引用本文： 陈宏, 陈苏伟, 王盛宇, 李岩, 孟旭. N-甲基-D-天冬氨酸受体介导的脊髓缺血-再灌注保护作用的研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2020, 27(12): 1460-1465. doi: 10.7507/1007-4848.202002084 复制
脊髓缺血导致的不同程度的瘫痪是胸主动脉瘤手术的严重并发症[1]。虽然截瘫的发生率为 2.5%～8%，但脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）仍然是主动脉瘤术后的严重并发症[2]。最近研究[3-6]表明，兴奋性氨基酸（excitatory amino acid，EAA）的离子型受体在 EAA 所致的神经毒性作用中有极其重要的意义，尤其是 N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体与脊髓缺血-再灌注损伤关系密切。谷氨酸在脊髓中被认为是兴奋性神经递质，它通过过度激活 NMDA 受体，诱导大量 Ca2+内流损伤神经细胞，导致神经细胞死亡[7]。
动物实验不断发现一些药物可以阻断脑脊髓缺血缺氧后的损伤级联反应，减轻脑损伤。然而目前尚未找到一种经临床证明安全、有效的神经保护剂。K-1024 作为 EAA-NMDA 受体拮抗剂，是目前医学研究的热点，但其用于缺血-再灌注脊髓保护治疗的报道较少。本实验拟通过构建大鼠脊髓缺血-再灌注模型，探讨 K-1024 对缺血-再灌注大鼠行为学、组织病理学的保护作用，及对谷氨酸、一氧化氮合酶（NOS）表达的影响，评价其对缺血-再灌注脊髓的保护作用并探讨其机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组与脊髓缺血-再灌注模型的建立
实验分组：健康成年 SD 大鼠 42 只，由北京安贞医院实验动物中心提供，体重 350～375 g，雌雄不拘，随机分为 4 组。非阻断组（n=6）：球囊导管置入胸主动脉，但不充填球囊；生理盐水组（n=12）：生理盐水 2 mL 在降主动脉阻断前 30 min 腹腔注射；K-1024 保护组（n=12）：K-1024（25 mg/kg，上海第一制药厂）在降主动脉阻断前 30 min 腹腔注射；尼莫地平组（n=12）：尼莫地平（0.5 mg/kg，德国 Bayer 公司）在降主动脉阻断前 30 min 腹腔注射。
诱导脊髓缺血：10% 水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，聚乙烯导管（PE-50）插入尾动脉监测动脉血压，注射肝素。分离左股动脉，2-F# Fogarty（Terumo 2.5/3.0）导管放入胸降主动脉，导管顶端到左锁骨下动脉水平（距导管插入点 10.5～11 cm）。聚乙烯导管（PE-50）插入左颈动脉 1 cm，外接储血袋（37.5℃），用 4 U/mL 的肝素生理盐水充填。调整环路储血器高度以控制近端主动脉压力（proximal artery blood pressure，PAP），主动脉阻断期间，阻断点近端的血压控制在 40 mm Hg。插管放置完成，尾动脉注射肝素 200 U。球囊导管用 0.05 mL 生理盐水充入，血液引流入外接储血袋。被阻断的主动脉下方搏动消失、压力降低证明阻断完全。缺血后，球囊导管排气并拔除，血液 60 s 回灌，硫酸鱼精蛋白（4 mg）皮下注射。灌流完成后，拔除所有插管，缝合切口，复苏动物。
1.2 行为学评价
