引用本文： 谢少华, 戴维, 刘明心, 向润, 谢天鹏, 杨晓军, 胡彬, 庄翔, 杨晓樽, 田博, 李雯雯, 段忆翔, 李强. 呼出气中挥发性有机化合物对<50岁人群肺结节良恶性的预测价值. 中国胸心血管外科临床杂志, 2020, 27(6): 675-680. doi: 10.7507/1007-4848.202002125 复制
2018 年全球癌症统计数据显示，肺癌的发病率及死亡率居所有恶性肿瘤之首[1]。早期确诊肺癌患者的 5 年生存率可达到 70%～90%，而晚期确诊肺癌患者的 5 年生存率下降至 12%[2-3]。因此，肺癌的早期诊断对降低死亡率、提高生存率至关重要。目前临床常用的早期肺癌筛查方式为低剂量螺旋 CT（low-dose CT，LDCT），其提高了早期肺癌的诊断率并在一定程度上降低了肺癌的死亡率。在我国，LDCT 逐渐用于>50 岁高危人群的肺癌筛查[4]。随着 LDCT 的广泛使用，越来越多的肺结节在中青年人群中被发现。在肺结节的后续随访中，LDCT 可带来辐射伤害，反复 LDCT 检查可加重患者的心理负担，同时增加了患者及社会的经济负担。目前急需一种快速、灵敏、无创的方法辅助中青年人群肺结节的良恶性诊断。
人体内的代谢产物，如可挥发性有机物（volatile organic compounds，VOCs），通过血液到达肺部，在肺部进行物质交换并通过呼吸道排出体外，因此呼出气中 VOCs 可反映机体的疾病状态。呼出气中 VOCs 的检测及分析具有无创、快速、可重复等特点，有望成为辅助肺癌早期诊断的有力手段。呼出气中 VOCs 用于肺癌诊断相关研究已有 30 余年，大量研究结果均表明，VOCs 在肺癌的早期诊断上拥有巨大潜力[5]。但目前已发表的研究中肺癌组与对照组的年龄并不匹配，肺癌组患者的年龄通常明显大于对照组，且平均年龄多>50 岁[6]。同时，大多数研究的对照组选择为健康人群，少数研究将不同程度的慢性阻塞性肺疾病伴肺气肿[7-10]、慢性支气管炎[11]、肺炎[12]、肺结核[12]、哮喘[9, 12]患者同时作为对照组。目前尚缺乏针对中青年人群以及肺部有明确占位性病变的专门研究。本前瞻性研究将<50 岁且有肺结节的患者作为研究对象，旨在探讨 VOCs 对中青年人群肺结节良恶性的预测能力。
1 资料与方法
1.1 试剂和材料
试剂：异戊二烯、丙酮、环戊烷、3-甲基戊烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、乙苯、壬烷、邻二甲苯、β-蒎烯、二戊烯、丁二酸二甲酯、壬醛、萘、十三烷的标准样品购自上海阿拉丁试剂有限公司。研究中 VOCs 的定性采用标准样品标定结合 NIST08 数据库检索的方式进行。
材料与设备：500 mL-Tedlar 采气袋，购自大连德霖气体包装有限公司；Bio-VOC 采气筒购自英国 Markes 公司；固相微萃取手柄（57330-U）和 DVB/CAR/PDMS 萃取纤维针购于美国 Sigma-Aldrich 公司；TRACE 1300 气相色谱联合 TSQ8000 三重四级杆质谱仪为美国赛默飞世尔科技有限公司产品。
1.2 临床资料和分组
将 2019 年 8 月 1 日至 2020 年 1 月 15 日于四川省肿瘤医院胸外科中心就诊的、胸部 CT 显示有肺部占位性病变的患者作为研究对象。
入组标准：（1）年龄<50 岁，性别不限；（2）胸部 CT 测量肺部病变最大直径≤3 cm；（3）经临床评估高度怀疑为肺癌并拟行穿刺活检或手术切除；（4）获得知情同意。
