关，并突出了这种疾病背后广泛存在的分子异质性[6]。因此，从基因组学层面更加深入地了解肺腺癌发生发展的调控机制，识别更加敏感、有效的肺癌早期生物标志物对改善肺癌患者预后具有重要意义。本研究旨在探索敲减类二氢尿苷合酶 4（dihydrouridine synthase 4-like，DUS4L）基因后肺腺癌基因表达的改变，为肺腺癌发生发展的分子机制、寻找新的生物标志物、提高诊断及预后等提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 临床样本获取
检索并下载 TCGA 数据库（
1.1.2 主要试剂与器材
主要试剂包括人肺腺癌 A549 细胞（中国科学院细胞库）、胎牛血清（Ausbian）、1640 培养基（Invitrogen）、shRNA 序列（上海吉凯基因化学技术有限公司合成）、T4 DNA 连接酶（Thermo Scientific）、GV115 慢病毒载体（GnenChem）、RIPA 裂解液（上海鼎国生物技术有限公司）、M-MLV 试剂盒（Promega）、BCA 蛋白分析试剂盒（碧云天生物技术有限公司）、EDU 试剂盒（锐博）、DUS4L 抗体（Abcam）、GAPDH 抗体（Santa-Cruz）和 ECL Western blotting Substrate 试剂盒（Thermo Scientific）等，主要仪器（耗材）包括 SDS-PAGE 蛋白电泳仪（上海天能）、PVDF 膜（Millipore）、荧光显微镜（Olympus）和 RT-PCR 仪（Roche）等。
1.2 方法
1.2.1 RNAi 慢病毒载体构建
KD 组 shRNA 序列为 5’-ACATCAGCAATCATAGATT-3’，NC 组 shRNA 序列为 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’，通过 T4 DNA 连接酶将双酶切线性化的载体和退火双链 DNA 连接，慢病毒载体转染 293T 细胞，48 h 后收集上清液，离心浓缩去除杂质，进行慢病毒质量检测。
1.2.2 慢病毒载体感染 A549 细胞
分别用 DUS4L shRNA 与阴性对照 shRNA 慢病毒载体感染肺腺癌 A549 细胞，感染 12 h 后更换常规培养液继续培养。感染 72 h 后，于荧光显微镜下观察荧光蛋白 GFP 表达情况，荧光率达 70%，细胞汇合度达 80%，收集细胞进行下游实验。
1.2.3 qPCR 检测目的基因敲减效率
将 KD 组和 NC 组细胞接种于 6 孔板，各设置 3 个生物学重复，待细胞汇合度达 80%，用 Trizol 试剂盒提取总 RNA。按照说明书，利用 M-MLV 逆转录试剂盒得到 c-DNA，再进行 PCR 扩增。PCR 引物序列如下：DUS4L 上游引物序列 5’-GCCCATTGATTGTTCAGTTTGC-3’，下游引物序列 5’-AACTCCTGTTGCTTCAGCCTTT-3’；GAPDH 上游引物序列 5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物序列 5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。目的基因相对定量分析采用 2−△△Ct法。
1.2.4 Western blotting 检测目的基因蛋白表达
收集目的细胞，用 RIPA 裂解，提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，将蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，转移到 PVDF 膜上，TBST 溶液室温封闭 1 h 或 4℃ 过夜，然后分别与一抗和二抗孵育，最后按照 ECL Western blotting Substrate 说明书显影。
1.2.5 EDU 细胞增殖检测
取对数生长期细胞，以每孔 2 000 接种于 96 孔板，培养至正常生长阶段。每孔加入 100 µL 50 µmol/L EDU 溶液孵育 2 h 后进行细胞固定、Apollo 染色、清洗、Hoechst 复染，染色完成后于荧光显微镜下采集图像（×100）。利用 Image Pro Plus 5.0 软件分析结果，计算 EDU 阳性率（EDU 阳性率=EDU 阳性细胞数/总细胞数×100%）。
