钙化性主动脉瓣疾病是欧美国家最常见的心脏瓣膜疾病，在我国的发病率也逐年升高。主动脉瓣钙化是多种分子和机制共同参与的复杂病理过程。炎症不仅与多种疾病相关，也是参与主动脉瓣钙化发生发展的机制之一，它能调控成骨细胞分化相关因子的表达而促进钙化损害的进展，因而在瓣膜钙化中扮演着重要角色。心血管事件的危险因素脂质代谢异常也与主动脉瓣钙化有关，它能诱发或增强瓣膜局部炎症反应而促进钙化进展。对恶性肿瘤进展具有调控作用的非编码 RNA 亦可从多方面调控主动脉瓣钙化的相关通路。miRNA 和 lncRNA 等非编码 RNA 可调控炎症及成骨细胞分化相关基因的表达而调节瓣膜钙化的进程。
引用本文： 贺钰斌, 朱丹. 钙化性主动脉瓣疾病发病机制的研究进展. 中国胸心血管外科临床杂志, 2018, 25(2): 171-176. doi: 10.7507/1007-4848.201704033 复制
钙化性主动脉瓣疾病（calcific aortic valve disease，CAVD）是主动脉瓣的进行性病变，主要表现为瓣叶纤维增生与钙化导致瓣膜僵硬，严重者可发生钙化性主动脉瓣狭窄（calcific aortic valve stenosis, CAVS），引起左室流出道梗阻。CAVS 是最常见的心脏瓣膜疾病，2006 年美国瓣膜病的指南将其定义为：超声显示瓣膜回声增强、瓣膜增厚，瓣口面积<3.0 cm2、跨瓣血流速率>2.5 m/s[1]。在发达国家，CAVS 在 65 岁以上人群的发病率约为 2%，85 岁以上人群的发病率约为 4%[2]。CAVD 的发病风险随年龄增长而增加，因此众多学者一度认为它是主动脉瓣的退行性病变。但近年的研究发现 CAVD 与动脉粥样硬化具有相似的病理过程，包括脂质沉积、炎症反应、新血管形成、内皮功能障碍及瓣膜间质细胞（valvular interstitial cell，VIC）向成骨细胞分化[3-4]最终形成钙化损害。目前尚缺乏治疗 CAVD 的有效药物，尽管有学者认为他汀类药物能发挥抗炎作用从而延缓 CAVD 进展，在相关临床研究中却发现试验组与对照组主动脉瓣钙化的进展程度并无明显差异[5]。外科主动脉瓣置换术是治疗 CAVD 唯一有效的方法，能明显改善患者症状、提高生存质量[6]。因此阐明 CAVD 的发病机制、寻找可能的药物靶点对于延缓和预防主动脉瓣钙化具有重要意义。
1 脂质代谢异常诱发炎症反应促进主动脉瓣钙化进展
血脂异常是主动脉瓣钙化的重要危险因素之一。家族性高脂血症是低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor，LDLR）基因突变所致的遗传性疾病。临床研究发现家族性高脂血症患者发生主动脉瓣狭窄的风险明显升高，且 LDLR 阴性突变的患者更易发生主动脉瓣钙化。大量临床研究表明血脂异常的患者主动脉瓣狭窄的发病风险明显升高，而在动物实验中发现给予高脂血症所致主动脉瓣钙化的家兔他汀类药物治疗后，其瓣膜钙化程度有所减轻[7-8]。组织病理学研究也发现主动脉瓣钙化区域周围有脂质浸润，如低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、载脂蛋白 B（apolipoproteinB，ApoB）和脂蛋白（lipoprotein，Lp），这些脂质很可能来源于血浆。血浆高水平的脂质在主动脉瓣上皮损伤处沉积形成原始损害并诱发氧化应激可能是其促进主动脉瓣狭窄进展的重要机制。
LDL 是富含胆固醇的脂蛋白，在炎症环境下，LDL 可被氧化修饰生成氧化型 LDL（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL），后者可通过 Toll 样受体（toll-like receptor，TLR）诱发炎症反应并形成抗原表位激活特异性免疫系统[9]。单核-巨噬细胞是参与主动脉瓣钙化的重要细胞成分之一，活化的巨噬细胞能分泌多种促炎性细胞因子，ox-LDL 能激活单核-巨噬细胞从而促进主动脉瓣钙化的进展[10]。氧化型磷脂（oxidized phospholipids，oxPL）能促进炎症反应并具有促动脉粥样硬化的作用[11]。Ox-LDL 富含 oxPL，其与主动脉瓣钙化的进展直接相关[12]。最新研究发现狭窄瓣膜中脂蛋白相关性磷脂酶 A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，LP-PLA2）表达水平升高，它能将 oxPL 分解为游离脂肪酸和溶血卵磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）[13]。