引用本文： 柳瑞军, 熊健, 陈苏峰. 骨髓源性内皮祖细胞对肺癌新生血管形成的作用. 中国胸心血管外科临床杂志, 2017, 24(9): 716-720. doi: 10.7507/1007-4848.201611044 复制
实体肿瘤的生长需要肿瘤基质的形成，它们可以为肿瘤细胞提供氧气和营养，肿瘤基质主要由细胞外基质和各种间充质细胞组成，包括巨噬细胞、内皮细胞、淋巴细胞、纤维母细胞等，众多的人类和动物实验数据显示部分肿瘤基质细胞来源于骨髓[1]。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是多潜能的祖细胞，可以分化为内皮细胞，进而修复损伤的血管内皮或者形成新生血管。EPCs 可以迁移到肿瘤组织，在旁分泌因子的影响下形成肿瘤基质[2]，参与肿瘤新生血管的形成。目前其治疗最令人瞩目的方法就是基因治疗和细胞移植。因此，EPCs 已经成为一种很有前景的血管性及肿瘤性疾病的治疗靶点。
1 材料与方法
1.1 材料
BALB/c（nu/nu）裸鼠 60 只，4～6 周龄，15～25 g，雌雄各半，购于中国医学科学院上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于新华医院动物实验中心，SPF 条件 IVC 中，动物自由摄入灭菌处理的水和饲料。随机分为 2 组：对照组和实验组。每组 30 只。无菌饲料饲养，自由进食。
1.2 实验方法
1.2.1 肺癌动物模型的建立 取 60 只 5 周肺癌建模成功的 BALB/c 小鼠，分为两组，雌雄各半，每组 30 只。取对数生长期的肺癌 SPC-A1 细胞株（中国医学科学院上海细胞研究所细胞库提供），消化后进行细胞计数，台盼蓝测定细胞活力在 95% 以上，然后 1 000 转离心 10 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）重悬细胞，将细胞浓度制成 5×106/ml。用 1 ml 注射针吸取悬液 0.2 ml（约 1×106）注射入小鼠右侧腹股沟皮下；阴性对照组在小鼠右侧腹股沟仅注射 PBS。
1.2.2 腺病毒转染EPCs效率的测定 将 EPCs[3]按 5×104/孔的浓度轻轻地接种于 24 孔板，用 EBM-2 培养 24 h 贴壁后，加入数量不等的 AD5F35LacZ（携带 LacZ 基因的重组腺病毒载体，北京本元正阳基因技术有限公司），分别为 1×106 v.p.、5×106 v.p.、10×106 v.p.、40×106 v.p.和 100×106 v.p，即感染复数（multiplicity of infection，MOI）为 10 v.p./cell、50 v.p./cell、100 v.p./cell、400 v.p./cell、1 000 v.p./cell），37℃ 孵育 3 h 后，弃上液，换用新鲜 EBM-2 培养，72 h 后吸净 EBM-2 培养液，用 PBS 冲洗3次，每孔加入细胞固定液 1 ml，30 min 后吸出固定液，再用 PBS 冲洗3次，加入 X-Gal 染液（LacZ 报告基因检测试剂盒，Sigma USA）1 ml/孔，置于 37℃ 温箱 2 h，吸出染液，用PBS 清洗3次，每孔加入 70% 甘油 1 ml，置于 4℃ 冰箱 30 min。染成蓝色的细胞为 LacZ 基因转染成功的细胞。每组样本随机选取 3 个视野，相差倒置显微镜下计数蓝染细胞数，取均值作为腺病毒EPCs转染率。
1.2.3 转染 lacZ 基因的 EPC 参与肺癌转移灶新生血管的检测 从肺癌模型建立后第 4 周，对照组每只小鼠从尾静脉注射约 5×105 个未转染 lacZ 基因的 EPCs，实验组每只小鼠从尾静脉注射约 5×105 个转染 lacZ 基因的 EPCs，常规相同条件饲养，从第 6 周开始，每周从实验组和对照组中随机各取出 10 只裸鼠，脱臼法处死，迅速打开胸腔取出全肺，将其用生理盐水冲洗后放入 4% 多聚甲醛固定 24 h，然后进行病理学检测：先进行 X-gal 染液显色，然后进行 HE 染色。
1.3 统计学分析
使用统计分析软件 SPSS 19.0 对所获数据进行统计学分析，计数资料使用 χ2 检验，计量资料采用均数±标准差（
）表示，正态分布的计量资料比较采用方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺部转移癌模型的形成