排除标准：（1）既往有恶性肿瘤病史；（2）同时伴有以下系统性疾病：慢性支气管肺炎伴肺气肿、支气管哮喘、糖尿病、自身免疫性疾病、重度肝功能损害、终末期肾病、炎症急性期；（3）不能配合呼出气采集。
根据病理诊断结果，将入组的 147 例患者分为肺癌组和肺良性疾病组。肺癌组 104 例，其中男 36 例、女 68 例，年龄 27～49（43.54±5.73）岁。肺良性疾病组 43 例，其中男 23 例、女 20 例，年龄 22～49（42.49±6.83）岁。收集两组患者的临床资料（年龄、性别、吸烟史、饮酒史、病理类型、病理分期等）及呼出气。研究过程中出现以下情况需出组：（1）放弃穿刺或手术、未获得病理结果；（2）病理性质不明；（3）无论何种原因要求出组的患者。
1.3 呼出气采集流程
在穿刺或手术前 1 d，将患者安置于固定场所（通风室内），静坐 10 min 以上。用软管将采气筒、三通阀门和 Tedlar 袋连接，反复 3 次排除 Tedlar 袋内空气。患者通过吹嘴向气筒正常呼气，直到感觉到轻微的阻力。将吹气筒内的 150 mL 呼气末的气体推入 Tedlar 袋中，重复 3 次，共收集 450 mL 气体。患者被要求禁食至少 8 h，同时禁烟酒。在采集气体前不允许深吸气，采集时不允许鼻腔通气及二次呼吸。采集呼出气结束时，采集环境气体用于背景矫正及内源性 VOCs 的筛选。内源性 VOCs 具有正肺泡浓度梯度，即患者呼出气中浓度大于背景空气中浓度。装有呼出气的 Tedlar 袋马上放入有冰袋的保温箱中，温度计实时监测，确保在 2℃～8℃ 的环境中运输。若不能及时分析检测，应保存于–40℃ 冰箱中，检测要在一周内进行。
1.4 采用气相色谱质谱技术（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）对 VOCs 进行分析
固相微萃取：选择应用涂覆 50/30 μm 的混合型纤维头 DVB/CAR/PDMS 进行预富集。采用直接萃取法，萃取温度为 37℃，萃取时间为 30 min。
GC-MS：上述样品在进样口解析 5 min 后进入 GC-MS，使用仪器为 TRACE 1300 气相色谱联合 TSQ8000 三重四级杆质谱仪，采用色谱柱 DB-624（60 m×0.25 mm×1.4 μm）进行化合物分离。条件与参数：（1）流量控制，采用高纯氦气（99.9%）作为载气，流速控制在 1.0 mL/min；（2）分流比为 5∶1，质谱质量扫描范围为 35～200 m/z；（3）进样口、传输线、MS 离子源温度分别为 270℃、250℃、250℃；（4）柱温箱升温程序为：40℃ 保持 5 min，先以 10℃/min 的速度升至 160℃，再以 5℃/min 上升到 200℃，最后在 200℃ 保持 5 min。
1.5 统计学分析
计量资料以均数±标准差（
±s）表示。单因素分析时，符合正态分布的计量资料采用独立样本t检验，不符合的采用 Mann-Whitney U检验；性别、吸烟状态、饮酒状态和 VOCs 检出率的比较采用卡方检验，当不满足卡方检验条件时选用 Fisher 确切概率法。将P<0.10 的变量纳入条件二元 logistic 回归分析（为避免遗漏掉重要影响因素，将P值上限放宽至 0.10），并建立预测模型，计算模型的敏感度和特异度。构建预测模型的受试者工作特征（ROC）曲线，并计算 ROC 曲线下面积。所有分析使用 SPSS 24.0 软件进行，检验水准为α=0.05。
1.6 伦理审查