1.2.6 RNA-seq 数据质量控制及预处理
用 Trizol 试剂盒提取总 RNA，后续建库及测序由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。测序完成后使用 FastQC 对原始测序数据进行质量控制，包括原始数据过滤、测序错误率检查、GC 含量分布检查。用 hisat2 软件分别将 KD 组和 NC 组 RNA-seq 数据对比到人类参考基因组上，对比完成后，再采用 subread 软件中的 featureCounts（1.5.0-p3 版本）工具进行基因水平定量和标准化处理。
1.3 统计学分析
采用 R 语言（3.5.2 版本）对标准化处理后的 RNA-seq 测序数据进行主成分分析，评估组间差异及组内样本重复情况。采用 DESeq2（1.16.1 版本）对基因进行差异分析，差异基因筛选条件如下：|log2（fold change）|>1 且 Padj<0.05。采用 clusterProfiler（3.4.4 版本）软件对差异基因集进行 GO 功能富集分析。GO 功能富集分析以 Padj<0.05 作为显著性富集的阈值。采用 GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）数据库分析 DUS4L mRNA 在非配对的肺腺癌组织与癌旁正常肺组织之间表达的差异；采用 Wilcoxon signed-rank 检验法分析 DUS4L 在配对的肺腺癌组织与癌旁正常组织之间的表达差异。采用 Mann-Whitney U 检验分析 DUS4L 基因在肺腺癌中表达水平与患者 T 和 TNM 分期是否存在相关性。
2 结果
2.1 生物信息学分析
DUS4L mRNA 在肺腺癌组织中的表达高于非配对或配对的癌旁正常组织；见图 1。DUS4L mRNA 的表达与肺腺癌患者的临床 T 和 TNM 分期相关；见表 1。
图1
DUS4L 表达差异图
a：非配对肿瘤组织与癌旁正常组织 DUS4L 表达差异图；b：配对肿瘤组织与癌旁正常组织 DUS4L 差异表达图
表1
DUS4L 基因表达与疾病分期的关系（例）
2.2 验证 DUS4L 敲减效率
从 qPCR 结果可以看出，经 shRNA 慢病毒感染后，KD 组 A549 细胞中 DUS4L 基因在 mRNA 水平的表达受到抑制（P<0.05），敲减效率达 64.5%。Western blotting 结果显示，KD 组与 NC 组相比，DUS4L 蛋白表达明显降低；见图 2。
图2
DUS4L 敲减结果验证
a：DUS4L 敲减结果的 qPCR 验证；b：DUS4L 敲减结果的 Western blotting 验证
2.3 EDU 细胞增殖
经 EDU 染色的细胞呈现红色荧光，Hoechst 复染的细胞核呈现蓝色荧光。EDU 染色结果显示 KD 组肺腺癌 A549 细胞增殖能力较 NC 组弱（P<0.05）；见图 3。
图3
EDU 实验检测细胞增殖能力
a：EDU 染色图片；b：EDU 染色阳性率统计结果
2.4 数据质量控制
经过原始数据过滤、测序错误率检查、GC 含量分布检查，获得后续分析使用的 clean reads 见表 2。
表2
数据质量控制后各样本 clean reads
2.5 RNA-seq 样本相关性及聚类
根据各组基因 FPKM（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）值计算组内及组间 Pearson 相关系数平方（R2），绘制热图，图中各重复组内相关系数大于组间，提示实验可靠性较高，样本选择合理；见图 4。RNA-seq 测序数据主成分分析显示，图中 KD 组三个重复聚为一类，并与 NC 组明显区别，表明两组细胞间基因表达具有显著差异；见图 5。
图4
样本间相关性热图
图5
主成分分析图
2.6 差异分析结果
筛选两组样本在不同状态下表达水平显著差异的基因，得到表达上调基因 289 个，下调基因 167 个。火山图可直观展示每个比较组合的差异基因分布情况，纵坐标表示基因在两组中表达差异的显著性水平，上调基因用红色点表示，下调基因用绿色点表示；见图 6。差异基因聚类分析，将表达模式相近的基因聚在一起，能更加直接地反映基因在两组细胞中的差异表达；见图 7。