LPC 具有促炎作用，在体外培养的 VIC 中，LPC 能促进碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、核苷酸内焦磷酸酶/磷酸二酯酶 1（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1，ENPP1）和钠磷共转运体 Pit1 基因表达上调，而 ALP、ENPP1 和 Pit1 均能促进主动脉瓣钙化[14]。此外，ENPP1 家族成员 autotaxin 亦可通过调控炎症诱导的 BMP 表达而促进钙化[15]。因此 ox-LDL 亦可通过 LP-PLA2 对 oxPL 的分解作用产生 LPC、诱发后续的连锁反应从而促进 VIC 钙化。最新研究发现，给心肌钙化的小鼠注射 ENPP1 小分子抑制剂 SYL-001 和 ARL67156 后，小鼠心肌钙盐沉积与对照组相比分别减少 35% 和 79%[16]。钙化瓣膜中 ENPP1 水平亦有升高，因此我们推测 ENPP1 小分子抑制剂对延缓主动脉瓣钙化的进展也有类似作用，仍需进一步研究以确保此类药物的安全性和有效性。
ApoB 是低密度脂蛋白胆固醇的主要成分，它是一种大分子蛋白并作为大分子骨架包裹于 Lp 表面以保证其结构完整性[17]。脂蛋白 a［lipoproteina，Lp（a）］水平升高也是主动脉瓣钙化的重要危险因素。大量流行病学研究表明：Lp（a）水平达到 30 mg/dl（75 nmol/L）时主动脉瓣狭窄的发病风险开始增加，当其水平>60 mg/dl（150 nmol/L）时则主动脉瓣钙狭窄的发病风险明显增加[18]。血清 Lp（a）的水平是由其编码基因 LPA 决定的，其中 Kringle-Ⅳ区 2 型（KⅣ-2）重复序列长度多态性决定了载脂蛋白 A 的表达程度，它与 Lp（a）水平呈负相关，而 LPA 基因 rs10455872 和 rs3798220 位点的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）与 Lp（a）水平升高有关[19-20]。对钙化瓣膜标本进行全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）后发现仅有 LPA 基因 rs10455872 位点的 SNP 与主动脉瓣钙化有关[21]。
因此，脂质代谢异常可通过活化单核-巨噬细胞系统、激活特异性免疫而诱发炎症反应，最终促进主动脉瓣钙化进展。基因变异所致的脂质代谢异常亦与 CAVD 发病有关，但能否将 Lp（a）作为预测 CAVD 的生物标记物需要进行大规模临床研究。血脂异常作为瓣膜钙化的重要危险因素之一，目前主要以预防为主，脂蛋白 SNP 的发现可能从基因层面为 CAVD 的治疗提供新思路。
2 炎症反应活化钙化相关因子促进主动脉瓣钙化进展
炎症是最常见的病理过程，已经证实在动脉粥样硬化中常有炎症细胞浸润，CAVD 的组织学研究中也观察到此现象[4]，因此 CAVD 的进展涉及炎症反应。在炎症反应中，非特异性免疫产生的细胞因子、特异性免疫细胞的激活均与 CAVD 进展有关。
肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是由巨噬细胞、单核细胞、T 细胞和平滑肌细胞等多种细胞分泌的细胞因子，它在急性炎症反应中具有保护作用，而在慢性炎症中则与多种病理过程有关[22]。VIC 是主动脉瓣中重要的细胞成分之一，它有两种类型，分别为：α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）阳性的 VIC 和 α-SMA 阴性的 VIC，其中前者表现出活化的成肌细胞表型而后者表现出静止的成纤维细胞表型[23]。钙化瓣膜中的巨噬细胞能表达 TNF-α，从而促进主动脉瓣成肌细胞增殖和基质金属蛋白酶 1（matrix metalloproteinase1，MMP1）表达，在钙化培养基培养的主动脉瓣成肌细胞受到 TNF-α 刺激后细胞内钙化结节增多、成骨细胞标记物水平升高[24]。此外，TNF-α 一方面可激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路调节促炎性细胞因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）表达上调，另一方面可通过该通路诱导自身表达水平上调[25]。IL-6 能通过骨成型蛋白 2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）信号通路促进 VIC 向成骨细胞分化，白细胞介素-1（interluekin-1，IL-1）家族成员 IL-18 能通过 NF-κB 信号通路促进 VIC 向成肌细胞分化同时上调成骨细胞标记物 mRNA 的表达水平并诱导 TNF-α 和 IL-6 表达上调[26-28]，这些炎症因子相互作用形成正反馈环路使炎症因子生成增加、加重瓣膜内炎症反应，最终促进主动脉瓣钙化进展。新发现的细胞因子 IL-1 家族成员白细胞介素-37（interleukin-37，IL-37）则是一种抗炎性细胞因子，其在体内和体外均有抗炎作用[29]。最新研究表明 IL-37 具有抑制瓣膜钙化的作用，它能抑制瓣膜钙化相关的 NF-κB 和 BMP2 信号通路及成骨细胞标记物碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表达，进而减少 VIC 内钙盐沉积[30]。