本研究已通过四川省肿瘤医院伦理委员会审批，伦理审批号：SCCHEC-02-2017-011。
2 结果
2.1 临床特征
肺癌组中浸润性腺癌 68 例（65.4%），原位腺癌 2 例（1.9%），微浸润腺癌 29 例（27.9%），鳞状细胞癌 2 例（1.9%），小细胞癌 1 例（1.0%），非小细胞癌 1 例（1.0%），不明类型癌 1 例（1.0%）。根据国际抗癌联盟（UICC）2018 年第 8 版 TNM 标准分期，0 期 2 例（1.9%），ⅠA1 期 39 例（37.5%），ⅠA2 期 16 例（15.4%），ⅠA3 期 4 例（3.9%），ⅠB 期 15 例（14.4%），ⅡA 期 1 例（1.0%），ⅡB 期 6 例（5.8%），ⅢA 期 7 例（6.7%），ⅢB 期 3 例（2.9%），ⅣA 期 4 例（3.9%），ⅣB 期 7 例（6.7%）。肺良性疾病组 43 例患者中，肺炎性假瘤 27 例（62.8%），肺良性肿瘤 8 例（18.6%），肺结核 8 例（18.6%）。
两组年龄（P=0.376）、饮酒史（P=0.304）差异均无统计学意义，而性别（P=0.034）、吸烟史（P=0.047）差异具有统计学意义；见表 1。
表1
两组患者的一般临床特征［
/例（%）］
2.2 肺癌组与肺良性疾病组的 VOCs 对比
按照设定的 GC-MS 条件对所有呼出气样本进行检测分析，在患者的呼出气中可检出 30～40 种 VOCs，排除外源性 VOCs、柱流失、环境物质干扰后，共有 16 种 VOCs 纳入研究，这些物质分别为异戊二烯、丙酮、环戊烷、3-甲基戊烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、乙苯、壬烷、邻二甲苯、β-蒎烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、二戊烯、丁二酸二甲酯、壬醛、萘、十三烷。对两组 VOCs 的检出率和含量进行对比，结果显示环戊烷（P=0.002）、3-甲基戊烷（P=0.043）、乙苯（P=0.009）三种物质的检出率差异具有统计学意义，其中肺癌组中 3-甲基戊烷和乙苯的检出率高于肺良性疾病组，环戊烷的检出率低于肺良性疾病组。肺癌组中环戊烷的含量低于肺良性疾病组，差异具有统计学意义（P=0.009）；见表 2。
表2
两组患者 VOCs 对比
2.3 预测模型的建立及评价
将性别、吸烟史、环戊烷、3-甲基戊烷、乙苯、N，N-二甲基甲酰胺、邻二甲苯纳入多因素条件回归分析，筛选出有意义的变量。性别、环戊烷、3-甲基戊烷、乙苯、N，N-二甲基甲酰胺作为变量纳入模型，建立二元 logistic 回归预测模型，预测模型回归方程：logit（p）=0.912+1.237X1–1.084X2–1.353X3+1.283X4–0.790X5，该模型具体参数见表 3。构建预测模型的 ROC 曲线，经计算 ROC 曲线下面积为 0.781；见图 1。以 0.7 作为分类分界值，利用该诊断模型预测患者的患病情况与金标准（病理诊断）对比，从而计算出该模型的敏感度为 80.8%，特异度为 60.5%。
图1
回归模型的 ROC 曲线
表3
logistic 回归分析方程中的变量
3 讨论
