引用本文： 毕红亲, 李妙玲, 周伟, 李光, 董亚辉, 黄涛, 于风旭. 窦性心律与心房颤动患者心房成纤维细胞大电导钙激活钾通道表达差异研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2017, 24(12): 937-942. doi: 10.7507/1007-4848.201707042 复制
心房颤动（atrial fibrillation，AF）是临床最为常见的心律失常，住院率和死亡率较高[1]。研究发现心肌纤维化导致的结构重构是永久性 AF 发生和持续的底物[2]，同时也是 AF 发生电重构和收缩重构的底物[3-6]，临床也发现心房纤维化是 AF 发生结构重构的重要特点[7]。
大电导钙激活钾通道（BKCa）广泛分布在各种组织细胞内，参与多种细胞生理功能的调节。在血管中分布密度较大，被证实该类通道结构变化及功能状态对血管平滑肌细胞的舒张和收缩起到重要作用，与高血压疾病的发生发展密切相关[8]。2006 年 Wang 等[9]首次报道人心肌来源成纤维细胞上存在功能性的 BKCa，但其确切的生理功能并不知晓。2013 年 Sheng 等[10]首次在人心房成纤维细胞上发现存在 BKCa 通道。Cruse 等[11]研究发现钙激活钾通道与纤维化的形成密切相关。
因此本研究拟对照分析窦性心律（sinus rhythm，SR）与 AF 患者心房成纤维细胞 BKCa 通道表达差异，探索心肌纤维化产生的机制，为治疗和逆转 AF 结构重构提供新的治疗策略。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
选择西南医科大学附属医院心胸外科 2015 年 6 月至 2016 年 12 月收治确诊为风湿性心脏病且行体外循环瓣膜置换术的 10 例患者，均未服用抗心律失常药物。本试验经西南医科大学附属医院伦理委员会同意，且患者及家属均签署知情同意书。按照心脏彩超诊断为风湿性心脏瓣膜病且 24 h 动态心电图证实为 SR 或者 AF ，将患者分为 SR 组 [5 例，男 2 例、女 3 例，年龄（49.1±8.3）岁]及 AF 组 [5 例，男 3 例、女 2 例，年龄（50.3±5.8）岁]。
入选标准及诊断方法：（1）由 GE 公司生产的 VividE9 型心脏多普勒彩超仪（探头频率 3.0 Hz）诊断为风湿性心脏瓣膜病；（2）24 h 动态心电图证实为 SR 或 AF；（3）检测患者类风湿性因子；（4）患者心尖区闻及舒张期隆隆样杂音或第一心音增强；（5）具有外科手术指征，且与患者及家属沟通后同意手术治疗。
排除标准：排除感染性心内膜炎、心肌梗死引起的瓣膜病变以及合并糖尿病、高血压及其他自身免疫性疾病、血液系统疾病及恶性肿瘤患者。
1.2 成纤维细胞培养鉴定
1.2.1 细胞培养
右心耳组织块经 75% 的酒精浸泡消毒后剪成约 1 mm3 大小均匀小块。磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗后移入盛有 1 ml DMEM 培养基的 EP 管中，继续用眼科剪尽量剪碎，然后用移液管将组织碎块吸入到无菌玻璃瓶中，加入 0.01% Ⅱ型胶原酶液 5 ml ，37℃ 水浴箱中消化 10 min 后离心，去上清液。加入 10 ml 20% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 高糖培养基，吹打混匀后，将悬浮液吸入到 10 cm 培养皿中，放置于 37℃、5% CO2 培养箱中孵育。每天观察培养液颜色，及时更换培养液。
1.2.2 细胞鉴定