在 PAP 40 mm Hg 条件下，将实验动物分为 4 组，每组 6 只。先阻断 10 min，再恢复灌注。分别于再灌注 1、2、4、8 h，通过评价下肢行走及步态来量化运动功能的恢复程度。具体的评价方法如下：下肢行走按下列分级：0=正常；1=扁平足，共济失调；2=使用关节行走；3=下肢有活动，但不能通过关节行走；4=无运动，拖动下肢。抬放反射评价通过外展后爪背侧诱发相应的上举和回放反应，分级为 0=正常，1=弱，2=无。记录每一组的运动缺失，最后记录下肢行走+抬放反射的总分，最高得分为 6 分。
1.3 组织病理学评价
大鼠背部正中切口，快速打开椎管，剖取 L3～L5 段脊髓，迅速放入 250 mL 4% 多聚甲醛（含 0.1% DEPC）固定液中，固定 6 h，入 25% 庶糖（含 0.1% DEPC）使组织块下沉，然后包埋于石蜡中。每只动物 L3、L4、L5 节段取得 5 张典型性切片，切片厚度 3 μm，行苏木精-伊红（HE）染色。灰质损害程度（坏死或暗神经元）分别从三个区判断：一区，损害涉及Ⅰ～Ⅵ层面；二区，损害涉及Ⅶ和Ⅹ层面；三区，损害涉及Ⅷ和Ⅸ层面。
1.4 脊髓组织中谷氨酸含量测定
高效液相色谱法：用 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.8）在冰上制备脊髓组织匀浆，取上清液 20 μL 加 0.4 mol/L 过氯酸（PCA）180 μL，混匀，37℃，12 000 r/min 离心 45 min。取上清液 10 μL 加内标物（30 pmol/L 高丝氨酸）10 μL，再加邻苯二甲醛（OPA）100 μL，2 min 后即进样 10 μL 按色谱条件进行梯度洗脱。
1.5 神经元型 NOS（nNOS）检测
免疫组织化学染色（ABC 法）：1∶50 正常羊血清在室温下孵育 30 min，滴加兔抗 nNOS 抗体（工作浓度为 1∶80，Sigma 公司），4℃，孵育 72 h；0.01 mol/L PBS（pH 7.4）充分冲洗（3 min×3）后，加羊抗兔抗体（工作浓度为 1∶100，博士德公司），在 37℃ 下温育 30 min；0.01 mol/L PBS（pH 7.4）充分冲洗（3 min×3）后，滴加 ABC 复合物（工作浓度为 1∶100，博士德公司），37℃ 温育 30 min；0.01 mol/L PBS（pH 7.4）充分冲洗（3 min×3）后，DAB-H2O2 呈色，室温，5～10 min，常规脱水，透明，中性树胶封片。以 PBS 代替一抗作为空白对照。结果以普通光学显微镜检查。
1.6 图像分析
用显微图像分析仪（TJTY-400 真彩色细胞图像分析仪）对切片进行图像分析，所有切片均在同一放大倍数（×10）及同一光强度下分析，每例动物测 3 张切片，取平均值。采集阳性反应细胞数，视场范围 261 632.00 μm2。
1.7 统计学分析
所有实验数据用 SPSS 25.0 软件进行分析处理，结果以均数±标准差（
±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。
1.8 伦理审查
本研究已通过北京安贞医院医学伦理委员会审批，批准号：2016044X。
2 结果
2.1 行为学评价
非阻断组：再灌注 8 h 后，所有大鼠未发现神经功能不全表现。
生理盐水组：5 只大鼠出现急性硬瘫，再灌注 8 h 后无任何改变。1 只大鼠再灌注 2 h 后运动功能有一个级别的恢复，但是再灌注 8 h 行为学评分又增加到 6 分。
K-1024 组：4 只大鼠再灌注 1 h 评分为 4 分。另外 2 只大鼠再灌注 1 h 评分为 2 分，再灌注 2 h 后仍为 2 分。但所有 6 只大鼠再灌注 8 h 后轻微肌无力，运动损伤评分保持在 2 分。且均能行走和抬步，行为学评分与对照组最接近。