转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和 BMP2 均参与血管与瓣膜钙化中的促成骨活动，Smad 信号是介导二者促成骨作用的重要信号分子[31-32]。Smad1 和 Smad3 与 TGF-β 和 BMP2 介导的成骨细胞标记物 Runx2 及 ALP 水平升高有关，而 Smurf2 则是该作用的负向调控因子[33-34]。在正常情况下，机体可通过 TGF-β/BMP2-Smad1/Smad3-Runx2/ALP-Smurf2 的负反馈环路抑制 TGF-β 和 BMP2 诱导的 Smad1 和 Smad3 信号，使瓣膜内钙化相关因子处于正常水平，防止钙化的发生。在病理状态下，该环路受到破坏，导致钙化相关因子生成增多而促进主动脉瓣钙化的进展。
最近的研究发现在钙化主动脉瓣中有 T 细胞克隆性增殖以及 CD4+和 CD8+T 细胞浸润[9]。CAVD 患者 CD3+T 细胞表达人类白细胞 DR 抗原（human leukocyte antige，HLA-DR）水平升高，CD8+和 CD57+T 细胞亚群表达 HLA-DR 比例增加，这充分说明在主动脉瓣钙化中有特异性免疫的参与[35]。有学者认为抗原表位的氧化性修饰能激活 T 细胞[9]，该观点仍有待证实。
目前已明确非特异性免疫在 CAVD 中具有重要作用，但对特异性免疫研究较少。钙化瓣膜中大量促炎性细胞因子表达上调、相关信号通路的激活，而抗炎性细胞因子表达则受到抑制。我们推测两类细胞因子在主动脉瓣中失衡是炎症促进 CAVD 进展的重要因素之一。IL-37 的抗炎作用能抑制钙化相关信号通路的活性，因此该细胞因子有望成为延缓 CAVD 进展的治疗靶点。
3 非编码 RNA 对炎症及促钙化因子的调控促进主动脉瓣钙化进展
3.1 miRNA 对炎症及促钙化因子的调控
炎症反应和脂质代谢是 CAVD 进展的经典机制，但两种机制涉及的信号通路和分子还受到基因水平的调控。非编码 RNA 是调控编码蛋白质基因的重要分子，且与多种疾病的发生发展有关。微小 RNA（microRNA，miRNA）是一类由内源性基因编码、长度约为 20～24 个核苷酸、高度保守的非编码 RNA，它在基因表达的转录后修饰中具有重要作用并且与多种疾病发生发展有关。最近有大量研究发现正常瓣膜与钙化瓣膜的多种 miRNA 呈差异性表达且与主动脉瓣钙化的进展密切相关。目前已发现二叶式主动脉瓣（bicuspid aortic valve，BAV）的狭窄瓣膜中 miR-26a、miR-30b 和 miR-195 表达下调，钙化瓣膜中 miR-374b、miR-602 和 miR-939 表达下调而 miR-125b 水平上调[36-37]。此外，巨噬细胞对主动脉瓣钙化的促进作用也与 miRNA 有关。
miR-26a 对促钙化因子如 BMP2、Runx2、SMAD1 和 SMAD5 具有抑制作用，同时能增强钙化抑制基因如 Smad7 和 JAG2 的表达，miR-30b 亦可增强 Smad7 和 JAG2 的表达而表现出抑制钙化的效应，miR-195 则能活化促钙化基因[37]。其中 JAG2 是 Notch 信号通路的配体，它可能通过对 NOTCH1 的作用抑制主动脉瓣钙化的进展[38]。MiR-939 对内皮一氧化氮合成酶（endothelialnitric oxide synthase，eNOS）具有调节作用，eNOS 能降低 α-SMA 水平、抑制 MMP9 活性和 TGF-β 的下游分子 Smad2 磷酸化等机制防止瓣膜纤维化、抑制 VIC 的促纤维化因子活性，而 eNOS-/-基因敲除的小鼠易发生主动脉瓣钙化[36, 39]。钙化瓣膜中 MiR-939 表达下调可能导致 eNOS 合成减少并促进主动脉瓣钙化的进展。此外，在 TGF-β/BMP2-Smad1/Smad3-Runx2/ALP-Smurf2 负反馈环路中，TGF-β 和 BMP2 通过上调 VIC 中 miR-486、下调 miR-204 水平增强促成骨活动，miR-486 通过抑制 Smurf2 表达使 miR-204 水平下调，最终加快瓣膜钙化的进展[32]。miR-374b 是 CCTTA 增强子结合蛋白-β（C/EBP-β）的调节因子且与巨噬细胞极化有关[40]。静止的巨噬细胞可促进 VIC 向成骨细胞分化，巨噬细胞极化能影响促炎性细胞因子的释放及其对 VIC 的作用并调节 VIC 向成骨细胞分化，而极化的 M1 型巨噬细胞可能分泌 TNF-α 和 IL-6 形成促炎环境而进一步促进 VIC 钙化[41]。miR-125b 能调节炎症因子的基因表达及血管钙化，具有炎症调节作用的趋化因子 CCL4 是 miR-125b 的作用靶点，最近研究已证实钙化瓣膜中二者水平均上调能促进 CAVD 的进展[36]。