将细胞悬液种到 3 cm 培养皿的载玻片上，加入培养液培养 1～2 d 取出玻片，PBS 清洗 3 次后加入 1 ml 固定液固定，PBS 清洗后加入 1 ml 封闭液（0.5% Triton×100）室温封闭 30 min。PBS 清洗后加入 1 ml 1% 牛血清白蛋白（BSA）室温封闭 1 h。取 1∶300 的稀释一抗（兔抗人波形蛋白）1 ml 滴加到载玻片上 4℃ 作用过夜。次日用 PBS 清洗后加入 1 ml 按 1∶100 稀释的二抗（兔抗）室温避光孵育 1 h，加入 500 μl 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）液，室温避光孵育 5 min，PBS 洗涤 3 次。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的载玻片，使细胞接触封片液，便可于荧光显微镜下观察。
1.3 实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）及 western blotting 检测
按照 Trizon Reagen 说明书提取总 RNA，使用 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Code No. FSQ-201）试剂盒行 qRT-PCR 检测，逆转录程序：37℃×15 min，50℃×5 min，98℃×5 min；扩增程序：95℃×2 min，95℃×15 s，57℃×30 s，循环数为 40 个；添加溶解曲线：95℃×15 s，60℃×15 s，95℃×15 s。反应结束后采用 2–△△CT值方法分析目的基因的表达水平。
PCR 相关引物序列：
BKCa α F：5'-TCTCCAGTGCCTTCGTG-3'
R：5'-GGTGTTGGGTGAGTTCC-3'
BkCa β1F：5'-TTGAGACCAACATCAGGGA-3'
R：5'-GGTGTTGGGTGAGTTCC-3'
western blotting 检测：常规方法提取蛋白，测定浓度后采用 SDS-PAGE 检测蛋白表达。
1.4 统计学分析
采用 SPSS17.0 软件进行统计分析，计量资料以均数+标准差（
）表示，组间比较采用独立样本 t 检验和单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者的一般资料
比较 AF 组及 SR 组患者的一般情况，两组患者年龄（P=0.67）、性别（P=0.75）差异无统计学意义。心脏彩色超声多普勒仪检查证实两组患者均为风湿性二尖瓣狭窄伴关闭不全，反流病变程度均在中度以下。两组患者左房内径和右房内径差异有统计学意义（t=19.45，P=0.01；t=23.52，P=0.06），见表 1。
表1
AF 组与 SR 组患者一般情况（
/例）
2.2 人心房成纤维细胞培养及鉴定
采用组织块贴壁法培养心房成纤维细胞，进行原代培养时，可见显微镜下黑色组织块，即为贴壁的心房组织，约 4～5 d 后，可见细胞从组织块边缘长出，随着培养时间的延长，细胞形态逐渐变为星状或放射状，不规则排列，细胞核呈椭圆形，核仁较大，常含 2～3 个核。待细胞生长至培养皿的 90% 左右，即可行传代培养。传代细胞排列紧密，慢慢融合，形态呈长梭形，无自发性搏动，见图 1。使用波形蛋白鉴定成纤维细胞，可见成纤维细胞波形蛋白表达阳性，胞核周围可观察到红色细胞浆呈丝状改变，见图 2。为排除心肌细胞的干扰，本试验用肌钙蛋白抗体鉴定所培养细胞的纯度，结果显示肌钙蛋白表达阴性，仅见蓝色细胞核，证实所培养的为成纤维细胞，且纯度高，无心肌细胞干扰，故镜下未成像，见图 3。
图1
不同倍数下的成纤维细胞 a. 原代细胞（20×）； b. 传代细胞（10×）； c. 传代细胞（20×）； d. 传代细胞（40×）
图2
波形蛋白鉴定成纤维细胞 a. 成纤维细胞浆呈红色丝状改变； b. 成纤维细胞Dapi染色细胞核；c. a、b合成图
图3