尼莫地平组：所有 6 只大鼠在再灌注 2 h 后显示重度的运动损害硬瘫，其中 2 只大鼠再灌注 4 h 后行为学评分恢复到 5 分（不能使用关节行走）。再灌注 8 h 后，6 只大鼠中，2 只大鼠无任何变化，2 只大鼠行为学评分恢复到 5 分，2 只大鼠恢复到中等程度的运动损害（共济失调但使用关节行走）；见图 1。
图1
不同药物对缺血-再灌注大鼠脊髓行为学的影响
2.2 组织病理学改变
非阻断组：运动和感觉功能完全恢复，L2～L5 脊髓节段切片无组织病理学改变。小的和中等大小的联络神经元、大的 α 运动神经元均无坏死表现，神经纤维也无病理改变。
生理盐水组：全部动物硬瘫，组织病理学改变在脊髓 L2～L5 节段Ⅲ～Ⅶ层面灰质出现特征性的广泛坏死和不规则空洞。但是，位于灰质周边部位的层面，如Ⅰ～Ⅱ层、Ⅹ层、Ⅷ～Ⅸ层显示接近正常结构。与硬瘫的出现相符合，α 运动神经元及核结构正常。
尼莫地平组：与生理盐水组基本相似。
K-1024 组：在神经功能恢复的动物中，偶然发现神经元“变暗”或“皱缩”的降解表现，这些神经元典型地分部在中内区（第Ⅶ层）的中部和后角的中后部。但是，大多数联络神经元和 α 运动神经元未发现改变；见图 2。
图2
不同组别大鼠脊髓 HE 染色（×10）
a：非阻断组，完整脊髓结构；b：生理盐水组，常温缺血 10 min，黑色箭头显示脊髓灰质Ⅲ～Ⅶ层坏死，红色箭头显示 α 运动神经元正常；c：尼莫地平组，黑色箭头显示神经元“皱缩”，红色箭头显示灰质空泡形成；d：K-1024 组，脊髓结构基本完整
2.3 脊髓组织中谷氨酸含量
缺血 10 min，生理盐水组、尼莫地平组和 K-1024 组之间谷氨酸含量差异无统计学意义（F=0.324，P=0.731），且生理盐水组的神经递质谷氨酸水平较非阻断组高出 3 倍。进一步多重比较发现，K-1024 组谷氨酸含量与生理盐水组比较差异无统计学意义（P=0.801）；尼莫地平组谷氨酸含量略低于生理盐水组，但差异无统计学意义（P=0.450）；K-1024 组与尼莫地平组差异也无统计学意义（P=0.609）。
再灌注 8 h 后，三组之间差异无统计学意义（F=1.095，P=0.375）。进一步多重比较发现，各组谷氨酸含量与非阻断组处于相似的水平。K-1024 组谷氨酸含量虽略低于与生理盐水组，但差异无统计学意义（P=0.789）；尼莫地平组与生理盐水组的谷氨酸水平差异无统计学意义（P=0.196）；K-1024 组与尼莫地平组差异也无统计学意义（P=0.291）；见表 1。
表1
药物对缺血-再灌注大鼠脊髓谷氨酸含量的影响（μmol/L，
）
2.4 脊髓组织内 nNOS 表达
缺血 10 min，三组 nNOS 表达差异有统计学意义（F=40.597，P<0.01）。进一步多重比较发现，K-1024 组和尼莫地平组 nNOS 阳性反应细胞数与生理盐水组比较均明显下调（P<0.01）；K-1024 组与尼莫地平组差异无统计学意义（P=0.283）。
再灌注 8 h，三组 nNOS 表达差异有统计学意义（F=3.409，P=0.046）。进一步多重比较发现，K-1024 组 nNOS 阳性反应细胞数与生理盐水组比较明显上调，差异有统计学意义（P<0.05），尼莫地平组与生理盐水组差异无统计学意义（P=0.096），K-1024 组与尼莫地平组之间差异也无统计学意义（P=0.441）；见表 2、图 3。
表2
药物对缺血-再灌注大鼠脊髓 nNOS 阳性反应细胞数的影响（个/261 632.00 μm2，
）
图3
不同组别大鼠 nNOS 免疫组织化学染色（×10）