图6
差异基因火山图［|log2（fold change）|>1，Padj<0.05］
图7
差异基因聚类分析图
2.7 GO 功能富集分析结果
DUS4L 基因敲减后，对差异基因进行 GO 功能富集分析，结果显示差异基因主要富集于白细胞介素-8（interleukin-8， IL-8）的产生、血管生成、血管内皮细胞增殖等生物学过程和信号通路；见图 8。
图8
GO 功能富集分析
3 讨论
DUS4L 基因又称 DUS4 或 PP35，根据基因卡数据库信息（https://www.genecards.org），我们发现人 DUS4L 基因位于染色体 7q22.3 上，由 15 040 bp 组成，有 8 个外显子。DUS4L 基因编码 DUS4L 蛋白，该蛋白由 317 个氨基酸组成，分子量约为 36 kDa，其作用为催化合成二氢尿嘧啶（大多数 tRNA 的 D-环中发现的修饰碱基）。DUS4L 基因在人类癌症中的作用报道尚较少。Kim 等[7]通过转录组测序技术及生物信息学筛选出胃癌细胞系中的 DUS4L-BCAP29 融合转录本，并发现 siRNA 敲除 DUS4L-BCAP29 后胃癌细胞增殖受到抑制，软琼脂试验进一步证实了 DUS4L-BCAP29 融合转录本在胃癌中的致瘤潜力。Nacu 等[8]对 3 例人前列腺癌组织及相应的正常标本进行转录组测序后分析发现，DUS4L-BCAP29 融合转录本在前列腺癌组织中的表达相较于正常组织更高，并可能在肿瘤组织中起作用。而有研究[9-11]发现 DUS4L-BCAP29 融合转录本也存在于非癌症上皮细胞及成纤维细胞系中，并认为 DUS4L-BCAP29 融合转录本的促生长作用并非癌细胞独有。此外，也有学者[12-13]报道 DUS4L 基因与骨性关节炎相关。我们前期已经通过实验研究发现敲减 DUS4L 可以诱导肺腺癌 A549 细胞周期阻滞，影响细胞的克隆能力，并促进细胞凋亡[14]。现在我们通过对敲减 DUS4L 后的肺腺癌 A549 细胞测序，并对测序结果进行生物信息学分析，旨在寻找 DUS4L 影响肺腺癌 A549 细胞增殖、克隆和凋亡的可能分子机制。
我们通过检索 TCGA 数据库，发现 DUS4L mRNA 在肺腺癌组织中的表达较癌旁及正常组织显著升高，并且其表达水平与患者 T 分期及 TNM 分期存在相关性。利用慢病毒 shRNA 干扰技术成功敲减肺腺癌 A549 细胞中 DUS4L 基因，随后 EDU 细胞增殖实验提示，敲减 DUS4L 基因能够抑制肺腺癌 A549 细胞的增殖能力。利用转录组测序技术研究了 DUS4L 基因敲减对肺腺癌 A549 细胞基因表达调控的影响及其在肺腺癌中的作用。DUS4L 基因敲除后，肺腺癌 A549 细胞基因表达发生改变，共测得差异基因 456 个，提示 DUS4L 对肺腺癌 A549 细胞基因表达有着广泛的调控作用。其中，STC2 和 TRIB3 两个基因显著下调。STC2 在多种肿瘤中均有促癌作用，其在结直肠癌、食管鳞癌、肾癌及胃癌中高表达，且与患者生存率呈负相关[15-18]。Na 等[19]证实 STC2 mRNA 和蛋白在肺癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，且体外研究显示敲减 STC2 后，肿瘤细胞迁移和侵袭能力明显降低。STC2 蛋白可与内质网钙离子传感器 STIM1 结合，抑制质膜储存钙内流，保护细胞免于凋亡[20]。STC2 还能通过激活 Jun-Axl-Erk 信号轴促进肺癌细胞对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）的耐药性[21]。TRIB3 可与 EGFR 相互作用，招募蛋白激酶 Cα（protein kinase Cα，PKCα），诱导 Thr654 磷酸化，并诱导膜旁区域 Lys689 泛素化，增强 EGFR 的循环性、稳定性、下游活性，促进非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的发生发展。Yu 等[22]提出以 TRIB3-EGFR 相互作用为靶点促进 EGFR 降解来治疗 EGFR 相关 NSCLC 病例。因此，我们推测 DUS4L 可能通过调节 STC2 和 TRIB3 的表达来促进肺腺癌的发生发展，并增加肺腺癌对 EGFR TKIs 的耐药性。