肌钙蛋白鉴定培养细胞 a. 培养细胞中无心肌细胞，表明培养细胞纯度高，镜下未显像； b. Dapi染色可见成纤维细胞核； c. a、b合成图
2.3 BKCa mRNA 表达水平比较
应用 qRT-PCR 方法检测两组 BKCa mRNA 表达水平，结果提示，两组的 BKCa α 和 BKCa β1 的表达差异均无统计学意义（P=0.79，P=0.69），见图 4。
图4
SR 与 AF 患者成纤维细胞上 BKCa mRNA 表达水平比较
2.4 BKCa 蛋白表达水平比较
应用 western blotting 方法检测 BKCa 蛋白表达水平，结果提示，两组的 BKCa α 和 BKCa β1 的表达差异均无统计学意义（P=0.31，P=0.46），见图 5。
图5
SR 与 AF 患者成纤维细胞上 BKCa 蛋白表达水平比较
3 讨论
近年来，大量研究证实，人心房成纤维细胞上存在多种钾离子通道表达，其中 BKCa 通道是表达最多的一类，其功能与成纤维细胞增殖分化相关[9-10]。然而，BKCa 通道是否参与 AF 的形成及维持目前尚不清楚。
BKCa 通道由 4 个 α 亚基单独或与 β 亚基配对组成，两者比例为 1∶1，α 亚基是由 Sloα（KCNMA1）单基因编码的 7 次跨膜结构（S0～S6），其中 S0 跨膜片段是 BKCa 通道的功能区域，S1～S4 片段为电压敏感区，S5 与 S6 间形成一个片段称 H5 区或 P 环，4 个 α 亚基在此对称排列构成通道的亲水性孔道。β1 亚基由 191 个氨基酸残基组成的两个跨膜片段，主要参与调节通道的 Ca2+ 的敏感性[12]。因此，本研究为明确 SR 患者和 AF 患者人心房成纤维细胞上 BKCa 通道表达的差异性，采用 qRT-PCR 和 western blotting 技术分别检测 BKCa 通道 α 和 β1的 mRNA 及蛋白表达水平。
为获取足量的成纤维细胞，本研究采用优化组织块贴壁法，即使用 0.01% Ⅱ型胶原酶消化结缔组织中的胶原，将消化下来的胶原蛋白及结缔组织去除，更利于组织块贴壁，同时提高培养基中血清比例（20%），结果发现成纤维细胞生长快，细胞密度高，形态上呈有突起的梭形或多角形细胞，与张建成等[13]培养的人心房成纤维细胞形态相似。波形蛋白是鉴定成纤维细胞的特异性标志[14-15]，本研究对所培养的细胞行免疫荧光染色显示波形蛋白强阳性，且纯度大于 95%，证实所培养的为成纤维细胞。
我们的结果显示 SR 组与 AF 组中人心房成纤维细胞上 BKCa 通道 α 和 β1 的 mRNA 与蛋白表达水平均无明显差异。其表达无差异可能跟以下原因有关：（1）由于受到伦理因素的影响，无法在左心房取材做检测，但 AF 的发生与左心房的结构改变也有密切的关系，右心耳的检测结果不一定能代表左心房的检测结果，这也是该试验的局限性；（2）由于本次研究检测的例数较少，这也可能影响数据的统计分析结果，这将在以后的试验中继续验证；（3）有报道表明下调 BKCa 的表达可抑制人心房成纤维细胞的增殖，从而参与调控心肌纤维化进程[10]。Balderas 等[16]报道，在心肌细胞细胞膜上并未发现 BKCa，仅在线粒体内膜上存在。众所周知，心肌细胞上离子通道表达异常与心律失常发生关系密切。因此我们推论，BKCa 通道可能仅参与心肌纤维化的形成，而在心肌纤维化导致 AF 的进程中无明显作用。此外，值得注意的是，多数研究证实成纤维细胞在体外培养后而发生表型变化。例如，成纤维细胞在体外培养 24～48 h 后会分化成肌成纤维细胞，并表达 α-SMA[17-19]。上述报道说明，无论是 SR 组或 AF 组细胞经体外培养后均可能发生表型的改变，使得两组细胞的生理特性趋于一致，从而使得细胞上的离子通道表达及其功能表现出无差异性。