本研究得到了 3 种肺癌与肺良性疾病具有明显差异的 VOCs，即环戊烷、3-甲基戊烷、乙苯。该 3 种物质属于烷类及其化合物和苯类，与部分学者研究得到的化合物类型一致。Phillips 等[13-14]在多次研究中均发现与肺癌相关的 VOCs 主要是烷烃类及其衍生物和苯的衍生物。Gaspar 等[15]研究发现，乙苯可作为癌症标志物之一。虽然关于肺癌 VOCs 标志物的研究很多，但大家的结果差异却很大，重复性差。1985～2016 年报道的肺癌呼出气标志物 VOCs，其中重复 5 次的只有 2 种，为 2 丁酮和丙醇，出现 4 次的只有异戊二烯、苯乙烷和苯乙烯，出现 3 次的有 9 种[16]。目前认为肺癌最常见的生物标志物包括丙醇、异戊二烯、丙酮、戊烷、己醛、甲苯、苯和乙苯[6]。造成这种差异的原因很多，如采样技术、预浓缩技术、分析技术和肿瘤异质性等。总的来说，目前尚未有关于呼出气中 VOCs 采集、检测、分析、数据处理等标准化操作流程。此外，关于 VOCs 产生机制的代谢组学研究较少。目前认为烷烃类 VOCs 的产生可能与氧化应激反应密切相关，是由不饱和脂肪酸的过氧化损伤导致，而癌症的发生发展过程中往往伴随着异常的氧化应激反应[17]。芳香族化合物则多被认为是外源性污染物在机体内的长期积累再释放于呼吸道中，因其高度反应性且部分芳香族化合物本身为致癌物，所以其与癌症的发生发展密切相关[17-18]。遗憾的是目前的研究并不能明确 VOCs 的产生机制，因此需要后续更多的深入代谢机制的研究[19]。
随着影像技术的飞速发展，早期肺癌的诊断率也逐年增高[20]。但因为 LDCT 的假阳性率高[21-22]，越来越多的肺结节筛查出来，这些结节的良恶性判断直接影响后续干预。单纯影像学结合临床经验的判断是不够的，据报道在手术切除的肺小结节中良性结节的比例达到了 30%[23]。因此，目前呼出气诊断肺癌的重点应是对肺结节病变的良恶性鉴别上。Peled 等[24]在其研究中，纳入了 53 例肺癌患者和 19 例肺良性结节患者，发现 1-辛烯在两者间具有明显差异。本研究发现环戊烷、3-甲基戊烷、乙苯在肺癌与肺良性疾病间存在明显差异，其中环戊烷和乙苯可对肺结节良恶性的鉴别产生影响。本研究与 Peled 等[24]的研究有所不同，后者的研究对象平均年龄在 60 岁以上，且 50% 患者同时患有慢性阻塞性肺疾病。本研究纳入的患者年龄均为 50 岁以下，同时排除了慢性阻塞性肺疾病的干扰。后者研究中良性结节部分未经病理诊断，而本研究肺良性疾病组病例均经病理学诊断明确。因此，两项研究差别较大，参考价值小。
本研究所建立的预测模型虽可对<50 岁人群的肺结节的良恶性进行预测，但其敏感度、特异度和准确度均不高，预测能力有限。究其原因可能与以下因素有关：（1）总体样本量少，肺良性疾病例数少，两组间病例数不匹配，研究结果可能缺乏代表性；（2）纳入临床特征少，本研究仅纳入了性别、年龄、吸烟史及饮酒史；（3）肺癌患者中早期患者多，比例达到 73%，0 期与ⅠA 期患者的比例达到 39%。早期肺癌处于癌症发展的初步阶段，对局部微环境及机体代谢的影响尚小，可能对 VOCs 的影响尚不足以与肺良性结节区分；（4）虽然 GC-MS 是检测呼出气的经典方法，但是其检测种类和精度仍有限[25]，可能有更多的 VOCs 未被发现。
本研究的主要局限性为：仅完成了预测模型的初步建立，而未进行进一步的验证。后续需要增加更多的样本，特别是肺良性结节的样本量，对预测模型进行完善及验证。本研究结果提示在中青年肺结节的性质判别上，单纯依靠 VOCs 和部分临床特征可能达不到良好的效果。因此，在后续的研究中可将 VOCs、更多临床特征与影像学等相结合，以建立更强健的预测模型，或许可达到良好的预测效果。
利益冲突：无。