GO 功能富集分析显示，差异基因主要富集于 IL-8 产生的调控、血管生成、血管内皮细胞增殖等生物学过程。IL-8 是一种促炎趋化因子，它与 2 个 G 蛋白偶联受体 CXCR1 和 CXCR2 结合，负责将中性粒细胞吸引到损伤和炎症部位。IL-8 可由巨噬细胞和内皮细胞分泌，而其相应的受体则表达于单核细胞、粒细胞和内皮细胞[23]。IL-8 已被证实是一种强有力的血管生成因子[24]，其能以浓度依赖的方式刺激内皮细胞增殖和毛细血管生成，并且这一作用可被抗 IL-8 抗体阻断[25]。在正常细胞中，IL-8 的表达可能通过炎性刺激的诱导而启动，而在肿瘤进展的过程中，由于微环境氧压的降低而 IL-8 表达增加。增加的 IL-8 通过与内皮细胞上 Duffy 抗原趋化因子受体结合，以及与白细胞上 CXC 趋化因子受体 1 和 CXC 趋化因子受体 2 结合诱导白细胞浸润和活化，直接和/或间接促进血管生成。血管生成在所有实体恶性肿瘤的发生、发展中起着至关重要的作用。在没有局部毛细血管增生的情况下，肿瘤直径可能不会超过 2～3 mm[26]。Yuan 等[27]通过 qRT-PCR 检测了 58 例 NSCLC 患者（鳞癌 29 例，腺癌 29 例）肿瘤和非肿瘤肺组织中 IL-8 mRNA 的表达并与患者的临床病理特征、血管生成和预后进行了相关性分析，发现 IL-8 mRNA 在肿瘤组织中的表达明显增强，高表达与晚期肿瘤（ⅢA/ⅢB）、远处淋巴结转移、肿瘤微血管计数（microvascular count，MC）增高密切相关。多因素分析显示，IL-8 mRNA 表达和瘤内 MC 是影响患者生存和复发的最重要的预测因素。IL-8 不仅介导了肺癌血管生成中内皮细胞的趋化作用[28]，并通过其血管生成特性作为 NSCLC 肿瘤生长的促进剂。Arenberg 等[29]使用 IL-8 抗体处理 A549 荷瘤小鼠并与对照组相比发现，处理组肿瘤血管减少 58%，瘤体减小 40%。鉴于癌症患者的 IL-8 主要由肿瘤细胞本身产生，其血清浓度已被证明与肿瘤负荷相关[30]，并且在诱导免疫耐药方面具有重要作用[31-32]。有学者[33-34]提出 IL-8 可作为一种血清生物标志物，用于免疫治疗临床疗效的检测和预测。基于 IL-8 在肿瘤细胞上皮间充质转化、血管生成、诱导免疫耐药中的作用[35]，IL-8 已被提出作为肿瘤治疗的靶点，将免疫治疗和 IL-8 中和抗体联合使用，能够提高肿瘤免疫治疗的疗效[36-37]。
综上所述，DUS4L mRNA 在肺腺癌肿瘤组织中的表达显著升高，敲减 DUS4L 基因后能够抑制肺腺癌 A549 细胞的增殖能力；DUS4L 能广泛调控肺腺癌 A549 细胞基因表达，差异基因主要富集在 IL-8 的产生、血管生成、血管内皮细胞增殖等信号通路，提示 DUS4L 可能参与 IL-8 生成的调控，并对肺腺癌血管发育产生影响，从而在肿瘤发展、侵袭、远处转移中起着潜在作用。但 DUS4L 是如何调控 IL-8 的产生及血管发育还不明确，要了解其具体机制，还需要做进一步研究。总之，本研究为进一步探索 DUS4L 在肺腺癌中的作用机制、寻找肿瘤标志物及治疗靶点提供了线索。
利益冲突：无。
作者贡献：李杰负责实验操作、数据整理分析、论文撰写；李政负责数据处理、论文审阅；李斌负责论文设计、实验指导、论文审阅；余琦瑶、毛文杰、孟于琪、朱多杰、冯海明、尹泚、肖翠负责对文章的知识性内容做批判性审阅。
恶性肿瘤已经成为严重威胁人类健康的主要公共卫生问题之一。根据 2020 年世界卫生组织国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）研究数据显示，在所有癌症类型中，肺癌仍然是死亡率最高的恶性肿瘤，发病率居乳腺癌之下。2020 年全球新发肺癌病例约 220 万，因肺癌死亡约 176 万，占所有因肿瘤死亡人数的 18%[1]。近年来肺腺癌发病率不断上升，目前已经超越肺鳞状细胞癌（鳞癌）成为肺癌中最常见的病理类型[2]。