综上所述，虽然本研究结果表明 BKCa 通道可能不参与 AF 的发生及维持，但 BKCa 通道在成纤维细胞上的功能以及在心肌纤维化进程中的作用值得进一步研究。BKCa 通道可能不参与 AF 的发生及维持，其在心肌纤维化进程中的可能发挥着作用。
心房颤动（atrial fibrillation，AF）是临床最为常见的心律失常，住院率和死亡率较高[1]。研究发现心肌纤维化导致的结构重构是永久性 AF 发生和持续的底物[2]，同时也是 AF 发生电重构和收缩重构的底物[3-6]，临床也发现心房纤维化是 AF 发生结构重构的重要特点[7]。
大电导钙激活钾通道（BKCa）广泛分布在各种组织细胞内，参与多种细胞生理功能的调节。在血管中分布密度较大，被证实该类通道结构变化及功能状态对血管平滑肌细胞的舒张和收缩起到重要作用，与高血压疾病的发生发展密切相关[8]。2006 年 Wang 等[9]首次报道人心肌来源成纤维细胞上存在功能性的 BKCa，但其确切的生理功能并不知晓。2013 年 Sheng 等[10]首次在人心房成纤维细胞上发现存在 BKCa 通道。Cruse 等[11]研究发现钙激活钾通道与纤维化的形成密切相关。
因此本研究拟对照分析窦性心律（sinus rhythm，SR）与 AF 患者心房成纤维细胞 BKCa 通道表达差异，探索心肌纤维化产生的机制，为治疗和逆转 AF 结构重构提供新的治疗策略。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
选择西南医科大学附属医院心胸外科 2015 年 6 月至 2016 年 12 月收治确诊为风湿性心脏病且行体外循环瓣膜置换术的 10 例患者，均未服用抗心律失常药物。本试验经西南医科大学附属医院伦理委员会同意，且患者及家属均签署知情同意书。按照心脏彩超诊断为风湿性心脏瓣膜病且 24 h 动态心电图证实为 SR 或者 AF ，将患者分为 SR 组 [5 例，男 2 例、女 3 例，年龄（49.1±8.3）岁]及 AF 组 [5 例，男 3 例、女 2 例，年龄（50.3±5.8）岁]。
入选标准及诊断方法：（1）由 GE 公司生产的 VividE9 型心脏多普勒彩超仪（探头频率 3.0 Hz）诊断为风湿性心脏瓣膜病；（2）24 h 动态心电图证实为 SR 或 AF；（3）检测患者类风湿性因子；（4）患者心尖区闻及舒张期隆隆样杂音或第一心音增强；（5）具有外科手术指征，且与患者及家属沟通后同意手术治疗。
排除标准：排除感染性心内膜炎、心肌梗死引起的瓣膜病变以及合并糖尿病、高血压及其他自身免疫性疾病、血液系统疾病及恶性肿瘤患者。
1.2 成纤维细胞培养鉴定
1.2.1 细胞培养
右心耳组织块经 75% 的酒精浸泡消毒后剪成约 1 mm3 大小均匀小块。磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗后移入盛有 1 ml DMEM 培养基的 EP 管中，继续用眼科剪尽量剪碎，然后用移液管将组织碎块吸入到无菌玻璃瓶中，加入 0.01% Ⅱ型胶原酶液 5 ml ，37℃ 水浴箱中消化 10 min 后离心，去上清液。加入 10 ml 20% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 高糖培养基，吹打混匀后，将悬浮液吸入到 10 cm 培养皿中，放置于 37℃、5% CO2 培养箱中孵育。每天观察培养液颜色，及时更换培养液。
1.2.2 细胞鉴定