a：非阻断组；b：生理盐水组缺血 10 min；c：生理盐水组缺血-再灌注 8 h；d：K-1024 组缺血 10 min；e：K-1024 组缺血-再灌注 8 h；f：尼莫地平组缺血 10 min；g：尼莫地平组缺血-再灌注 8 h
3 讨论
随着 NMDA 受体介导的兴奋性毒性在神经元损伤中的作用逐渐被认识，NMDA 受体拮抗剂为缺血性脑、脊髓损伤的预防和治疗带来新的希望[8-9]。在动物实验中不断发现 NMDA 受体拮抗剂可以阻断脑、脊髓缺血缺氧后的损伤级联反应，减轻脑、脊髓损伤。Li 等[10]发现 NMDA 受体拮抗剂人参皂甙具有抗神经元损伤的作用；de Miranda 等[11]证实全身予以 NMDA 受体拮抗剂 MK-801 能缩小脊髓梗塞区，减少神经元损伤，有明显的保护作用。目前，K-1024 是非竞争性 NMDA 受体拮抗剂，已用于临床静脉麻醉，并在脑缺血保护中已有报道，但在主动脉手术围术期脊髓缺血中的保护作用报道较少[12-14]。
本研究应用球囊导管阻断的方式构建大鼠脊髓缺血模型，模拟胸腹主动脉瘤切除的围术期条件，以 K-1024 作为实验组，同时与尼莫地平相比较，探讨脊髓缺血和再灌注损伤的机制，并论证 K-1024 作为非竞争性 NMDA 受体拮抗剂在主动脉手术围术期脊髓保护中的作用。本实验发现，缺血-再灌注脊髓的神经功能损伤与组织病理学改变相关，主动脉阻断 10 min 后，生理盐水组和尼莫地平组中的急性期大鼠均出现硬瘫，在 8 h 恢复期，仍不能使用关节行走，或出现严重共济失调。K-1024 组在急性期表现为肌无力，8 h 恢复期所有动物都能行走和抬步。尼莫地平组和生理盐水组组织病理学结果相似，在脊髓 L2～L5 节段Ⅲ～Ⅶ层面灰质出现特征性的广泛坏死和不规则空洞。但是，灰质周边部位的层面（Ⅰ～Ⅱ层、Ⅹ层、Ⅷ～Ⅸ层）显示接近正常结构，α 运动神经元及核也显示正常结构，与硬瘫的出现相符合。而 K-1024 组虽偶有神经元“变暗”或“皱缩”的降解表现，但大多数联络神经元和 α 运动神经元未见改变。这提示 K-1024 对缺血脊髓功能的恢复和脊髓组织结构具有保护作用。
谷氨酸在脊髓中被认为是最主要的兴奋性氨基酸，其在脊髓缺血时的神经毒性作用已引起人们的广泛注意。Coyle 等[15]提出的谷氨酸-钙超载学说是脑、脊髓缺血损伤的重要病理机制之一。在生理和病理情况下，谷氨酸将通过以下几种方式释放：Ca2+依赖性的释放、水肿引起的释放、谷氨酸转运系统调节的重吸收及释放[16]。而目前认为谷氨酸转运体的表达和功能变化是脊髓缺血时兴奋性谷氨酸异常释放的主要机制[17]。本研究发现缺血 10 min 时神经递质谷氨酸水平较基础值高出 3 倍，再灌注 8 h 回到基础水平，但各组间谷氨酸含量无显著性差异，这一结果也说明谷氨酸的释放途径复杂[18]。而 NMDA 受体途径并不是通过改变谷氨酸释放水平而达到脊髓保护的作用。
脊髓缺血诱发的神经毒性作用与 NMDA 受体有极大的关系。本实验中 K-1024 和尼莫地平都能降低缺血 10 min 时 nNOS 的表达。但再灌注 8 h 后，只有 K-1024 维持了更好的脊髓生物学活性。这可能是由于二者虽能阻断 Ca2+内流，但其作用途径不同。尼莫地平通过阻断 L-型 Ca2+通道阻断 Ca2+内流，但不能抑制 NMDA 受体介导的 Ca2+内流，缺乏特异性，同时对全身影响大。而 K-1024 阻断 NMDA 受体过度激活导致的 Ca2+内流避免细胞内 Ca2+超载，从而减少 nNOS 的激活和 NO 的生成，以及 O2－、ONOO－、OH－等氧自由基的产生，进而减少线粒体的损伤[19-20]。
综上所述，K-1024 对脊髓缺血-再灌注损伤具有一定的保护作用。本研究为临床应用 K-1024 治疗主动脉围术期缺血性脊髓损伤提供了理论依据。以期未来 K-1024 可用于临床主动脉手术围术期的脊髓保护。
