引用本文： 李斌, 宋铁牛, 蒋鹏, 杨建宝, 朱多杰, 蔺军平, 冯海明, 敬涛. DDX46 基因对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长的影响. 中国胸心血管外科临床杂志, 2019, 26(2): 169-174. doi: 10.7507/1007-4848.201807008 复制
目前大多数抗肿瘤药物作用机理是靶向肿瘤细胞的 DNA 或蛋白质，而新近 Lee 等[1]研究发现：DNA 和蛋白质之间的中介物质 mRNA 可能是全新的靶点。DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成员，在 mRNA 前体剪接和核糖体组装中发挥核心作用[2-3]。DDX46 在多种人类恶性肿瘤组织如结肠腺癌[4]、骨肉瘤[5]、膀胱癌[6]等高表达，提示其可能是一个新的癌基因，参与肿瘤的发生和发展。我们前期研究发现 DDX46 在食管鳞癌组织中异常高表达，利用 shRNA 抑制 DDX46 表达能降低食管鳞癌 Eca-109 细胞增殖，并诱导细胞凋亡[7-8]，表明 DDX46 表达上调可能参与食管鳞癌细胞的恶性行为。但目前这些研究均停留在体外细胞水平，DDX46 对活体动物食管鳞癌的作用尚不清楚。本研究利用裸鼠皮下移植瘤动物模型和活体成像技术，观察 DDX46 表达降低后裸鼠移植瘤的生长变化，在活体动物模型中进一步研究 DDX46 在食管鳞癌发生发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要实验仪器和试剂
小动物活体成像系统（Perkin Elmer）。RNAlater（Qiagen）、Trizol 试剂（Invitrogen）、胎牛血清（Ausbian）、胰蛋白酶（上海生工）、M-MLV 逆转录酶（Promega）、Bulge-LoopTM miRNA qPCR Primer Set（广州锐博）、SYBR premix ex taq（TaKaRa）、PCR 扩增试剂盒（TaKaRa）、dNTPs（Promega）、EDTA（上海生工）、Primer（广州锐博）、Lipofectamine 2000 转染试剂（Invitrogen）、RPMI-1640 细胞培养基（Lonza）、BulletKit 内皮细胞培养基（Lonza）、DDX46 抗体（Abcam）、GAPDH 抗体（Sigma）、Caspase-3 抗体（Santa Cruz）、PARP-1 抗体（Santa Cruz）、ECL Western blotting Substrate 试剂盒（Thermo Fisher Scientific）、戊巴比妥钠（Sigma）。
1.1.2 细胞培养
人食管鳞癌细胞 Eca-109 购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，人永生化食管鳞状上皮细胞 Het-1A 购于上海拜力生物科技有限公司。通过慢病毒载体构建获得 DDX46 基因沉默的慢病毒颗粒（实验组：DDX46-shRNA-LV）及空载体慢病毒颗粒（对照组：Control-LV），分别感染食管鳞癌 Eca-109 细胞株。Eca-109 细胞培养于 RPMI-1640 培养液中，Het-1A（空白对照组）培养于 BulletKit 内皮细胞培养基中，均置于 37℃、5% CO2 培养箱内。取对数生长期细胞接种裸鼠。
1.1.3 实验动物
4 周龄健康雌性 BALB/c 裸鼠 25 只，购自上海灵畅生物科技有限公司［许可证号码：SCXK（沪）2013-0018］，在 SPF 级环境饲养。
1.2 实验方法
1.2.1 DDX46-shRNA 慢病毒载体制备和包装