miRNA 是肿瘤学领域的研究热点，但关于 CAVD 的 miRNA 研究较少。近年的研究表明 miRNA 与 CAVD 的易感性与进展密切相关。miRNA 亦参与了炎症因子、纤维化和钙化相关因子表达的调控以及炎症细胞功能的调节，这表明其与瓣膜内炎症反应有关。目前正在研究 miRNA 作为急性心肌梗死和心力衰竭的生物标记物的可行性[42]，但在 CAVD 中尚缺乏可能作为生物标记物的 miRNA。因此，对 miRNA 与其它机制之间的相互作用进行深入研究、寻找可能作为 CAVD 标记物的 miRNA 分子对于阐明 CAVD 的发病机制、早期发现并干预 CAVD 的进展有重要意义。
3.2 lncRNA 对钙化相关因子的调控
长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA，越来越多的证据表明 lncRNA 是调节基因表达和细胞分化的关键因子，它能与蛋白质相互作用、干扰 miRNA、修饰表观基因组并被基因启动子募集而干预基因表达[43-44]。
Hox 转录反义基因间 RNA（hox transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR）是一种lncRNA，长度为 2 200 个核苷酸，能使多个转移抑制基因沉默促进恶性肿瘤转移。BAV 由于长期承受较正常瓣膜更大的机械剪切力而更易发生钙化。有研究发现 BAV 的 VIC 中 HOTAIR 水平较三叶式主动脉瓣（tricuspid aortic valve，TAV）的 VIC 水平低，同时伴有钙化相关基因肝/骨/肾型碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，liver/bone/kidney，ALPL）和 BMP2 表达水平增高，这些改变与瓣膜长期承受机械张力所致 Wnt/β-Catenin 信号通路的激活有关[45]。这表明 HOTAIR 能抑制钙化相关基因的表达，而且 HOTAIR 基因位点的 SNP 可能与主动脉瓣钙化有关。
lncRNA H19 为一种印记基因，H19-胰岛素样生长因子 2（insulin-like growth factor，H19-IGF2）的基因位点包含了差异性甲基化区域（differentially methylated region，DMR）[46]。对钙化瓣膜的标本进行检测后发现 H19 的启动子区域低甲基化并导致其过表达，H19 过表达可诱导钙化相关基因 Runx2 表达上调、抑制 NOTCH1 基因表达、激活 Wnt 信号通路从而促进 VIC 获得成骨细胞表型[47-49]。NOTCH1 对促钙化因子 Runx2 和 BMP2 具有负向调控作用，转录因子 P53 是 NOTCH1 的重要调节因子且能负向调控成骨细胞分化，H19 对 NOTCH1 基因表达的抑制作用可能与其抑制 P53 在 NOTCH1 启动子区域的募集有关[49-50]。因此，H19 能在转录水平调控 NOTCH1 表达从而促进主动脉瓣钙化的进展。
lncRNA 是遗传学和肿瘤学领域的研究热点，并有大量研究表明 lncRNA 参与了肿瘤的发生发展和转移以及退行性神经疾病的进展，但心血管领域的此类研究较少。lncRNA 所调控的 NOTCH1 基因和 BMP2 亦受到炎症因子的调控。lncRNA 对成骨相关基因和信号通路的调控是否有炎症的参与还不清楚，因此我们需要对 lncRNA 与炎症在主动脉瓣钙化中有无相互作用进行综合考虑。对 lncRNA 在 CAVD 中作用的深入研究能为阐明其发病机制提供新视角，并在分子生物学水平上为该疾病的药物治疗提供新靶点。
4 总结
CAVD 并非单纯的瓣膜退行性病变，炎症反应、脂质代谢异常以及非编码 RNA 的调控均参与其中，共同促进主动脉瓣钙化的进展。一方面，瓣膜局部炎症反应和脂质代谢异常的经典机制与 CAVD 的发生发展明确相关，脂质代谢异常可诱发或加重瓣膜局部的炎症反应促进 CAVD 进展。另一方面，分子生物学研究表明 Lp（a）编码基因 SNP 所致的脂质代谢异常、miRNA 与 lncRNA 对钙化相关基因的调控亦与 CAVD 的进展有关，miRNA 和 lncRNA 上调具有促钙化作用的炎症因子而抑制抗钙化因子的活性最终加快瓣膜钙化的进展。现已证实抗 IL-1β 单抗对减轻血管钙化有一定作用，对老年患者实行药物治疗后再给予必要的手术治疗亦有助于降低术后死亡风险。尽管对主动脉瓣钙化的发病机制在炎症、脂质代谢和基因水平上做了大量研究，但瓣膜局部有多种细胞成分，多种细胞间有相互作用，因此还原体内环境、探讨细胞间通讯对主动脉瓣钙化的作用，对于明确 CAVD 的发病机制、寻找合适的治疗靶点具有重要意义。