利益冲突：无。
作者贡献：陈宏负责论文设计、数据整理与分析、论文初稿撰写；陈苏伟负责数据整理与分析；王盛宇、李岩负责数据整理；孟旭负责论文审阅与修改。
脊髓缺血导致的不同程度的瘫痪是胸主动脉瘤手术的严重并发症[1]。虽然截瘫的发生率为 2.5%～8%，但脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）仍然是主动脉瘤术后的严重并发症[2]。最近研究[3-6]表明，兴奋性氨基酸（excitatory amino acid，EAA）的离子型受体在 EAA 所致的神经毒性作用中有极其重要的意义，尤其是 N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体与脊髓缺血-再灌注损伤关系密切。谷氨酸在脊髓中被认为是兴奋性神经递质，它通过过度激活 NMDA 受体，诱导大量 Ca2+内流损伤神经细胞，导致神经细胞死亡[7]。
动物实验不断发现一些药物可以阻断脑脊髓缺血缺氧后的损伤级联反应，减轻脑损伤。然而目前尚未找到一种经临床证明安全、有效的神经保护剂。K-1024 作为 EAA-NMDA 受体拮抗剂，是目前医学研究的热点，但其用于缺血-再灌注脊髓保护治疗的报道较少。本实验拟通过构建大鼠脊髓缺血-再灌注模型，探讨 K-1024 对缺血-再灌注大鼠行为学、组织病理学的保护作用，及对谷氨酸、一氧化氮合酶（NOS）表达的影响，评价其对缺血-再灌注脊髓的保护作用并探讨其机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组与脊髓缺血-再灌注模型的建立
实验分组：健康成年 SD 大鼠 42 只，由北京安贞医院实验动物中心提供，体重 350～375 g，雌雄不拘，随机分为 4 组。非阻断组（n=6）：球囊导管置入胸主动脉，但不充填球囊；生理盐水组（n=12）：生理盐水 2 mL 在降主动脉阻断前 30 min 腹腔注射；K-1024 保护组（n=12）：K-1024（25 mg/kg，上海第一制药厂）在降主动脉阻断前 30 min 腹腔注射；尼莫地平组（n=12）：尼莫地平（0.5 mg/kg，德国 Bayer 公司）在降主动脉阻断前 30 min 腹腔注射。
诱导脊髓缺血：10% 水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，聚乙烯导管（PE-50）插入尾动脉监测动脉血压，注射肝素。分离左股动脉，2-F# Fogarty（Terumo 2.5/3.0）导管放入胸降主动脉，导管顶端到左锁骨下动脉水平（距导管插入点 10.5～11 cm）。聚乙烯导管（PE-50）插入左颈动脉 1 cm，外接储血袋（37.5℃），用 4 U/mL 的肝素生理盐水充填。调整环路储血器高度以控制近端主动脉压力（proximal artery blood pressure，PAP），主动脉阻断期间，阻断点近端的血压控制在 40 mm Hg。插管放置完成，尾动脉注射肝素 200 U。球囊导管用 0.05 mL 生理盐水充入，血液引流入外接储血袋。被阻断的主动脉下方搏动消失、压力降低证明阻断完全。缺血后，球囊导管排气并拔除，血液 60 s 回灌，硫酸鱼精蛋白（4 mg）皮下注射。灌流完成后，拔除所有插管，缝合切口，复苏动物。
1.2 行为学评价
在 PAP 40 mm Hg 条件下，将实验动物分为 4 组，每组 6 只。先阻断 10 min，再恢复灌注。分别于再灌注 1、2、4、8 h，通过评价下肢行走及步态来量化运动功能的恢复程度。具体的评价方法如下：下肢行走按下列分级：0=正常；1=扁平足，共济失调；2=使用关节行走；3=下肢有活动，但不能通过关节行走；4=无运动，拖动下肢。抬放反射评价通过外展后爪背侧诱发相应的上举和回放反应，分级为 0=正常，1=弱，2=无。记录每一组的运动缺失，最后记录下肢行走+抬放反射的总分，最高得分为 6 分。