DDX46 基因 RNAi 靶点序列和 shRNA 慢病毒载体制备和包装由上海吉凯基因化学技术有限公司设计完成，DDX46 基因 shRNA 序列：5'-AGAAATCACCAGGCTCATA-3'，阴性对照序列应用公认序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'[9]。
1.2.2 qRT-PCR 检测 Eca-109 细胞 DDX46 基因的敲减效率
感染后 72 h，荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，荧光率即为阳性感染率，细胞感染效率达到 70% 以上者可以继续下游实验。收集目的细胞，用 2 000 rpm 离心 5 min 后，弃去上清液，沉淀的细胞中加入 Trizol 裂解液 1 ml，充分混匀后静置于室温下 5 min，然后转移至 1.5 ml EP 管中，完成细胞样本 Trizol 裂解。依据 Invitrogen 公司 Trizol 操作说明书完成总 RNA 抽提。依据 Promega 公司 M-MLV 操作说明书逆转录 RNA 获得 cDNA。以 GAPDH 基因为内参，两步法进行 qRT-PCR，2-∆∆Ct法计算 DDX46 基因 mRNA 的相对表达量（∆Ct=目的基因 Ct 值－内参基因 Ct 值；∆∆Ct=实验组∆Ct 值－对照组∆Ct 平均值）。实验重复 3 次。
1.2.3 裸鼠皮下移植瘤的建立
慢病毒感染食管鳞癌 Eca-109 细胞 144 h 后进行裸鼠接种，接种前 1 d 将各实验组成瘤细胞胰蛋白酶消化，以保证第 2 d 接种的细胞处于对数生长期，完全培养基重悬成细胞悬液。Control-LV 组和 DDX46-shRNA-LV 组各 10 只 BALB/c 裸鼠，每只 4×106 个成瘤细胞皮下注射至右前肢腋下；Het-1A 组 5 只，每只裸鼠每侧 4×106 个成瘤细胞分别皮下注射至双侧前肢腋下。
1.2.4 检测成瘤情况
接种 14 d 后裸鼠称重，游标卡尺测量移植瘤大小（长径、短径，单位：mm），计算瘤体体积（π/6×长径×短径×短径）。每周 2 次，连续 3 周。按 10 μl/g 腹腔注射 0.7% 戊巴比妥钠麻醉动物，食指轻轻按压动物胸口，测试心跳以保证动物处在成活状态，将其放置于活体成像仪下进行成像，观察荧光，保存数据。接种 31 d，腹腔注射麻醉后颈椎脱位处死实验动物，取出肿瘤，测量瘤体大小并称重，液氮冷冻后–80℃ 冰箱保存。
1.2.5 Western blotting 检测
取 20 mg 移植瘤组织，加入 100 μl 蛋白裂解液，裂解 30 min，匀浆后 4℃、12 000 rpm 离心 30 min，完成细胞总蛋白抽提。取上清 BCA 法测定蛋白浓度。按每孔上样量 20 μg 进行 SDS-PAGE 电泳，4℃ 稳压将蛋白电转移至硝酸纤维素（PVDF）膜上，封闭液室温封闭 PVDF 膜 2 h；封闭液稀释一抗（anti-DDX46 稀释度 1∶200，anti-Caspase-3 稀释度 1∶1 000，anti-PARP-1 稀释度 1∶1 000，anti-GAPDH 稀释度 1∶2 000），然后稀释的一抗孵育封闭好的 PVDF 膜 4℃ 过夜，TBST 液洗膜 3 次，每次 10 min；封闭液稀释相应的二抗（稀释度 1∶2 000），然后稀释的二抗室温下孵育 PVDF 膜 2 h，TBST 液再洗膜 3 次，每次 10 min；按照 ECL Western blotting Substrate 试剂盒说明书完成 X 线显影，晾干后用凝胶成像处理系统扫描拍照，进行灰度值分析。
1.3 统计学分析
应用 SPSS19.0 统计软件分析数据，计量资料用均数±标准差（
）表示，组间比较采用 t 检验。计数资料以率表示，组间比较采用 χ2 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 DDX46-shRNA 慢病毒有效抑制 DDX46 基因的表达