在过去几十年中，尽管国内外对于肺癌的治疗方案层出不穷，如分子靶向治疗、立体定向放射治疗（stereotactic radiotherapy，SBRT）、免疫治疗等，并且成功拯救了成千上万的肺癌患者[3-4]，但是由于早期肺癌发病隐匿，难以诊断，约 70% 患者在确诊时就已经到了癌症后期（Ⅲ～Ⅳ期），导致肺癌患者 5 年生存率仅不到 20%[5]。由癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、国际癌症基因组联盟（International Cancer Genome Consortium，ICGC）等数据库开展的研究，最终产生了大量的基因组数据，这些数据清楚地表明，与其它肺癌亚型相比，肺腺癌与明显的基因组改变有关，并突出了这种疾病背后广泛存在的分子异质性[6]。因此，从基因组学层面更加深入地了解肺腺癌发生发展的调控机制，识别更加敏感、有效的肺癌早期生物标志物对改善肺癌患者预后具有重要意义。本研究旨在探索敲减类二氢尿苷合酶 4（dihydrouridine synthase 4-like，DUS4L）基因后肺腺癌基因表达的改变，为肺腺癌发生发展的分子机制、寻找新的生物标志物、提高诊断及预后等提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 临床样本获取
检索并下载 TCGA 数据库（
1.1.2 主要试剂与器材
主要试剂包括人肺腺癌 A549 细胞（中国科学院细胞库）、胎牛血清（Ausbian）、1640 培养基（Invitrogen）、shRNA 序列（上海吉凯基因化学技术有限公司合成）、T4 DNA 连接酶（Thermo Scientific）、GV115 慢病毒载体（GnenChem）、RIPA 裂解液（上海鼎国生物技术有限公司）、M-MLV 试剂盒（Promega）、BCA 蛋白分析试剂盒（碧云天生物技术有限公司）、EDU 试剂盒（锐博）、DUS4L 抗体（Abcam）、GAPDH 抗体（Santa-Cruz）和 ECL Western blotting Substrate 试剂盒（Thermo Scientific）等，主要仪器（耗材）包括 SDS-PAGE 蛋白电泳仪（上海天能）、PVDF 膜（Millipore）、荧光显微镜（Olympus）和 RT-PCR 仪（Roche）等。
1.2 方法
1.2.1 RNAi 慢病毒载体构建
KD 组 shRNA 序列为 5’-ACATCAGCAATCATAGATT-3’，NC 组 shRNA 序列为 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’，通过 T4 DNA 连接酶将双酶切线性化的载体和退火双链 DNA 连接，慢病毒载体转染 293T 细胞，48 h 后收集上清液，离心浓缩去除杂质，进行慢病毒质量检测。
1.2.2 慢病毒载体感染 A549 细胞
分别用 DUS4L shRNA 与阴性对照 shRNA 慢病毒载体感染肺腺癌 A549 细胞，感染 12 h 后更换常规培养液继续培养。感染 72 h 后，于荧光显微镜下观察荧光蛋白 GFP 表达情况，荧光率达 70%，细胞汇合度达 80%，收集细胞进行下游实验。
1.2.3 qPCR 检测目的基因敲减效率
将 KD 组和 NC 组细胞接种于 6 孔板，各设置 3 个生物学重复，待细胞汇合度达 80%，用 Trizol 试剂盒提取总 RNA。按照说明书，利用 M-MLV 逆转录试剂盒得到 c-DNA，再进行 PCR 扩增。PCR 引物序列如下：DUS4L 上游引物序列 5’-GCCCATTGATTGTTCAGTTTGC-3’，下游引物序列 5’-AACTCCTGTTGCTTCAGCCTTT-3’；GAPDH 上游引物序列 5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物序列 5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。目的基因相对定量分析采用 2−△△Ct法。
1.2.4 Western blotting 检测目的基因蛋白表达