1.3 组织病理学评价
大鼠背部正中切口，快速打开椎管，剖取 L3～L5 段脊髓，迅速放入 250 mL 4% 多聚甲醛（含 0.1% DEPC）固定液中，固定 6 h，入 25% 庶糖（含 0.1% DEPC）使组织块下沉，然后包埋于石蜡中。每只动物 L3、L4、L5 节段取得 5 张典型性切片，切片厚度 3 μm，行苏木精-伊红（HE）染色。灰质损害程度（坏死或暗神经元）分别从三个区判断：一区，损害涉及Ⅰ～Ⅵ层面；二区，损害涉及Ⅶ和Ⅹ层面；三区，损害涉及Ⅷ和Ⅸ层面。
1.4 脊髓组织中谷氨酸含量测定
高效液相色谱法：用 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.8）在冰上制备脊髓组织匀浆，取上清液 20 μL 加 0.4 mol/L 过氯酸（PCA）180 μL，混匀，37℃，12 000 r/min 离心 45 min。取上清液 10 μL 加内标物（30 pmol/L 高丝氨酸）10 μL，再加邻苯二甲醛（OPA）100 μL，2 min 后即进样 10 μL 按色谱条件进行梯度洗脱。
1.5 神经元型 NOS（nNOS）检测
免疫组织化学染色（ABC 法）：1∶50 正常羊血清在室温下孵育 30 min，滴加兔抗 nNOS 抗体（工作浓度为 1∶80，Sigma 公司），4℃，孵育 72 h；0.01 mol/L PBS（pH 7.4）充分冲洗（3 min×3）后，加羊抗兔抗体（工作浓度为 1∶100，博士德公司），在 37℃ 下温育 30 min；0.01 mol/L PBS（pH 7.4）充分冲洗（3 min×3）后，滴加 ABC 复合物（工作浓度为 1∶100，博士德公司），37℃ 温育 30 min；0.01 mol/L PBS（pH 7.4）充分冲洗（3 min×3）后，DAB-H2O2 呈色，室温，5～10 min，常规脱水，透明，中性树胶封片。以 PBS 代替一抗作为空白对照。结果以普通光学显微镜检查。
1.6 图像分析
用显微图像分析仪（TJTY-400 真彩色细胞图像分析仪）对切片进行图像分析，所有切片均在同一放大倍数（×10）及同一光强度下分析，每例动物测 3 张切片，取平均值。采集阳性反应细胞数，视场范围 261 632.00 μm2。
1.7 统计学分析
所有实验数据用 SPSS 25.0 软件进行分析处理，结果以均数±标准差（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。
1.8 伦理审查
本研究已通过北京安贞医院医学伦理委员会审批，批准号：2016044X。
2 结果
2.1 行为学评价
非阻断组：再灌注 8 h 后，所有大鼠未发现神经功能不全表现。
生理盐水组：5 只大鼠出现急性硬瘫，再灌注 8 h 后无任何改变。1 只大鼠再灌注 2 h 后运动功能有一个级别的恢复，但是再灌注 8 h 行为学评分又增加到 6 分。
K-1024 组：4 只大鼠再灌注 1 h 评分为 4 分。另外 2 只大鼠再灌注 1 h 评分为 2 分，再灌注 2 h 后仍为 2 分。但所有 6 只大鼠再灌注 8 h 后轻微肌无力，运动损伤评分保持在 2 分。且均能行走和抬步，行为学评分与对照组最接近。
尼莫地平组：所有 6 只大鼠在再灌注 2 h 后显示重度的运动损害硬瘫，其中 2 只大鼠再灌注 4 h 后行为学评分恢复到 5 分（不能使用关节行走）。再灌注 8 h 后，6 只大鼠中，2 只大鼠无任何变化，2 只大鼠行为学评分恢复到 5 分，2 只大鼠恢复到中等程度的运动损害（共济失调但使用关节行走）；见图 1。