慢病毒感染 72 h 后，荧光显微镜观察目的细胞 GFP 的表达情况，100 倍视野计数各组荧光细胞和总细胞数，荧光细胞占比即为阳性感染率，本实验细胞感染效率达到 80% 以上。经 DDX46-shRNA 慢病毒感染后，qRT-PCR 检测结果显示，Eca-109 细胞 DDX46 基因 mRNA 的表达受到显著抑制（图 1，P<0.01），算得敲减效率达到 90.3%。
图1
荧光显微镜观察慢病毒目的细胞感染率（×100），qRT-PCR 检测 DDX46 基因敲减效率（** P < 0.01）
2.2 沉默 DDX46 基因抑制裸鼠成瘤（瘤体测量）
成瘤细胞接种 14 d 后测量移植瘤长径和短径，计算瘤体体积，共计 6 个检测时点，结果显示：Control-LV 组在第 1 检测时点（接种 14 d）已有 5 只裸鼠成瘤，而 DDX46-shRNA-LV 组此时无成瘤裸鼠；Control-LV 组在第 2 检测时点（接种 17 d）已全部裸鼠成瘤，而 DDX46-shRNA-LV 组在此时只有 5 只裸鼠成瘤；DDX46-shRNA-LV 组在第 5 检测时点（接种 28 d）仍有 1 只裸鼠未成瘤，到第 6 检测时点才完成本组全部裸鼠成瘤。绘制各组目的细胞移植瘤体积增长曲线（图 2）。接种 31 d，腹腔注射麻醉后颈椎脱位处死裸鼠，医用剪刀和镊子取出移植瘤称重，DDX46-shRNA-LV 组瘤体重量较 Control-LV 组显著减轻［（0.335±0.186）g vs.（0.713±0.198）g，P<0.001］。沉默 DDX46 基因使得裸鼠移植瘤生长明显减缓（图 3）。
图2
裸鼠移植瘤体积增长曲线（*** P < 0.001）
图3
裸鼠移植瘤平均重量比较（*** P < 0.001）
2.3 沉默 DDX46 基因抑制裸鼠成瘤（活体小动物成像）
腹腔注射 0.7% 戊巴比妥钠麻醉各组实验动物，将其放置于活体成像仪下进行成像，观察荧光，DDX46-shRNA-LV 组荧光区总荧光表达量和平均荧光表达量均明显低于 Control-LV 组（图 4，P<0.001），说明 RNAi 沉默 DDX46 基因显著抑制 Eca-109 细胞裸鼠成瘤。
图4
小动物活体成像图
2.4 接种 Het-1A 细胞无裸鼠成瘤
Het-1A 细胞悬液每侧 4×106 个细胞量分别双侧前肢腋下皮下注射接种裸鼠，观察 31 d，裸鼠无移植瘤生长（图 5）。
图5
荧光显微镜观察目的细胞（×100），接种 Het-1A 细胞裸鼠不成瘤
2.5 Western blotting 检测结果
沉默 DDX46 基因后，Western blotting 检测移植瘤组织 DDX46 蛋白和凋亡信号通路关键分子的表达水平，结果见图 6，灰度分析结果显示：DDX46蛋白表达水平显著下降，而 cleaved Caspase-3 和 cleaved PARP-1 蛋白表达水平显著上调（P<0.01），提示沉默 DDX46 基因可激活细胞凋亡信号转导通路。
图6
沉默 DDX46 基因后 Western blotting 检测 DDX46 和细胞凋亡标志蛋白的表达情况
3 讨 论
食管癌是极具中国特色的疾病，世界近 60% 的食管癌发生在中国，居我国所有恶性肿瘤死亡率第 4 位[10]。我国食管癌的组织学类型 90% 以上为鳞癌，对于食管鳞癌的治疗虽有手术、化疗、放疗及其他辅助疗法，但其远期疗效很不理想，严重威胁国人健康[10-11]。食管鳞癌靶向治疗的相关研究尚处于萌芽阶段，目前许多靶向药物的相关研究多针对胃-食管连接部腺癌开展，这些研究结果对于食管鳞癌是否适合尚不清楚[12]。