收集目的细胞，用 RIPA 裂解，提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，将蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，转移到 PVDF 膜上，TBST 溶液室温封闭 1 h 或 4℃ 过夜，然后分别与一抗和二抗孵育，最后按照 ECL Western blotting Substrate 说明书显影。
1.2.5 EDU 细胞增殖检测
取对数生长期细胞，以每孔 2 000 接种于 96 孔板，培养至正常生长阶段。每孔加入 100 µL 50 µmol/L EDU 溶液孵育 2 h 后进行细胞固定、Apollo 染色、清洗、Hoechst 复染，染色完成后于荧光显微镜下采集图像（×100）。利用 Image Pro Plus 5.0 软件分析结果，计算 EDU 阳性率（EDU 阳性率=EDU 阳性细胞数/总细胞数×100%）。
1.2.6 RNA-seq 数据质量控制及预处理
用 Trizol 试剂盒提取总 RNA，后续建库及测序由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。测序完成后使用 FastQC 对原始测序数据进行质量控制，包括原始数据过滤、测序错误率检查、GC 含量分布检查。用 hisat2 软件分别将 KD 组和 NC 组 RNA-seq 数据对比到人类参考基因组上，对比完成后，再采用 subread 软件中的 featureCounts（1.5.0-p3 版本）工具进行基因水平定量和标准化处理。
1.3 统计学分析
采用 R 语言（3.5.2 版本）对标准化处理后的 RNA-seq 测序数据进行主成分分析，评估组间差异及组内样本重复情况。采用 DESeq2（1.16.1 版本）对基因进行差异分析，差异基因筛选条件如下：|log2（fold change）|>1 且 Padj<0.05。采用 clusterProfiler（3.4.4 版本）软件对差异基因集进行 GO 功能富集分析。GO 功能富集分析以 Padj<0.05 作为显著性富集的阈值。采用 GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）数据库分析 DUS4L mRNA 在非配对的肺腺癌组织与癌旁正常肺组织之间表达的差异；采用 Wilcoxon signed-rank 检验法分析 DUS4L 在配对的肺腺癌组织与癌旁正常组织之间的表达差异。采用 Mann-Whitney U 检验分析 DUS4L 基因在肺腺癌中表达水平与患者 T 和 TNM 分期是否存在相关性。
2 结果
2.1 生物信息学分析
DUS4L mRNA 在肺腺癌组织中的表达高于非配对或配对的癌旁正常组织；见图 1。DUS4L mRNA 的表达与肺腺癌患者的临床 T 和 TNM 分期相关；见表 1。
图1
DUS4L 表达差异图
a：非配对肿瘤组织与癌旁正常组织 DUS4L 表达差异图；b：配对肿瘤组织与癌旁正常组织 DUS4L 差异表达图
表1
DUS4L 基因表达与疾病分期的关系（例）
2.2 验证 DUS4L 敲减效率
从 qPCR 结果可以看出，经 shRNA 慢病毒感染后，KD 组 A549 细胞中 DUS4L 基因在 mRNA 水平的表达受到抑制（P<0.05），敲减效率达 64.5%。Western blotting 结果显示，KD 组与 NC 组相比，DUS4L 蛋白表达明显降低；见图 2。
图2
DUS4L 敲减结果验证
a：DUS4L 敲减结果的 qPCR 验证；b：DUS4L 敲减结果的 Western blotting 验证
2.3 EDU 细胞增殖
经 EDU 染色的细胞呈现红色荧光，Hoechst 复染的细胞核呈现蓝色荧光。EDU 染色结果显示 KD 组肺腺癌 A549 细胞增殖能力较 NC 组弱（P<0.05）；见图 3。
图3
EDU 实验检测细胞增殖能力
a：EDU 染色图片；b：EDU 染色阳性率统计结果
2.4 数据质量控制
经过原始数据过滤、测序错误率检查、GC 含量分布检查，获得后续分析使用的 clean reads 见表 2。
表2
数据质量控制后各样本 clean reads
2.5 RNA-seq 样本相关性及聚类