图1
不同药物对缺血-再灌注大鼠脊髓行为学的影响
2.2 组织病理学改变
非阻断组：运动和感觉功能完全恢复，L2～L5 脊髓节段切片无组织病理学改变。小的和中等大小的联络神经元、大的 α 运动神经元均无坏死表现，神经纤维也无病理改变。
生理盐水组：全部动物硬瘫，组织病理学改变在脊髓 L2～L5 节段Ⅲ～Ⅶ层面灰质出现特征性的广泛坏死和不规则空洞。但是，位于灰质周边部位的层面，如Ⅰ～Ⅱ层、Ⅹ层、Ⅷ～Ⅸ层显示接近正常结构。与硬瘫的出现相符合，α 运动神经元及核结构正常。
尼莫地平组：与生理盐水组基本相似。
K-1024 组：在神经功能恢复的动物中，偶然发现神经元“变暗”或“皱缩”的降解表现，这些神经元典型地分部在中内区（第Ⅶ层）的中部和后角的中后部。但是，大多数联络神经元和 α 运动神经元未发现改变；见图 2。
图2
不同组别大鼠脊髓 HE 染色（×10）
a：非阻断组，完整脊髓结构；b：生理盐水组，常温缺血 10 min，黑色箭头显示脊髓灰质Ⅲ～Ⅶ层坏死，红色箭头显示 α 运动神经元正常；c：尼莫地平组，黑色箭头显示神经元“皱缩”，红色箭头显示灰质空泡形成；d：K-1024 组，脊髓结构基本完整
2.3 脊髓组织中谷氨酸含量
缺血 10 min，生理盐水组、尼莫地平组和 K-1024 组之间谷氨酸含量差异无统计学意义（F=0.324，P=0.731），且生理盐水组的神经递质谷氨酸水平较非阻断组高出 3 倍。进一步多重比较发现，K-1024 组谷氨酸含量与生理盐水组比较差异无统计学意义（P=0.801）；尼莫地平组谷氨酸含量略低于生理盐水组，但差异无统计学意义（P=0.450）；K-1024 组与尼莫地平组差异也无统计学意义（P=0.609）。
再灌注 8 h 后，三组之间差异无统计学意义（F=1.095，P=0.375）。进一步多重比较发现，各组谷氨酸含量与非阻断组处于相似的水平。K-1024 组谷氨酸含量虽略低于与生理盐水组，但差异无统计学意义（P=0.789）；尼莫地平组与生理盐水组的谷氨酸水平差异无统计学意义（P=0.196）；K-1024 组与尼莫地平组差异也无统计学意义（P=0.291）；见表 1。
表1
药物对缺血-再灌注大鼠脊髓谷氨酸含量的影响（μmol/L，）
2.4 脊髓组织内 nNOS 表达
缺血 10 min，三组 nNOS 表达差异有统计学意义（F=40.597，P<0.01）。进一步多重比较发现，K-1024 组和尼莫地平组 nNOS 阳性反应细胞数与生理盐水组比较均明显下调（P<0.01）；K-1024 组与尼莫地平组差异无统计学意义（P=0.283）。
再灌注 8 h，三组 nNOS 表达差异有统计学意义（F=3.409，P=0.046）。进一步多重比较发现，K-1024 组 nNOS 阳性反应细胞数与生理盐水组比较明显上调，差异有统计学意义（P<0.05），尼莫地平组与生理盐水组差异无统计学意义（P=0.096），K-1024 组与尼莫地平组之间差异也无统计学意义（P=0.441）；见表 2、图 3。
表2
药物对缺血-再灌注大鼠脊髓 nNOS 阳性反应细胞数的影响（个/261 632.00 μm2，）
图3
不同组别大鼠 nNOS 免疫组织化学染色（×10）
a：非阻断组；b：生理盐水组缺血 10 min；c：生理盐水组缺血-再灌注 8 h；d：K-1024 组缺血 10 min；e：K-1024 组缺血-再灌注 8 h；f：尼莫地平组缺血 10 min；g：尼莫地平组缺血-再灌注 8 h
3 讨论