近年来 RNA 在生命系统中的重要性备受关注，涉及 RNA 的生物进程需要 RNA 解旋酶，RNA 解旋酶利用三磷酸腺苷（ATP）水解产生的能量实现 RNA 解旋或核糖核蛋白结构重组，几乎参与了 RNA 代谢的所有环节[13-14]。RNA 解旋酶可以通过改变癌基因表达水平、基因突变或者参入肿瘤启动和进展相关信号转导通路、调控肿瘤耐药基因的表达，参与肿瘤的发生发展[15]。DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成员，人类 DDX46 基因位于染色体 5q31.1，有 26 个外显子，编码的 DDX46 蛋白分子量为 131 kDa[16]。我们前期研究发现 DDX46 蛋白表达主要定位于细胞核，食管鳞癌组织中的表达明显高于相对应食管正常组织[7]，与人正常食管上皮细胞 Het-1A 相比，食管鳞癌细胞 Eca-109 中 DDX46 基因 mRNA 的表达显著上调，抑制 DDX46 表达能降低食管鳞癌 Eca-109 细胞增殖，阻滞细胞周期于 G0/G1 期，并诱导细胞凋亡[8]。目前尚未见 DDX46 与裸鼠成瘤的相关报道。动物实验更能模拟人类的生理和病理条件，获得的实验数据更具有说服力。本实验在前期研究的基础上，选用 DDX46 高表达的食管鳞癌细胞株 Eca-109，采用 RNAi 技术沉默 Eca-109 细胞中 DDX46 基因的表达，以 BALB/c 裸鼠为移植瘤载体，通过皮下注射肿瘤细胞使其成瘤，观察 DDX46 表达降低对裸鼠移植瘤生长的影响，在体内环境中进一步验证 DDX46 在食管鳞癌发生发展中的作用。结果表明 DDX46 表达降低后移植瘤生长明显减慢，提示降低 DDX46 表达可以抑制食管鳞癌的生长，证实 DDX46 参与食管鳞癌的发生发展过程。
为阐明其可能的作用机制，本实验应用 Western blotting 检测移植瘤组织中细胞凋亡信号通路关键分子的变化，发现沉默 DDX46 基因后，移植瘤 DDX46 蛋白表达水平明显下调，而 cleaved Caspase-3 和 cleaved PARP-1 蛋白表达水平显著上调。Caspase-3 是参与细胞凋亡的关键执行分子，在凋亡信号转导的许多途径中发挥功能，正常以无活性的酶原形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡[17]。PARP 是存在于多数真核细胞中的一个多功能蛋白质翻译后修饰酶，在 DNA 损伤修复与细胞凋亡中发挥着重要作用。PARP 在体外可以被多种 Caspase 剪切，在体内是 Caspase-3 的主要剪切对象。因此，PARP 剪切被认为是细胞凋亡的一个重要指标，也通常被认为是 Caspase-3 激活的指标[18]。体内裸鼠成瘤实验证实降低 DDX46 表达可激活细胞凋亡信号通路，抑制食管鳞癌细胞增殖，结果与之前体外细胞实验一致[8]。
Lee 等[1]研究发现，mRNA 中有一小部分编码一些与肿瘤有某种联系的蛋白质，并且这些 mRNA 携带独特标记，能结合到 eIF3 开启或者关闭 mRNA 翻译，从而调节核糖体内蛋白质翻译，这使得 mRNA 上的结合位点成为了一种很有前景的药物靶标。RNA 解旋酶 DDX46 在 mRNA 前体剪接和核糖体组装中发挥核心作用[2-3]，其表达的异常必然影响选择性剪切过程。Zhang 等[19]研究发现肺腺癌中 SMC4 和 DDX46 的 mRNA 表达水平显著正相关，SMC4 和 DDX46 在细胞周期各个时相均存在共定位，SMC4 可能通过与 DDX46 相互作用影响选择性剪切，进而导致肿瘤的发生。Zheng 等[20]研究发现，DDX46 能结合到抗病毒效应分子 mRNA 的 CCGGUU 保守基序上，当病毒感染时 DDX46 与 m6A 去甲基化酶 ALKBH5 结合增加，使得与 DDX46 结合的抗病毒效应分子 mRNA 发生去甲基化修饰而导致其核滞留，阻滞了这些抗病毒效应分子的蛋白表达从而降低干扰素产生，最终抑制了抗病毒天然免疫应答反应。
综上所述，DDX46 的表达水平与食管鳞癌的生长密切相关，沉默 DDX46 基因可显著抑制食管鳞癌细胞裸鼠移植瘤的生长，其机制可能是通过激活细胞凋亡信号通路，进而发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。DDX46 是否通过细胞核内 RNA 修饰的方式参与调控食管鳞癌发生发展还有待进一步研究证实。