根据各组基因 FPKM（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）值计算组内及组间 Pearson 相关系数平方（R2），绘制热图，图中各重复组内相关系数大于组间，提示实验可靠性较高，样本选择合理；见图 4。RNA-seq 测序数据主成分分析显示，图中 KD 组三个重复聚为一类，并与 NC 组明显区别，表明两组细胞间基因表达具有显著差异；见图 5。
图4
样本间相关性热图
图5
主成分分析图
2.6 差异分析结果
筛选两组样本在不同状态下表达水平显著差异的基因，得到表达上调基因 289 个，下调基因 167 个。火山图可直观展示每个比较组合的差异基因分布情况，纵坐标表示基因在两组中表达差异的显著性水平，上调基因用红色点表示，下调基因用绿色点表示；见图 6。差异基因聚类分析，将表达模式相近的基因聚在一起，能更加直接地反映基因在两组细胞中的差异表达；见图 7。
图6
差异基因火山图［|log2（fold change）|>1，Padj<0.05］
图7
差异基因聚类分析图
2.7 GO 功能富集分析结果
DUS4L 基因敲减后，对差异基因进行 GO 功能富集分析，结果显示差异基因主要富集于白细胞介素-8（interleukin-8， IL-8）的产生、血管生成、血管内皮细胞增殖等生物学过程和信号通路；见图 8。
图8
GO 功能富集分析
3 讨论
DUS4L 基因又称 DUS4 或 PP35，根据基因卡数据库信息（https://www.genecards.org），我们发现人 DUS4L 基因位于染色体 7q22.3 上，由 15 040 bp 组成，有 8 个外显子。DUS4L 基因编码 DUS4L 蛋白，该蛋白由 317 个氨基酸组成，分子量约为 36 kDa，其作用为催化合成二氢尿嘧啶（大多数 tRNA 的 D-环中发现的修饰碱基）。DUS4L 基因在人类癌症中的作用报道尚较少。Kim 等[7]通过转录组测序技术及生物信息学筛选出胃癌细胞系中的 DUS4L-BCAP29 融合转录本，并发现 siRNA 敲除 DUS4L-BCAP29 后胃癌细胞增殖受到抑制，软琼脂试验进一步证实了 DUS4L-BCAP29 融合转录本在胃癌中的致瘤潜力。Nacu 等[8]对 3 例人前列腺癌组织及相应的正常标本进行转录组测序后分析发现，DUS4L-BCAP29 融合转录本在前列腺癌组织中的表达相较于正常组织更高，并可能在肿瘤组织中起作用。而有研究[9-11]发现 DUS4L-BCAP29 融合转录本也存在于非癌症上皮细胞及成纤维细胞系中，并认为 DUS4L-BCAP29 融合转录本的促生长作用并非癌细胞独有。此外，也有学者[12-13]报道 DUS4L 基因与骨性关节炎相关。我们前期已经通过实验研究发现敲减 DUS4L 可以诱导肺腺癌 A549 细胞周期阻滞，影响细胞的克隆能力，并促进细胞凋亡[14]。现在我们通过对敲减 DUS4L 后的肺腺癌 A549 细胞测序，并对测序结果进行生物信息学分析，旨在寻找 DUS4L 影响肺腺癌 A549 细胞增殖、克隆和凋亡的可能分子机制。
我们通过检索 TCGA 数据库，发现 DUS4L mRNA 在肺腺癌组织中的表达较癌旁及正常组织显著升高，并且其表达水平与患者 T 分期及 TNM 分期存在相关性。利用慢病毒 shRNA 干扰技术成功敲减肺腺癌 A549 细胞中 DUS4L 基因，随后 EDU 细胞增殖实验提示，敲减 DUS4L 基因能够抑制肺腺癌 A549 细胞的增殖能力。利用转录组测序技术研究了 DUS4L 基因敲减对肺腺癌 A549 细胞基因表达调控的影响及其在肺腺癌中的作用。DUS4L 基因敲除后，肺腺癌 A549 细胞基因表达发生改变，共测得差异基因 456 个，提示 DUS4L 对肺腺癌 A549 细胞基因表达有着广泛的调控作用。其中，STC2 和 TRIB3 两个基因显著下调。STC2 在多种肿瘤中均有促癌作用，其在结直肠癌、食管鳞癌、肾癌及胃癌中高表达，且与患者生存率呈负相关[15-18]。Na 等[19]证实 STC2 mRNA 和蛋白在肺癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，且体外研究显示敲减 STC2 后，肿瘤细胞迁移和侵袭能力明显降低。STC2 蛋白可与内质网钙离子传感器 STIM1 结合，抑制质膜储存钙内流，保护细胞免于凋亡[20]。