将细胞悬液种到 3 cm 培养皿的载玻片上，加入培养液培养 1～2 d 取出玻片，PBS 清洗 3 次后加入 1 ml 固定液固定，PBS 清洗后加入 1 ml 封闭液（0.5% Triton×100）室温封闭 30 min。PBS 清洗后加入 1 ml 1% 牛血清白蛋白（BSA）室温封闭 1 h。取 1∶300 的稀释一抗（兔抗人波形蛋白）1 ml 滴加到载玻片上 4℃ 作用过夜。次日用 PBS 清洗后加入 1 ml 按 1∶100 稀释的二抗（兔抗）室温避光孵育 1 h，加入 500 μl 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）液，室温避光孵育 5 min，PBS 洗涤 3 次。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的载玻片，使细胞接触封片液，便可于荧光显微镜下观察。
1.3 实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）及 western blotting 检测
按照 Trizon Reagen 说明书提取总 RNA，使用 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Code No. FSQ-201）试剂盒行 qRT-PCR 检测，逆转录程序：37℃×15 min，50℃×5 min，98℃×5 min；扩增程序：95℃×2 min，95℃×15 s，57℃×30 s，循环数为 40 个；添加溶解曲线：95℃×15 s，60℃×15 s，95℃×15 s。反应结束后采用 2–△△CT值方法分析目的基因的表达水平。
PCR 相关引物序列：
BKCa α F：5'-TCTCCAGTGCCTTCGTG-3'
R：5'-GGTGTTGGGTGAGTTCC-3'
BkCa β1F：5'-TTGAGACCAACATCAGGGA-3'
R：5'-GGTGTTGGGTGAGTTCC-3'
western blotting 检测：常规方法提取蛋白，测定浓度后采用 SDS-PAGE 检测蛋白表达。
1.4 统计学分析
采用 SPSS17.0 软件进行统计分析，计量资料以均数+标准差（
）表示，组间比较采用独立样本 t 检验和单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者的一般资料
比较 AF 组及 SR 组患者的一般情况，两组患者年龄（P=0.67）、性别（P=0.75）差异无统计学意义。心脏彩色超声多普勒仪检查证实两组患者均为风湿性二尖瓣狭窄伴关闭不全，反流病变程度均在中度以下。两组患者左房内径和右房内径差异有统计学意义（t=19.45，P=0.01；t=23.52，P=0.06），见表 1。
表1
AF 组与 SR 组患者一般情况（
/例）
2.2 人心房成纤维细胞培养及鉴定
采用组织块贴壁法培养心房成纤维细胞，进行原代培养时，可见显微镜下黑色组织块，即为贴壁的心房组织，约 4～5 d 后，可见细胞从组织块边缘长出，随着培养时间的延长，细胞形态逐渐变为星状或放射状，不规则排列，细胞核呈椭圆形，核仁较大，常含 2～3 个核。待细胞生长至培养皿的 90% 左右，即可行传代培养。传代细胞排列紧密，慢慢融合，形态呈长梭形，无自发性搏动，见图 1。使用波形蛋白鉴定成纤维细胞，可见成纤维细胞波形蛋白表达阳性，胞核周围可观察到红色细胞浆呈丝状改变，见图 2。为排除心肌细胞的干扰，本试验用肌钙蛋白抗体鉴定所培养细胞的纯度，结果显示肌钙蛋白表达阴性，仅见蓝色细胞核，证实所培养的为成纤维细胞，且纯度高，无心肌细胞干扰，故镜下未成像，见图 3。
图1
不同倍数下的成纤维细胞 a. 原代细胞（20×）； b. 传代细胞（10×）； c. 传代细胞（20×）； d. 传代细胞（40×）
图2
波形蛋白鉴定成纤维细胞 a. 成纤维细胞浆呈红色丝状改变； b. 成纤维细胞Dapi染色细胞核；c. a、b合成图
图3
肌钙蛋白鉴定培养细胞 a. 培养细胞中无心肌细胞，表明培养细胞纯度高，镜下未显像； b. Dapi染色可见成纤维细胞核； c. a、b合成图
2.3 BKCa mRNA 表达水平比较