目前大多数抗肿瘤药物作用机理是靶向肿瘤细胞的 DNA 或蛋白质，而新近 Lee 等[1]研究发现：DNA 和蛋白质之间的中介物质 mRNA 可能是全新的靶点。DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成员，在 mRNA 前体剪接和核糖体组装中发挥核心作用[2-3]。DDX46 在多种人类恶性肿瘤组织如结肠腺癌[4]、骨肉瘤[5]、膀胱癌[6]等高表达，提示其可能是一个新的癌基因，参与肿瘤的发生和发展。我们前期研究发现 DDX46 在食管鳞癌组织中异常高表达，利用 shRNA 抑制 DDX46 表达能降低食管鳞癌 Eca-109 细胞增殖，并诱导细胞凋亡[7-8]，表明 DDX46 表达上调可能参与食管鳞癌细胞的恶性行为。但目前这些研究均停留在体外细胞水平，DDX46 对活体动物食管鳞癌的作用尚不清楚。本研究利用裸鼠皮下移植瘤动物模型和活体成像技术，观察 DDX46 表达降低后裸鼠移植瘤的生长变化，在活体动物模型中进一步研究 DDX46 在食管鳞癌发生发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要实验仪器和试剂
小动物活体成像系统（Perkin Elmer）。RNAlater（Qiagen）、Trizol 试剂（Invitrogen）、胎牛血清（Ausbian）、胰蛋白酶（上海生工）、M-MLV 逆转录酶（Promega）、Bulge-LoopTM miRNA qPCR Primer Set（广州锐博）、SYBR premix ex taq（TaKaRa）、PCR 扩增试剂盒（TaKaRa）、dNTPs（Promega）、EDTA（上海生工）、Primer（广州锐博）、Lipofectamine 2000 转染试剂（Invitrogen）、RPMI-1640 细胞培养基（Lonza）、BulletKit 内皮细胞培养基（Lonza）、DDX46 抗体（Abcam）、GAPDH 抗体（Sigma）、Caspase-3 抗体（Santa Cruz）、PARP-1 抗体（Santa Cruz）、ECL Western blotting Substrate 试剂盒（Thermo Fisher Scientific）、戊巴比妥钠（Sigma）。
1.1.2 细胞培养
人食管鳞癌细胞 Eca-109 购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，人永生化食管鳞状上皮细胞 Het-1A 购于上海拜力生物科技有限公司。通过慢病毒载体构建获得 DDX46 基因沉默的慢病毒颗粒（实验组：DDX46-shRNA-LV）及空载体慢病毒颗粒（对照组：Control-LV），分别感染食管鳞癌 Eca-109 细胞株。Eca-109 细胞培养于 RPMI-1640 培养液中，Het-1A（空白对照组）培养于 BulletKit 内皮细胞培养基中，均置于 37℃、5% CO2 培养箱内。取对数生长期细胞接种裸鼠。
1.1.3 实验动物
4 周龄健康雌性 BALB/c 裸鼠 25 只，购自上海灵畅生物科技有限公司［许可证号码：SCXK（沪）2013-0018］，在 SPF 级环境饲养。
1.2 实验方法
1.2.1 DDX46-shRNA 慢病毒载体制备和包装
DDX46 基因 RNAi 靶点序列和 shRNA 慢病毒载体制备和包装由上海吉凯基因化学技术有限公司设计完成，DDX46 基因 shRNA 序列：5'-AGAAATCACCAGGCTCATA-3'，阴性对照序列应用公认序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'[9]。