钙化性主动脉瓣疾病（calcific aortic valve disease，CAVD）是主动脉瓣的进行性病变，主要表现为瓣叶纤维增生与钙化导致瓣膜僵硬，严重者可发生钙化性主动脉瓣狭窄（calcific aortic valve stenosis, CAVS），引起左室流出道梗阻。CAVS 是最常见的心脏瓣膜疾病，2006 年美国瓣膜病的指南将其定义为：超声显示瓣膜回声增强、瓣膜增厚，瓣口面积<3.0 cm2、跨瓣血流速率>2.5 m/s[1]。在发达国家，CAVS 在 65 岁以上人群的发病率约为 2%，85 岁以上人群的发病率约为 4%[2]。CAVD 的发病风险随年龄增长而增加，因此众多学者一度认为它是主动脉瓣的退行性病变。但近年的研究发现 CAVD 与动脉粥样硬化具有相似的病理过程，包括脂质沉积、炎症反应、新血管形成、内皮功能障碍及瓣膜间质细胞（valvular interstitial cell，VIC）向成骨细胞分化[3-4]最终形成钙化损害。目前尚缺乏治疗 CAVD 的有效药物，尽管有学者认为他汀类药物能发挥抗炎作用从而延缓 CAVD 进展，在相关临床研究中却发现试验组与对照组主动脉瓣钙化的进展程度并无明显差异[5]。外科主动脉瓣置换术是治疗 CAVD 唯一有效的方法，能明显改善患者症状、提高生存质量[6]。因此阐明 CAVD 的发病机制、寻找可能的药物靶点对于延缓和预防主动脉瓣钙化具有重要意义。
1 脂质代谢异常诱发炎症反应促进主动脉瓣钙化进展
血脂异常是主动脉瓣钙化的重要危险因素之一。家族性高脂血症是低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor，LDLR）基因突变所致的遗传性疾病。临床研究发现家族性高脂血症患者发生主动脉瓣狭窄的风险明显升高，且 LDLR 阴性突变的患者更易发生主动脉瓣钙化。大量临床研究表明血脂异常的患者主动脉瓣狭窄的发病风险明显升高，而在动物实验中发现给予高脂血症所致主动脉瓣钙化的家兔他汀类药物治疗后，其瓣膜钙化程度有所减轻[7-8]。组织病理学研究也发现主动脉瓣钙化区域周围有脂质浸润，如低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、载脂蛋白 B（apolipoproteinB，ApoB）和脂蛋白（lipoprotein，Lp），这些脂质很可能来源于血浆。血浆高水平的脂质在主动脉瓣上皮损伤处沉积形成原始损害并诱发氧化应激可能是其促进主动脉瓣狭窄进展的重要机制。
LDL 是富含胆固醇的脂蛋白，在炎症环境下，LDL 可被氧化修饰生成氧化型 LDL（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL），后者可通过 Toll 样受体（toll-like receptor，TLR）诱发炎症反应并形成抗原表位激活特异性免疫系统[9]。单核-巨噬细胞是参与主动脉瓣钙化的重要细胞成分之一，活化的巨噬细胞能分泌多种促炎性细胞因子，ox-LDL 能激活单核-巨噬细胞从而促进主动脉瓣钙化的进展[10]。氧化型磷脂（oxidized phospholipids，oxPL）能促进炎症反应并具有促动脉粥样硬化的作用[11]。Ox-LDL 富含 oxPL，其与主动脉瓣钙化的进展直接相关[12]。最新研究发现狭窄瓣膜中脂蛋白相关性磷脂酶 A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，LP-PLA2）表达水平升高，它能将 oxPL 分解为游离脂肪酸和溶血卵磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）[13]。LPC 具有促炎作用，在体外培养的 VIC 中，LPC 能促进碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、核苷酸内焦磷酸酶/磷酸二酯酶 1（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1，ENPP1）和钠磷共转运体 Pit1 基因表达上调，而 ALP、ENPP1 和 Pit1 均能促进主动脉瓣钙化[14]。此外，ENPP1 家族成员 autotaxin 亦可通过调控炎症诱导的 BMP 表达而促进钙化[15]。因此 ox-LDL 亦可通过 LP-PLA2 对 oxPL 的分解作用产生 LPC、诱发后续的连锁反应从而促进 VIC 钙化。最新研究发现，给心肌钙化的小鼠注射 ENPP1 小分子抑制剂 SYL-001 和 ARL67156 后，小鼠心肌钙盐沉积与对照组相比分别减少 35% 和 79%[16]。钙化瓣膜中 ENPP1 水平亦有升高，因此我们推测 ENPP1 小分子抑制剂对延缓主动脉瓣钙化的进展也有类似作用，仍需进一步研究以确保此类药物的安全性和有效性。