作者贡献：李强负责研究方案的构思和完整方案的审查；谢少华负责研究设计和实施；戴维负责研究设计和数据统计分析；刘明心、向润、杨晓樽、田博负责呼出气的采集、运输；谢天鹏、杨晓军、胡彬、庄翔负责患者的入组、临床资料的收集；刘明心、李雯雯负责呼出气体的分析；段忆翔负责研究方案的构思和呼出气分析的质量控制。
2018 年全球癌症统计数据显示，肺癌的发病率及死亡率居所有恶性肿瘤之首[1]。早期确诊肺癌患者的 5 年生存率可达到 70%～90%，而晚期确诊肺癌患者的 5 年生存率下降至 12%[2-3]。因此，肺癌的早期诊断对降低死亡率、提高生存率至关重要。目前临床常用的早期肺癌筛查方式为低剂量螺旋 CT（low-dose CT，LDCT），其提高了早期肺癌的诊断率并在一定程度上降低了肺癌的死亡率。在我国，LDCT 逐渐用于>50 岁高危人群的肺癌筛查[4]。随着 LDCT 的广泛使用，越来越多的肺结节在中青年人群中被发现。在肺结节的后续随访中，LDCT 可带来辐射伤害，反复 LDCT 检查可加重患者的心理负担，同时增加了患者及社会的经济负担。目前急需一种快速、灵敏、无创的方法辅助中青年人群肺结节的良恶性诊断。
人体内的代谢产物，如可挥发性有机物（volatile organic compounds，VOCs），通过血液到达肺部，在肺部进行物质交换并通过呼吸道排出体外，因此呼出气中 VOCs 可反映机体的疾病状态。呼出气中 VOCs 的检测及分析具有无创、快速、可重复等特点，有望成为辅助肺癌早期诊断的有力手段。呼出气中 VOCs 用于肺癌诊断相关研究已有 30 余年，大量研究结果均表明，VOCs 在肺癌的早期诊断上拥有巨大潜力[5]。但目前已发表的研究中肺癌组与对照组的年龄并不匹配，肺癌组患者的年龄通常明显大于对照组，且平均年龄多>50 岁[6]。同时，大多数研究的对照组选择为健康人群，少数研究将不同程度的慢性阻塞性肺疾病伴肺气肿[7-10]、慢性支气管炎[11]、肺炎[12]、肺结核[12]、哮喘[9, 12]患者同时作为对照组。目前尚缺乏针对中青年人群以及肺部有明确占位性病变的专门研究。本前瞻性研究将<50 岁且有肺结节的患者作为研究对象，旨在探讨 VOCs 对中青年人群肺结节良恶性的预测能力。
1 资料与方法
1.1 试剂和材料
试剂：异戊二烯、丙酮、环戊烷、3-甲基戊烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、乙苯、壬烷、邻二甲苯、β-蒎烯、二戊烯、丁二酸二甲酯、壬醛、萘、十三烷的标准样品购自上海阿拉丁试剂有限公司。研究中 VOCs 的定性采用标准样品标定结合 NIST08 数据库检索的方式进行。
材料与设备：500 mL-Tedlar 采气袋，购自大连德霖气体包装有限公司；Bio-VOC 采气筒购自英国 Markes 公司；固相微萃取手柄（57330-U）和 DVB/CAR/PDMS 萃取纤维针购于美国 Sigma-Aldrich 公司；TRACE 1300 气相色谱联合 TSQ8000 三重四级杆质谱仪为美国赛默飞世尔科技有限公司产品。
1.2 临床资料和分组
将 2019 年 8 月 1 日至 2020 年 1 月 15 日于四川省肿瘤医院胸外科中心就诊的、胸部 CT 显示有肺部占位性病变的患者作为研究对象。
入组标准：（1）年龄<50 岁，性别不限；（2）胸部 CT 测量肺部病变最大直径≤3 cm；（3）经临床评估高度怀疑为肺癌并拟行穿刺活检或手术切除；（4）获得知情同意。
排除标准：（1）既往有恶性肿瘤病史；（2）同时伴有以下系统性疾病：慢性支气管肺炎伴肺气肿、支气管哮喘、糖尿病、自身免疫性疾病、重度肝功能损害、终末期肾病、炎症急性期；（3）不能配合呼出气采集。