1.2.2 qRT-PCR 检测 Eca-109 细胞 DDX46 基因的敲减效率
感染后 72 h，荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，荧光率即为阳性感染率，细胞感染效率达到 70% 以上者可以继续下游实验。收集目的细胞，用 2 000 rpm 离心 5 min 后，弃去上清液，沉淀的细胞中加入 Trizol 裂解液 1 ml，充分混匀后静置于室温下 5 min，然后转移至 1.5 ml EP 管中，完成细胞样本 Trizol 裂解。依据 Invitrogen 公司 Trizol 操作说明书完成总 RNA 抽提。依据 Promega 公司 M-MLV 操作说明书逆转录 RNA 获得 cDNA。以 GAPDH 基因为内参，两步法进行 qRT-PCR，2-∆∆Ct法计算 DDX46 基因 mRNA 的相对表达量（∆Ct=目的基因 Ct 值－内参基因 Ct 值；∆∆Ct=实验组∆Ct 值－对照组∆Ct 平均值）。实验重复 3 次。
1.2.3 裸鼠皮下移植瘤的建立
慢病毒感染食管鳞癌 Eca-109 细胞 144 h 后进行裸鼠接种，接种前 1 d 将各实验组成瘤细胞胰蛋白酶消化，以保证第 2 d 接种的细胞处于对数生长期，完全培养基重悬成细胞悬液。Control-LV 组和 DDX46-shRNA-LV 组各 10 只 BALB/c 裸鼠，每只 4×106 个成瘤细胞皮下注射至右前肢腋下；Het-1A 组 5 只，每只裸鼠每侧 4×106 个成瘤细胞分别皮下注射至双侧前肢腋下。
1.2.4 检测成瘤情况
接种 14 d 后裸鼠称重，游标卡尺测量移植瘤大小（长径、短径，单位：mm），计算瘤体体积（π/6×长径×短径×短径）。每周 2 次，连续 3 周。按 10 μl/g 腹腔注射 0.7% 戊巴比妥钠麻醉动物，食指轻轻按压动物胸口，测试心跳以保证动物处在成活状态，将其放置于活体成像仪下进行成像，观察荧光，保存数据。接种 31 d，腹腔注射麻醉后颈椎脱位处死实验动物，取出肿瘤，测量瘤体大小并称重，液氮冷冻后–80℃ 冰箱保存。
1.2.5 Western blotting 检测
取 20 mg 移植瘤组织，加入 100 μl 蛋白裂解液，裂解 30 min，匀浆后 4℃、12 000 rpm 离心 30 min，完成细胞总蛋白抽提。取上清 BCA 法测定蛋白浓度。按每孔上样量 20 μg 进行 SDS-PAGE 电泳，4℃ 稳压将蛋白电转移至硝酸纤维素（PVDF）膜上，封闭液室温封闭 PVDF 膜 2 h；封闭液稀释一抗（anti-DDX46 稀释度 1∶200，anti-Caspase-3 稀释度 1∶1 000，anti-PARP-1 稀释度 1∶1 000，anti-GAPDH 稀释度 1∶2 000），然后稀释的一抗孵育封闭好的 PVDF 膜 4℃ 过夜，TBST 液洗膜 3 次，每次 10 min；封闭液稀释相应的二抗（稀释度 1∶2 000），然后稀释的二抗室温下孵育 PVDF 膜 2 h，TBST 液再洗膜 3 次，每次 10 min；按照 ECL Western blotting Substrate 试剂盒说明书完成 X 线显影，晾干后用凝胶成像处理系统扫描拍照，进行灰度值分析。
1.3 统计学分析
应用 SPSS19.0 统计软件分析数据，计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用 t 检验。计数资料以率表示，组间比较采用 χ2 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 DDX46-shRNA 慢病毒有效抑制 DDX46 基因的表达
慢病毒感染 72 h 后，荧光显微镜观察目的细胞 GFP 的表达情况，100 倍视野计数各组荧光细胞和总细胞数，荧光细胞占比即为阳性感染率，本实验细胞感染效率达到 80% 以上。经 DDX46-shRNA 慢病毒感染后，qRT-PCR 检测结果显示，Eca-109 细胞 DDX46 基因 mRNA 的表达受到显著抑制（图 1，P<0.01），算得敲减效率达到 90.3%。