随着 NMDA 受体介导的兴奋性毒性在神经元损伤中的作用逐渐被认识，NMDA 受体拮抗剂为缺血性脑、脊髓损伤的预防和治疗带来新的希望[8-9]。在动物实验中不断发现 NMDA 受体拮抗剂可以阻断脑、脊髓缺血缺氧后的损伤级联反应，减轻脑、脊髓损伤。Li 等[10]发现 NMDA 受体拮抗剂人参皂甙具有抗神经元损伤的作用；de Miranda 等[11]证实全身予以 NMDA 受体拮抗剂 MK-801 能缩小脊髓梗塞区，减少神经元损伤，有明显的保护作用。目前，K-1024 是非竞争性 NMDA 受体拮抗剂，已用于临床静脉麻醉，并在脑缺血保护中已有报道，但在主动脉手术围术期脊髓缺血中的保护作用报道较少[12-14]。
本研究应用球囊导管阻断的方式构建大鼠脊髓缺血模型，模拟胸腹主动脉瘤切除的围术期条件，以 K-1024 作为实验组，同时与尼莫地平相比较，探讨脊髓缺血和再灌注损伤的机制，并论证 K-1024 作为非竞争性 NMDA 受体拮抗剂在主动脉手术围术期脊髓保护中的作用。本实验发现，缺血-再灌注脊髓的神经功能损伤与组织病理学改变相关，主动脉阻断 10 min 后，生理盐水组和尼莫地平组中的急性期大鼠均出现硬瘫，在 8 h 恢复期，仍不能使用关节行走，或出现严重共济失调。K-1024 组在急性期表现为肌无力，8 h 恢复期所有动物都能行走和抬步。尼莫地平组和生理盐水组组织病理学结果相似，在脊髓 L2～L5 节段Ⅲ～Ⅶ层面灰质出现特征性的广泛坏死和不规则空洞。但是，灰质周边部位的层面（Ⅰ～Ⅱ层、Ⅹ层、Ⅷ～Ⅸ层）显示接近正常结构，α 运动神经元及核也显示正常结构，与硬瘫的出现相符合。而 K-1024 组虽偶有神经元“变暗”或“皱缩”的降解表现，但大多数联络神经元和 α 运动神经元未见改变。这提示 K-1024 对缺血脊髓功能的恢复和脊髓组织结构具有保护作用。
谷氨酸在脊髓中被认为是最主要的兴奋性氨基酸，其在脊髓缺血时的神经毒性作用已引起人们的广泛注意。Coyle 等[15]提出的谷氨酸-钙超载学说是脑、脊髓缺血损伤的重要病理机制之一。在生理和病理情况下，谷氨酸将通过以下几种方式释放：Ca2+依赖性的释放、水肿引起的释放、谷氨酸转运系统调节的重吸收及释放[16]。而目前认为谷氨酸转运体的表达和功能变化是脊髓缺血时兴奋性谷氨酸异常释放的主要机制[17]。本研究发现缺血 10 min 时神经递质谷氨酸水平较基础值高出 3 倍，再灌注 8 h 回到基础水平，但各组间谷氨酸含量无显著性差异，这一结果也说明谷氨酸的释放途径复杂[18]。而 NMDA 受体途径并不是通过改变谷氨酸释放水平而达到脊髓保护的作用。
脊髓缺血诱发的神经毒性作用与 NMDA 受体有极大的关系。本实验中 K-1024 和尼莫地平都能降低缺血 10 min 时 nNOS 的表达。但再灌注 8 h 后，只有 K-1024 维持了更好的脊髓生物学活性。这可能是由于二者虽能阻断 Ca2+内流，但其作用途径不同。尼莫地平通过阻断 L-型 Ca2+通道阻断 Ca2+内流，但不能抑制 NMDA 受体介导的 Ca2+内流，缺乏特异性，同时对全身影响大。而 K-1024 阻断 NMDA 受体过度激活导致的 Ca2+内流避免细胞内 Ca2+超载，从而减少 nNOS 的激活和 NO 的生成，以及 O2－、ONOO－、OH－等氧自由基的产生，进而减少线粒体的损伤[19-20]。
综上所述，K-1024 对脊髓缺血-再灌注损伤具有一定的保护作用。本研究为临床应用 K-1024 治疗主动脉围术期缺血性脊髓损伤提供了理论依据。以期未来 K-1024 可用于临床主动脉手术围术期的脊髓保护。
利益冲突：无。
作者贡献：陈宏负责论文设计、数据整理与分析、论文初稿撰写；陈苏伟负责数据整理与分析；王盛宇、李岩负责数据整理；孟旭负责论文审阅与修改。