根据病理诊断结果，将入组的 147 例患者分为肺癌组和肺良性疾病组。肺癌组 104 例，其中男 36 例、女 68 例，年龄 27～49（43.54±5.73）岁。肺良性疾病组 43 例，其中男 23 例、女 20 例，年龄 22～49（42.49±6.83）岁。收集两组患者的临床资料（年龄、性别、吸烟史、饮酒史、病理类型、病理分期等）及呼出气。研究过程中出现以下情况需出组：（1）放弃穿刺或手术、未获得病理结果；（2）病理性质不明；（3）无论何种原因要求出组的患者。
1.3 呼出气采集流程
在穿刺或手术前 1 d，将患者安置于固定场所（通风室内），静坐 10 min 以上。用软管将采气筒、三通阀门和 Tedlar 袋连接，反复 3 次排除 Tedlar 袋内空气。患者通过吹嘴向气筒正常呼气，直到感觉到轻微的阻力。将吹气筒内的 150 mL 呼气末的气体推入 Tedlar 袋中，重复 3 次，共收集 450 mL 气体。患者被要求禁食至少 8 h，同时禁烟酒。在采集气体前不允许深吸气，采集时不允许鼻腔通气及二次呼吸。采集呼出气结束时，采集环境气体用于背景矫正及内源性 VOCs 的筛选。内源性 VOCs 具有正肺泡浓度梯度，即患者呼出气中浓度大于背景空气中浓度。装有呼出气的 Tedlar 袋马上放入有冰袋的保温箱中，温度计实时监测，确保在 2℃～8℃ 的环境中运输。若不能及时分析检测，应保存于–40℃ 冰箱中，检测要在一周内进行。
1.4 采用气相色谱质谱技术（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）对 VOCs 进行分析
固相微萃取：选择应用涂覆 50/30 μm 的混合型纤维头 DVB/CAR/PDMS 进行预富集。采用直接萃取法，萃取温度为 37℃，萃取时间为 30 min。
GC-MS：上述样品在进样口解析 5 min 后进入 GC-MS，使用仪器为 TRACE 1300 气相色谱联合 TSQ8000 三重四级杆质谱仪，采用色谱柱 DB-624（60 m×0.25 mm×1.4 μm）进行化合物分离。条件与参数：（1）流量控制，采用高纯氦气（99.9%）作为载气，流速控制在 1.0 mL/min；（2）分流比为 5∶1，质谱质量扫描范围为 35～200 m/z；（3）进样口、传输线、MS 离子源温度分别为 270℃、250℃、250℃；（4）柱温箱升温程序为：40℃ 保持 5 min，先以 10℃/min 的速度升至 160℃，再以 5℃/min 上升到 200℃，最后在 200℃ 保持 5 min。
1.5 统计学分析
计量资料以均数±标准差（±s）表示。单因素分析时，符合正态分布的计量资料采用独立样本t检验，不符合的采用 Mann-Whitney U检验；性别、吸烟状态、饮酒状态和 VOCs 检出率的比较采用卡方检验，当不满足卡方检验条件时选用 Fisher 确切概率法。将P<0.10 的变量纳入条件二元 logistic 回归分析（为避免遗漏掉重要影响因素，将P值上限放宽至 0.10），并建立预测模型，计算模型的敏感度和特异度。构建预测模型的受试者工作特征（ROC）曲线，并计算 ROC 曲线下面积。所有分析使用 SPSS 24.0 软件进行，检验水准为α=0.05。
1.6 伦理审查
本研究已通过四川省肿瘤医院伦理委员会审批，伦理审批号：SCCHEC-02-2017-011。
2 结果
2.1 临床特征