图1
荧光显微镜观察慢病毒目的细胞感染率（×100），qRT-PCR 检测 DDX46 基因敲减效率（** P < 0.01）
2.2 沉默 DDX46 基因抑制裸鼠成瘤（瘤体测量）
成瘤细胞接种 14 d 后测量移植瘤长径和短径，计算瘤体体积，共计 6 个检测时点，结果显示：Control-LV 组在第 1 检测时点（接种 14 d）已有 5 只裸鼠成瘤，而 DDX46-shRNA-LV 组此时无成瘤裸鼠；Control-LV 组在第 2 检测时点（接种 17 d）已全部裸鼠成瘤，而 DDX46-shRNA-LV 组在此时只有 5 只裸鼠成瘤；DDX46-shRNA-LV 组在第 5 检测时点（接种 28 d）仍有 1 只裸鼠未成瘤，到第 6 检测时点才完成本组全部裸鼠成瘤。绘制各组目的细胞移植瘤体积增长曲线（图 2）。接种 31 d，腹腔注射麻醉后颈椎脱位处死裸鼠，医用剪刀和镊子取出移植瘤称重，DDX46-shRNA-LV 组瘤体重量较 Control-LV 组显著减轻［（0.335±0.186）g vs.（0.713±0.198）g，P<0.001］。沉默 DDX46 基因使得裸鼠移植瘤生长明显减缓（图 3）。
图2
裸鼠移植瘤体积增长曲线（*** P < 0.001）
图3
裸鼠移植瘤平均重量比较（*** P < 0.001）
2.3 沉默 DDX46 基因抑制裸鼠成瘤（活体小动物成像）
腹腔注射 0.7% 戊巴比妥钠麻醉各组实验动物，将其放置于活体成像仪下进行成像，观察荧光，DDX46-shRNA-LV 组荧光区总荧光表达量和平均荧光表达量均明显低于 Control-LV 组（图 4，P<0.001），说明 RNAi 沉默 DDX46 基因显著抑制 Eca-109 细胞裸鼠成瘤。
图4
小动物活体成像图
2.4 接种 Het-1A 细胞无裸鼠成瘤
Het-1A 细胞悬液每侧 4×106 个细胞量分别双侧前肢腋下皮下注射接种裸鼠，观察 31 d，裸鼠无移植瘤生长（图 5）。
图5
荧光显微镜观察目的细胞（×100），接种 Het-1A 细胞裸鼠不成瘤
2.5 Western blotting 检测结果
沉默 DDX46 基因后，Western blotting 检测移植瘤组织 DDX46 蛋白和凋亡信号通路关键分子的表达水平，结果见图 6，灰度分析结果显示：DDX46蛋白表达水平显著下降，而 cleaved Caspase-3 和 cleaved PARP-1 蛋白表达水平显著上调（P<0.01），提示沉默 DDX46 基因可激活细胞凋亡信号转导通路。
图6
沉默 DDX46 基因后 Western blotting 检测 DDX46 和细胞凋亡标志蛋白的表达情况
3 讨 论
食管癌是极具中国特色的疾病，世界近 60% 的食管癌发生在中国，居我国所有恶性肿瘤死亡率第 4 位[10]。我国食管癌的组织学类型 90% 以上为鳞癌，对于食管鳞癌的治疗虽有手术、化疗、放疗及其他辅助疗法，但其远期疗效很不理想，严重威胁国人健康[10-11]。食管鳞癌靶向治疗的相关研究尚处于萌芽阶段，目前许多靶向药物的相关研究多针对胃-食管连接部腺癌开展，这些研究结果对于食管鳞癌是否适合尚不清楚[12]。