STC2 还能通过激活 Jun-Axl-Erk 信号轴促进肺癌细胞对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）的耐药性[21]。TRIB3 可与 EGFR 相互作用，招募蛋白激酶 Cα（protein kinase Cα，PKCα），诱导 Thr654 磷酸化，并诱导膜旁区域 Lys689 泛素化，增强 EGFR 的循环性、稳定性、下游活性，促进非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的发生发展。Yu 等[22]提出以 TRIB3-EGFR 相互作用为靶点促进 EGFR 降解来治疗 EGFR 相关 NSCLC 病例。因此，我们推测 DUS4L 可能通过调节 STC2 和 TRIB3 的表达来促进肺腺癌的发生发展，并增加肺腺癌对 EGFR TKIs 的耐药性。
GO 功能富集分析显示，差异基因主要富集于 IL-8 产生的调控、血管生成、血管内皮细胞增殖等生物学过程。IL-8 是一种促炎趋化因子，它与 2 个 G 蛋白偶联受体 CXCR1 和 CXCR2 结合，负责将中性粒细胞吸引到损伤和炎症部位。IL-8 可由巨噬细胞和内皮细胞分泌，而其相应的受体则表达于单核细胞、粒细胞和内皮细胞[23]。IL-8 已被证实是一种强有力的血管生成因子[24]，其能以浓度依赖的方式刺激内皮细胞增殖和毛细血管生成，并且这一作用可被抗 IL-8 抗体阻断[25]。在正常细胞中，IL-8 的表达可能通过炎性刺激的诱导而启动，而在肿瘤进展的过程中，由于微环境氧压的降低而 IL-8 表达增加。增加的 IL-8 通过与内皮细胞上 Duffy 抗原趋化因子受体结合，以及与白细胞上 CXC 趋化因子受体 1 和 CXC 趋化因子受体 2 结合诱导白细胞浸润和活化，直接和/或间接促进血管生成。血管生成在所有实体恶性肿瘤的发生、发展中起着至关重要的作用。在没有局部毛细血管增生的情况下，肿瘤直径可能不会超过 2～3 mm[26]。Yuan 等[27]通过 qRT-PCR 检测了 58 例 NSCLC 患者（鳞癌 29 例，腺癌 29 例）肿瘤和非肿瘤肺组织中 IL-8 mRNA 的表达并与患者的临床病理特征、血管生成和预后进行了相关性分析，发现 IL-8 mRNA 在肿瘤组织中的表达明显增强，高表达与晚期肿瘤（ⅢA/ⅢB）、远处淋巴结转移、肿瘤微血管计数（microvascular count，MC）增高密切相关。多因素分析显示，IL-8 mRNA 表达和瘤内 MC 是影响患者生存和复发的最重要的预测因素。IL-8 不仅介导了肺癌血管生成中内皮细胞的趋化作用[28]，并通过其血管生成特性作为 NSCLC 肿瘤生长的促进剂。Arenberg 等[29]使用 IL-8 抗体处理 A549 荷瘤小鼠并与对照组相比发现，处理组肿瘤血管减少 58%，瘤体减小 40%。鉴于癌症患者的 IL-8 主要由肿瘤细胞本身产生，其血清浓度已被证明与肿瘤负荷相关[30]，并且在诱导免疫耐药方面具有重要作用[31-32]。有学者[33-34]提出 IL-8 可作为一种血清生物标志物，用于免疫治疗临床疗效的检测和预测。基于 IL-8 在肿瘤细胞上皮间充质转化、血管生成、诱导免疫耐药中的作用[35]，IL-8 已被提出作为肿瘤治疗的靶点，将免疫治疗和 IL-8 中和抗体联合使用，能够提高肿瘤免疫治疗的疗效[36-37]。
综上所述，DUS4L mRNA 在肺腺癌肿瘤组织中的表达显著升高，敲减 DUS4L 基因后能够抑制肺腺癌 A549 细胞的增殖能力；DUS4L 能广泛调控肺腺癌 A549 细胞基因表达，差异基因主要富集在 IL-8 的产生、血管生成、血管内皮细胞增殖等信号通路，提示 DUS4L 可能参与 IL-8 生成的调控，并对肺腺癌血管发育产生影响，从而在肿瘤发展、侵袭、远处转移中起着潜在作用。但 DUS4L 是如何调控 IL-8 的产生及血管发育还不明确，要了解其具体机制，还需要做进一步研究。总之，本研究为进一步探索 DUS4L 在肺腺癌中的作用机制、寻找肿瘤标志物及治疗靶点提供了线索。
利益冲突：无。
作者贡献：李杰负责实验操作、数据整理分析、论文撰写；李政负责数据处理、论文审阅；李斌负责论文设计、实验指导、论文审阅；余琦瑶、毛文杰、孟于琪、朱多杰、冯海明、尹泚、肖翠负责对文章的知识性内容做批判性审阅。