ApoB 是低密度脂蛋白胆固醇的主要成分，它是一种大分子蛋白并作为大分子骨架包裹于 Lp 表面以保证其结构完整性[17]。脂蛋白 a［lipoproteina，Lp（a）］水平升高也是主动脉瓣钙化的重要危险因素。大量流行病学研究表明：Lp（a）水平达到 30 mg/dl（75 nmol/L）时主动脉瓣狭窄的发病风险开始增加，当其水平>60 mg/dl（150 nmol/L）时则主动脉瓣钙狭窄的发病风险明显增加[18]。血清 Lp（a）的水平是由其编码基因 LPA 决定的，其中 Kringle-Ⅳ区 2 型（KⅣ-2）重复序列长度多态性决定了载脂蛋白 A 的表达程度，它与 Lp（a）水平呈负相关，而 LPA 基因 rs10455872 和 rs3798220 位点的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）与 Lp（a）水平升高有关[19-20]。对钙化瓣膜标本进行全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）后发现仅有 LPA 基因 rs10455872 位点的 SNP 与主动脉瓣钙化有关[21]。
因此，脂质代谢异常可通过活化单核-巨噬细胞系统、激活特异性免疫而诱发炎症反应，最终促进主动脉瓣钙化进展。基因变异所致的脂质代谢异常亦与 CAVD 发病有关，但能否将 Lp（a）作为预测 CAVD 的生物标记物需要进行大规模临床研究。血脂异常作为瓣膜钙化的重要危险因素之一，目前主要以预防为主，脂蛋白 SNP 的发现可能从基因层面为 CAVD 的治疗提供新思路。
2 炎症反应活化钙化相关因子促进主动脉瓣钙化进展
炎症是最常见的病理过程，已经证实在动脉粥样硬化中常有炎症细胞浸润，CAVD 的组织学研究中也观察到此现象[4]，因此 CAVD 的进展涉及炎症反应。在炎症反应中，非特异性免疫产生的细胞因子、特异性免疫细胞的激活均与 CAVD 进展有关。
肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是由巨噬细胞、单核细胞、T 细胞和平滑肌细胞等多种细胞分泌的细胞因子，它在急性炎症反应中具有保护作用，而在慢性炎症中则与多种病理过程有关[22]。VIC 是主动脉瓣中重要的细胞成分之一，它有两种类型，分别为：α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）阳性的 VIC 和 α-SMA 阴性的 VIC，其中前者表现出活化的成肌细胞表型而后者表现出静止的成纤维细胞表型[23]。钙化瓣膜中的巨噬细胞能表达 TNF-α，从而促进主动脉瓣成肌细胞增殖和基质金属蛋白酶 1（matrix metalloproteinase1，MMP1）表达，在钙化培养基培养的主动脉瓣成肌细胞受到 TNF-α 刺激后细胞内钙化结节增多、成骨细胞标记物水平升高[24]。此外，TNF-α 一方面可激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路调节促炎性细胞因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）表达上调，另一方面可通过该通路诱导自身表达水平上调[25]。IL-6 能通过骨成型蛋白 2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）信号通路促进 VIC 向成骨细胞分化，白细胞介素-1（interluekin-1，IL-1）家族成员 IL-18 能通过 NF-κB 信号通路促进 VIC 向成肌细胞分化同时上调成骨细胞标记物 mRNA 的表达水平并诱导 TNF-α 和 IL-6 表达上调[26-28]，这些炎症因子相互作用形成正反馈环路使炎症因子生成增加、加重瓣膜内炎症反应，最终促进主动脉瓣钙化进展。新发现的细胞因子 IL-1 家族成员白细胞介素-37（interleukin-37，IL-37）则是一种抗炎性细胞因子，其在体内和体外均有抗炎作用[29]。最新研究表明 IL-37 具有抑制瓣膜钙化的作用，它能抑制瓣膜钙化相关的 NF-κB 和 BMP2 信号通路及成骨细胞标记物碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表达，进而减少 VIC 内钙盐沉积[30]。