肺癌组中浸润性腺癌 68 例（65.4%），原位腺癌 2 例（1.9%），微浸润腺癌 29 例（27.9%），鳞状细胞癌 2 例（1.9%），小细胞癌 1 例（1.0%），非小细胞癌 1 例（1.0%），不明类型癌 1 例（1.0%）。根据国际抗癌联盟（UICC）2018 年第 8 版 TNM 标准分期，0 期 2 例（1.9%），ⅠA1 期 39 例（37.5%），ⅠA2 期 16 例（15.4%），ⅠA3 期 4 例（3.9%），ⅠB 期 15 例（14.4%），ⅡA 期 1 例（1.0%），ⅡB 期 6 例（5.8%），ⅢA 期 7 例（6.7%），ⅢB 期 3 例（2.9%），ⅣA 期 4 例（3.9%），ⅣB 期 7 例（6.7%）。肺良性疾病组 43 例患者中，肺炎性假瘤 27 例（62.8%），肺良性肿瘤 8 例（18.6%），肺结核 8 例（18.6%）。
两组年龄（P=0.376）、饮酒史（P=0.304）差异均无统计学意义，而性别（P=0.034）、吸烟史（P=0.047）差异具有统计学意义；见表 1。
表1
两组患者的一般临床特征［/例（%）］
2.2 肺癌组与肺良性疾病组的 VOCs 对比
按照设定的 GC-MS 条件对所有呼出气样本进行检测分析，在患者的呼出气中可检出 30～40 种 VOCs，排除外源性 VOCs、柱流失、环境物质干扰后，共有 16 种 VOCs 纳入研究，这些物质分别为异戊二烯、丙酮、环戊烷、3-甲基戊烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、乙苯、壬烷、邻二甲苯、β-蒎烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、二戊烯、丁二酸二甲酯、壬醛、萘、十三烷。对两组 VOCs 的检出率和含量进行对比，结果显示环戊烷（P=0.002）、3-甲基戊烷（P=0.043）、乙苯（P=0.009）三种物质的检出率差异具有统计学意义，其中肺癌组中 3-甲基戊烷和乙苯的检出率高于肺良性疾病组，环戊烷的检出率低于肺良性疾病组。肺癌组中环戊烷的含量低于肺良性疾病组，差异具有统计学意义（P=0.009）；见表 2。
表2
两组患者 VOCs 对比
2.3 预测模型的建立及评价
将性别、吸烟史、环戊烷、3-甲基戊烷、乙苯、N，N-二甲基甲酰胺、邻二甲苯纳入多因素条件回归分析，筛选出有意义的变量。性别、环戊烷、3-甲基戊烷、乙苯、N，N-二甲基甲酰胺作为变量纳入模型，建立二元 logistic 回归预测模型，预测模型回归方程：logit（p）=0.912+1.237X1–1.084X2–1.353X3+1.283X4–0.790X5，该模型具体参数见表 3。构建预测模型的 ROC 曲线，经计算 ROC 曲线下面积为 0.781；见图 1。以 0.7 作为分类分界值，利用该诊断模型预测患者的患病情况与金标准（病理诊断）对比，从而计算出该模型的敏感度为 80.8%，特异度为 60.5%。
图1
回归模型的 ROC 曲线
表3
logistic 回归分析方程中的变量
3 讨论
本研究得到了 3 种肺癌与肺良性疾病具有明显差异的 VOCs，即环戊烷、3-甲基戊烷、乙苯。该 3 种物质属于烷类及其化合物和苯类，与部分学者研究得到的化合物类型一致。Phillips 等[13-14]在多次研究中均发现与肺癌相关的 VOCs 主要是烷烃类及其衍生物和苯的衍生物。Gaspar 等[15]研究发现，乙苯可作为癌症标志物之一。虽然关于肺癌 VOCs 标志物的研究很多，但大家的结果差异却很大，重复性差。