应用 qRT-PCR 方法检测两组 BKCa mRNA 表达水平，结果提示，两组的 BKCa α 和 BKCa β1 的表达差异均无统计学意义（P=0.79，P=0.69），见图 4。
图4
SR 与 AF 患者成纤维细胞上 BKCa mRNA 表达水平比较
2.4 BKCa 蛋白表达水平比较
应用 western blotting 方法检测 BKCa 蛋白表达水平，结果提示，两组的 BKCa α 和 BKCa β1 的表达差异均无统计学意义（P=0.31，P=0.46），见图 5。
图5
SR 与 AF 患者成纤维细胞上 BKCa 蛋白表达水平比较
3 讨论
近年来，大量研究证实，人心房成纤维细胞上存在多种钾离子通道表达，其中 BKCa 通道是表达最多的一类，其功能与成纤维细胞增殖分化相关[9-10]。然而，BKCa 通道是否参与 AF 的形成及维持目前尚不清楚。
BKCa 通道由 4 个 α 亚基单独或与 β 亚基配对组成，两者比例为 1∶1，α 亚基是由 Sloα（KCNMA1）单基因编码的 7 次跨膜结构（S0～S6），其中 S0 跨膜片段是 BKCa 通道的功能区域，S1～S4 片段为电压敏感区，S5 与 S6 间形成一个片段称 H5 区或 P 环，4 个 α 亚基在此对称排列构成通道的亲水性孔道。β1 亚基由 191 个氨基酸残基组成的两个跨膜片段，主要参与调节通道的 Ca2+ 的敏感性[12]。因此，本研究为明确 SR 患者和 AF 患者人心房成纤维细胞上 BKCa 通道表达的差异性，采用 qRT-PCR 和 western blotting 技术分别检测 BKCa 通道 α 和 β1的 mRNA 及蛋白表达水平。
为获取足量的成纤维细胞，本研究采用优化组织块贴壁法，即使用 0.01% Ⅱ型胶原酶消化结缔组织中的胶原，将消化下来的胶原蛋白及结缔组织去除，更利于组织块贴壁，同时提高培养基中血清比例（20%），结果发现成纤维细胞生长快，细胞密度高，形态上呈有突起的梭形或多角形细胞，与张建成等[13]培养的人心房成纤维细胞形态相似。波形蛋白是鉴定成纤维细胞的特异性标志[14-15]，本研究对所培养的细胞行免疫荧光染色显示波形蛋白强阳性，且纯度大于 95%，证实所培养的为成纤维细胞。
我们的结果显示 SR 组与 AF 组中人心房成纤维细胞上 BKCa 通道 α 和 β1 的 mRNA 与蛋白表达水平均无明显差异。其表达无差异可能跟以下原因有关：（1）由于受到伦理因素的影响，无法在左心房取材做检测，但 AF 的发生与左心房的结构改变也有密切的关系，右心耳的检测结果不一定能代表左心房的检测结果，这也是该试验的局限性；（2）由于本次研究检测的例数较少，这也可能影响数据的统计分析结果，这将在以后的试验中继续验证；（3）有报道表明下调 BKCa 的表达可抑制人心房成纤维细胞的增殖，从而参与调控心肌纤维化进程[10]。Balderas 等[16]报道，在心肌细胞细胞膜上并未发现 BKCa，仅在线粒体内膜上存在。众所周知，心肌细胞上离子通道表达异常与心律失常发生关系密切。因此我们推论，BKCa 通道可能仅参与心肌纤维化的形成，而在心肌纤维化导致 AF 的进程中无明显作用。此外，值得注意的是，多数研究证实成纤维细胞在体外培养后而发生表型变化。例如，成纤维细胞在体外培养 24～48 h 后会分化成肌成纤维细胞，并表达 α-SMA[17-19]。上述报道说明，无论是 SR 组或 AF 组细胞经体外培养后均可能发生表型的改变，使得两组细胞的生理特性趋于一致，从而使得细胞上的离子通道表达及其功能表现出无差异性。
综上所述，虽然本研究结果表明 BKCa 通道可能不参与 AF 的发生及维持，但 BKCa 通道在成纤维细胞上的功能以及在心肌纤维化进程中的作用值得进一步研究。BKCa 通道可能不参与 AF 的发生及维持，其在心肌纤维化进程中的可能发挥着作用。