转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和 BMP2 均参与血管与瓣膜钙化中的促成骨活动，Smad 信号是介导二者促成骨作用的重要信号分子[31-32]。Smad1 和 Smad3 与 TGF-β 和 BMP2 介导的成骨细胞标记物 Runx2 及 ALP 水平升高有关，而 Smurf2 则是该作用的负向调控因子[33-34]。在正常情况下，机体可通过 TGF-β/BMP2-Smad1/Smad3-Runx2/ALP-Smurf2 的负反馈环路抑制 TGF-β 和 BMP2 诱导的 Smad1 和 Smad3 信号，使瓣膜内钙化相关因子处于正常水平，防止钙化的发生。在病理状态下，该环路受到破坏，导致钙化相关因子生成增多而促进主动脉瓣钙化的进展。
最近的研究发现在钙化主动脉瓣中有 T 细胞克隆性增殖以及 CD4+和 CD8+T 细胞浸润[9]。CAVD 患者 CD3+T 细胞表达人类白细胞 DR 抗原（human leukocyte antige，HLA-DR）水平升高，CD8+和 CD57+T 细胞亚群表达 HLA-DR 比例增加，这充分说明在主动脉瓣钙化中有特异性免疫的参与[35]。有学者认为抗原表位的氧化性修饰能激活 T 细胞[9]，该观点仍有待证实。
目前已明确非特异性免疫在 CAVD 中具有重要作用，但对特异性免疫研究较少。钙化瓣膜中大量促炎性细胞因子表达上调、相关信号通路的激活，而抗炎性细胞因子表达则受到抑制。我们推测两类细胞因子在主动脉瓣中失衡是炎症促进 CAVD 进展的重要因素之一。IL-37 的抗炎作用能抑制钙化相关信号通路的活性，因此该细胞因子有望成为延缓 CAVD 进展的治疗靶点。
3 非编码 RNA 对炎症及促钙化因子的调控促进主动脉瓣钙化进展
3.1 miRNA 对炎症及促钙化因子的调控
炎症反应和脂质代谢是 CAVD 进展的经典机制，但两种机制涉及的信号通路和分子还受到基因水平的调控。非编码 RNA 是调控编码蛋白质基因的重要分子，且与多种疾病的发生发展有关。微小 RNA（microRNA，miRNA）是一类由内源性基因编码、长度约为 20～24 个核苷酸、高度保守的非编码 RNA，它在基因表达的转录后修饰中具有重要作用并且与多种疾病发生发展有关。最近有大量研究发现正常瓣膜与钙化瓣膜的多种 miRNA 呈差异性表达且与主动脉瓣钙化的进展密切相关。目前已发现二叶式主动脉瓣（bicuspid aortic valve，BAV）的狭窄瓣膜中 miR-26a、miR-30b 和 miR-195 表达下调，钙化瓣膜中 miR-374b、miR-602 和 miR-939 表达下调而 miR-125b 水平上调[36-37]。此外，巨噬细胞对主动脉瓣钙化的促进作用也与 miRNA 有关。
miR-26a 对促钙化因子如 BMP2、Runx2、SMAD1 和 SMAD5 具有抑制作用，同时能增强钙化抑制基因如 Smad7 和 JAG2 的表达，miR-30b 亦可增强 Smad7 和 JAG2 的表达而表现出抑制钙化的效应，miR-195 则能活化促钙化基因[37]。其中 JAG2 是 Notch 信号通路的配体，它可能通过对 NOTCH1 的作用抑制主动脉瓣钙化的进展[38]。MiR-939 对内皮一氧化氮合成酶（endothelialnitric oxide synthase，eNOS）具有调节作用，eNOS 能降低 α-SMA 水平、抑制 MMP9 活性和 TGF-β 的下游分子 Smad2 磷酸化等机制防止瓣膜纤维化、抑制 VIC 的促纤维化因子活性，而 eNOS-/-基因敲除的小鼠易发生主动脉瓣钙化[36, 39]。钙化瓣膜中 MiR-939 表达下调可能导致 eNOS 合成减少并促进主动脉瓣钙化的进展。此外，在 TGF-β/BMP2-Smad1/Smad3-Runx2/ALP-Smurf2 负反馈环路中，TGF-β 和 BMP2 通过上调 VIC 中 miR-486、下调 miR-204 水平增强促成骨活动，miR-486 通过抑制 Smurf2 表达使 miR-204 水平下调，最终加快瓣膜钙化的进展[32]。miR-374b 是 CCTTA 增强子结合蛋白-β（C/EBP-β）的调节因子且与巨噬细胞极化有关[40]。静止的巨噬细胞可促进 VIC 向成骨细胞分化，巨噬细胞极化能影响促炎性细胞因子的释放及其对 VIC 的作用并调节 VIC 向成骨细胞分化，而极化的 M1 型巨噬细胞可能分泌 TNF-α 和 IL-6 形成促炎环境而进一步促进 VIC 钙化[41]。miR-125b 能调节炎症因子的基因表达及血管钙化，具有炎症调节作用的趋化因子 CCL4 是 miR-125b 的作用靶点，最近研究已证实钙化瓣膜中二者水平均上调能促进 CAVD 的进展[36]。