1985～2016 年报道的肺癌呼出气标志物 VOCs，其中重复 5 次的只有 2 种，为 2 丁酮和丙醇，出现 4 次的只有异戊二烯、苯乙烷和苯乙烯，出现 3 次的有 9 种[16]。目前认为肺癌最常见的生物标志物包括丙醇、异戊二烯、丙酮、戊烷、己醛、甲苯、苯和乙苯[6]。造成这种差异的原因很多，如采样技术、预浓缩技术、分析技术和肿瘤异质性等。总的来说，目前尚未有关于呼出气中 VOCs 采集、检测、分析、数据处理等标准化操作流程。此外，关于 VOCs 产生机制的代谢组学研究较少。目前认为烷烃类 VOCs 的产生可能与氧化应激反应密切相关，是由不饱和脂肪酸的过氧化损伤导致，而癌症的发生发展过程中往往伴随着异常的氧化应激反应[17]。芳香族化合物则多被认为是外源性污染物在机体内的长期积累再释放于呼吸道中，因其高度反应性且部分芳香族化合物本身为致癌物，所以其与癌症的发生发展密切相关[17-18]。遗憾的是目前的研究并不能明确 VOCs 的产生机制，因此需要后续更多的深入代谢机制的研究[19]。
随着影像技术的飞速发展，早期肺癌的诊断率也逐年增高[20]。但因为 LDCT 的假阳性率高[21-22]，越来越多的肺结节筛查出来，这些结节的良恶性判断直接影响后续干预。单纯影像学结合临床经验的判断是不够的，据报道在手术切除的肺小结节中良性结节的比例达到了 30%[23]。因此，目前呼出气诊断肺癌的重点应是对肺结节病变的良恶性鉴别上。Peled 等[24]在其研究中，纳入了 53 例肺癌患者和 19 例肺良性结节患者，发现 1-辛烯在两者间具有明显差异。本研究发现环戊烷、3-甲基戊烷、乙苯在肺癌与肺良性疾病间存在明显差异，其中环戊烷和乙苯可对肺结节良恶性的鉴别产生影响。本研究与 Peled 等[24]的研究有所不同，后者的研究对象平均年龄在 60 岁以上，且 50% 患者同时患有慢性阻塞性肺疾病。本研究纳入的患者年龄均为 50 岁以下，同时排除了慢性阻塞性肺疾病的干扰。后者研究中良性结节部分未经病理诊断，而本研究肺良性疾病组病例均经病理学诊断明确。因此，两项研究差别较大，参考价值小。
本研究所建立的预测模型虽可对<50 岁人群的肺结节的良恶性进行预测，但其敏感度、特异度和准确度均不高，预测能力有限。究其原因可能与以下因素有关：（1）总体样本量少，肺良性疾病例数少，两组间病例数不匹配，研究结果可能缺乏代表性；（2）纳入临床特征少，本研究仅纳入了性别、年龄、吸烟史及饮酒史；（3）肺癌患者中早期患者多，比例达到 73%，0 期与ⅠA 期患者的比例达到 39%。早期肺癌处于癌症发展的初步阶段，对局部微环境及机体代谢的影响尚小，可能对 VOCs 的影响尚不足以与肺良性结节区分；（4）虽然 GC-MS 是检测呼出气的经典方法，但是其检测种类和精度仍有限[25]，可能有更多的 VOCs 未被发现。
本研究的主要局限性为：仅完成了预测模型的初步建立，而未进行进一步的验证。后续需要增加更多的样本，特别是肺良性结节的样本量，对预测模型进行完善及验证。本研究结果提示在中青年肺结节的性质判别上，单纯依靠 VOCs 和部分临床特征可能达不到良好的效果。因此，在后续的研究中可将 VOCs、更多临床特征与影像学等相结合，以建立更强健的预测模型，或许可达到良好的预测效果。
利益冲突：无。
作者贡献：李强负责研究方案的构思和完整方案的审查；谢少华负责研究设计和实施；戴维负责研究设计和数据统计分析；刘明心、向润、杨晓樽、田博负责呼出气的采集、运输；谢天鹏、杨晓军、胡彬、庄翔负责患者的入组、临床资料的收集；刘明心、李雯雯负责呼出气体的分析；段忆翔负责研究方案的构思和呼出气分析的质量控制。