近年来 RNA 在生命系统中的重要性备受关注，涉及 RNA 的生物进程需要 RNA 解旋酶，RNA 解旋酶利用三磷酸腺苷（ATP）水解产生的能量实现 RNA 解旋或核糖核蛋白结构重组，几乎参与了 RNA 代谢的所有环节[13-14]。RNA 解旋酶可以通过改变癌基因表达水平、基因突变或者参入肿瘤启动和进展相关信号转导通路、调控肿瘤耐药基因的表达，参与肿瘤的发生发展[15]。DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成员，人类 DDX46 基因位于染色体 5q31.1，有 26 个外显子，编码的 DDX46 蛋白分子量为 131 kDa[16]。我们前期研究发现 DDX46 蛋白表达主要定位于细胞核，食管鳞癌组织中的表达明显高于相对应食管正常组织[7]，与人正常食管上皮细胞 Het-1A 相比，食管鳞癌细胞 Eca-109 中 DDX46 基因 mRNA 的表达显著上调，抑制 DDX46 表达能降低食管鳞癌 Eca-109 细胞增殖，阻滞细胞周期于 G0/G1 期，并诱导细胞凋亡[8]。目前尚未见 DDX46 与裸鼠成瘤的相关报道。动物实验更能模拟人类的生理和病理条件，获得的实验数据更具有说服力。本实验在前期研究的基础上，选用 DDX46 高表达的食管鳞癌细胞株 Eca-109，采用 RNAi 技术沉默 Eca-109 细胞中 DDX46 基因的表达，以 BALB/c 裸鼠为移植瘤载体，通过皮下注射肿瘤细胞使其成瘤，观察 DDX46 表达降低对裸鼠移植瘤生长的影响，在体内环境中进一步验证 DDX46 在食管鳞癌发生发展中的作用。结果表明 DDX46 表达降低后移植瘤生长明显减慢，提示降低 DDX46 表达可以抑制食管鳞癌的生长，证实 DDX46 参与食管鳞癌的发生发展过程。
为阐明其可能的作用机制，本实验应用 Western blotting 检测移植瘤组织中细胞凋亡信号通路关键分子的变化，发现沉默 DDX46 基因后，移植瘤 DDX46 蛋白表达水平明显下调，而 cleaved Caspase-3 和 cleaved PARP-1 蛋白表达水平显著上调。Caspase-3 是参与细胞凋亡的关键执行分子，在凋亡信号转导的许多途径中发挥功能，正常以无活性的酶原形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡[17]。PARP 是存在于多数真核细胞中的一个多功能蛋白质翻译后修饰酶，在 DNA 损伤修复与细胞凋亡中发挥着重要作用。PARP 在体外可以被多种 Caspase 剪切，在体内是 Caspase-3 的主要剪切对象。因此，PARP 剪切被认为是细胞凋亡的一个重要指标，也通常被认为是 Caspase-3 激活的指标[18]。体内裸鼠成瘤实验证实降低 DDX46 表达可激活细胞凋亡信号通路，抑制食管鳞癌细胞增殖，结果与之前体外细胞实验一致[8]。
Lee 等[1]研究发现，mRNA 中有一小部分编码一些与肿瘤有某种联系的蛋白质，并且这些 mRNA 携带独特标记，能结合到 eIF3 开启或者关闭 mRNA 翻译，从而调节核糖体内蛋白质翻译，这使得 mRNA 上的结合位点成为了一种很有前景的药物靶标。RNA 解旋酶 DDX46 在 mRNA 前体剪接和核糖体组装中发挥核心作用[2-3]，其表达的异常必然影响选择性剪切过程。Zhang 等[19]研究发现肺腺癌中 SMC4 和 DDX46 的 mRNA 表达水平显著正相关，SMC4 和 DDX46 在细胞周期各个时相均存在共定位，SMC4 可能通过与 DDX46 相互作用影响选择性剪切，进而导致肿瘤的发生。Zheng 等[20]研究发现，DDX46 能结合到抗病毒效应分子 mRNA 的 CCGGUU 保守基序上，当病毒感染时 DDX46 与 m6A 去甲基化酶 ALKBH5 结合增加，使得与 DDX46 结合的抗病毒效应分子 mRNA 发生去甲基化修饰而导致其核滞留，阻滞了这些抗病毒效应分子的蛋白表达从而降低干扰素产生，最终抑制了抗病毒天然免疫应答反应。
综上所述，DDX46 的表达水平与食管鳞癌的生长密切相关，沉默 DDX46 基因可显著抑制食管鳞癌细胞裸鼠移植瘤的生长，其机制可能是通过激活细胞凋亡信号通路，进而发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。DDX46 是否通过细胞核内 RNA 修饰的方式参与调控食管鳞癌发生发展还有待进一步研究证实。