miRNA 是肿瘤学领域的研究热点，但关于 CAVD 的 miRNA 研究较少。近年的研究表明 miRNA 与 CAVD 的易感性与进展密切相关。miRNA 亦参与了炎症因子、纤维化和钙化相关因子表达的调控以及炎症细胞功能的调节，这表明其与瓣膜内炎症反应有关。目前正在研究 miRNA 作为急性心肌梗死和心力衰竭的生物标记物的可行性[42]，但在 CAVD 中尚缺乏可能作为生物标记物的 miRNA。因此，对 miRNA 与其它机制之间的相互作用进行深入研究、寻找可能作为 CAVD 标记物的 miRNA 分子对于阐明 CAVD 的发病机制、早期发现并干预 CAVD 的进展有重要意义。
3.2 lncRNA 对钙化相关因子的调控
长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA，越来越多的证据表明 lncRNA 是调节基因表达和细胞分化的关键因子，它能与蛋白质相互作用、干扰 miRNA、修饰表观基因组并被基因启动子募集而干预基因表达[43-44]。
Hox 转录反义基因间 RNA（hox transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR）是一种lncRNA，长度为 2 200 个核苷酸，能使多个转移抑制基因沉默促进恶性肿瘤转移。BAV 由于长期承受较正常瓣膜更大的机械剪切力而更易发生钙化。有研究发现 BAV 的 VIC 中 HOTAIR 水平较三叶式主动脉瓣（tricuspid aortic valve，TAV）的 VIC 水平低，同时伴有钙化相关基因肝/骨/肾型碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，liver/bone/kidney，ALPL）和 BMP2 表达水平增高，这些改变与瓣膜长期承受机械张力所致 Wnt/β-Catenin 信号通路的激活有关[45]。这表明 HOTAIR 能抑制钙化相关基因的表达，而且 HOTAIR 基因位点的 SNP 可能与主动脉瓣钙化有关。
lncRNA H19 为一种印记基因，H19-胰岛素样生长因子 2（insulin-like growth factor，H19-IGF2）的基因位点包含了差异性甲基化区域（differentially methylated region，DMR）[46]。对钙化瓣膜的标本进行检测后发现 H19 的启动子区域低甲基化并导致其过表达，H19 过表达可诱导钙化相关基因 Runx2 表达上调、抑制 NOTCH1 基因表达、激活 Wnt 信号通路从而促进 VIC 获得成骨细胞表型[47-49]。NOTCH1 对促钙化因子 Runx2 和 BMP2 具有负向调控作用，转录因子 P53 是 NOTCH1 的重要调节因子且能负向调控成骨细胞分化，H19 对 NOTCH1 基因表达的抑制作用可能与其抑制 P53 在 NOTCH1 启动子区域的募集有关[49-50]。因此，H19 能在转录水平调控 NOTCH1 表达从而促进主动脉瓣钙化的进展。
lncRNA 是遗传学和肿瘤学领域的研究热点，并有大量研究表明 lncRNA 参与了肿瘤的发生发展和转移以及退行性神经疾病的进展，但心血管领域的此类研究较少。lncRNA 所调控的 NOTCH1 基因和 BMP2 亦受到炎症因子的调控。lncRNA 对成骨相关基因和信号通路的调控是否有炎症的参与还不清楚，因此我们需要对 lncRNA 与炎症在主动脉瓣钙化中有无相互作用进行综合考虑。对 lncRNA 在 CAVD 中作用的深入研究能为阐明其发病机制提供新视角，并在分子生物学水平上为该疾病的药物治疗提供新靶点。
4 总结
CAVD 并非单纯的瓣膜退行性病变，炎症反应、脂质代谢异常以及非编码 RNA 的调控均参与其中，共同促进主动脉瓣钙化的进展。一方面，瓣膜局部炎症反应和脂质代谢异常的经典机制与 CAVD 的发生发展明确相关，脂质代谢异常可诱发或加重瓣膜局部的炎症反应促进 CAVD 进展。另一方面，分子生物学研究表明 Lp（a）编码基因 SNP 所致的脂质代谢异常、miRNA 与 lncRNA 对钙化相关基因的调控亦与 CAVD 的进展有关，miRNA 和 lncRNA 上调具有促钙化作用的炎症因子而抑制抗钙化因子的活性最终加快瓣膜钙化的进展。现已证实抗 IL-1β 单抗对减轻血管钙化有一定作用，对老年患者实行药物治疗后再给予必要的手术治疗亦有助于降低术后死亡风险。尽管对主动脉瓣钙化的发病机制在炎症、脂质代谢和基因水平上做了大量研究，但瓣膜局部有多种细胞成分，多种细胞间有相互作用，因此还原体内环境、探讨细胞间通讯对主动脉瓣钙化的作用，对于明确 CAVD 的发病机制、寻找合适的治疗靶点具有重要意义。