裸鼠接种 SPC-A1 肿瘤细胞后前 6 周，裸鼠肺组织未见明显转移灶。第 6 周后肺组织表面见散在灰白色半透明结节（图 1），直径 0.5～1.0 mm。镜下可见少量微小转移灶。至第 8 周后，肺部肿瘤数量和体积逐渐增加，至第 12 周时肺组织出现弥漫性转移结节，肺表面呈灰白污秽色。第 6～12 周，肺部转移瘤的数量逐渐增加，增加速度加快，差异有统计学意义（P<0.01，表 1）；12～14 周期间，肺部转移瘤数量增加趋于平稳，差异无统计学意义（P>0.05，表 1）。
表1
移植时间与小鼠肺部转移灶数量关系（
）
2.2 LacZ 对EPCs的转染
采用 X-Gal 染色试剂盒检测 AD5F35LacZ 对EPCs的转染，染成蓝色的细胞为 LacZ 基因转染成功的细胞（图 1）。这些细胞经过注射、迁移、锚定、趋化、归巢等过程参与到肺癌血管的形成过程中，为我们的进一步检测奠定基础。
图1
蓝染细胞为 LacZ 转染成功的 EPCs
2.3 MTT 法检测 EPCs 转染腺病毒后存活率
EPCs 转染了腺病毒后会影响 EPCs 生存率，转染 1 d 和 3 d 后 EPCs 会出现一部分死亡，但转染 7 d 后，EPCs 死亡出现减少，开始增殖，直到 10 d 后增殖到转染时的状态，490 nm 处的吸光光度值和 EPCs 存活率呈正相关（表 2、图 2）。
表2
转染 AD5F35 LacZ 基因的 EPCs 不同时间的 490 nm 吸光光度值（
）
图2
转染 AD5F35 LacZ 基因的 EPCs 不同时间的存活率
2.4 EPCs转染 LacZ 基因效率的测定
MOI 是指感染时病毒数和细胞数的比值，在 MOI 不同数值的情况下，腺病毒转染EPCs的效率不同，在一定范围内，转染率随 MOI 的增加而增加。在 MOI 达到 400 时，转染率最大，为 97.13±2.08。在一定MOI范围内，EPCs的转染率随着感染复数的增加而升高，但 MOI 并不与转染率成线性关系，当 MOI 超过一定数量时，由于病毒数量增多，毒性加强，细胞死亡率上升，转染率反而下降（表 3）。
表3
腺病毒对内皮祖细胞的转染率与 MOI 的关系（
）
2.5 转染 LacZ 基因的 EPCs 参与肺肿瘤血管的形成
第 6 周、第 7 周处死裸鼠进行病理检查未发现 EPCs 迁移到肿瘤位置，参与肿瘤血管的形成；第 8 周时，对照组经过 X-gal 染色后，未发现有蓝染的 EPCs 参与肿瘤血管的形成（图 3），实验组经过 X-gal 染色后，显示一些新生的小毛细血管管腔内有蓝染的细胞贴壁，说明 EPCs 迁移至肿瘤位置，归巢并黏附于血管壁上参与血管的形成（图 4）；另一些标记的 EPCs 已经变成长条形，向内皮细胞转变，若干内皮细胞围成一圈，基本形成血管的轮廓，显示出有蓝染的 EPCs 迁移到肿瘤位置，参与肿瘤新生血管的形成（图 4 箭头所示）。
图3
对照组未见蓝染细胞参与新生血管的形成（×100）
图4
第 8 周实验组可见蓝染细胞参与新生血管的形成（×100）
3 讨论
血管生成在许多生理和病理过程中都起到关键的作用，包括正常组织的生长和愈合，也包括肿瘤的生长过程。1997 年，Asahara 等[4]纯化出一群循环细胞，具有内皮细胞和祖细胞的特性，被称为 EPCs，在雌鹿肢体缺血模型的体内和体外实验中，均证实这些细胞在出生后的血管形成过程中可以分化为内皮细胞[5]。EPCs 是一群具有高增殖潜能的细胞，它们可以分化为成熟的内皮细胞，参与肿瘤新生血管的形成。EPCs 参与血管的形成是一个多步骤的过程，包括：（1）EPCs 从骨髓中迁移出来；（2）EPCs 积极躲避并跨内皮溢出进入生长中的肿瘤细胞间隙；（3）EPCs 合并进入已有的新生血管中，或者在旁分泌的作用下形成新血管[5]。EPCs 能对低氧组织、肿瘤细胞或者炎症细胞分泌的细胞因子做出反应，从骨髓中迁移出来，归巢到这些位置，分化为成熟的内皮细胞，分泌促血管生成因子，参与并有利于新生血管的形成[6]。EPCs 的迁移总是跟随着血管的形成过程，循环的 EPCs 受到缺血组织、炎症细胞或者肿瘤细胞分泌的细胞因子的招募，迁移到病理组织位置参与新生血管的形成[7]。
从第 6～12 周，肺部转移瘤的数量逐渐增加，增加速度加快，差异有统计学意义；第 12～14 周期间，肺部转移瘤数量增加趋于平稳，差异无统计学意义。所以，我们选择在肺部转移瘤增加期间注射 EPCs，使 EPCs 的介入和肿瘤的形成同步化，从而方便 EPCs 参与到肺癌血管形成的过程中。
文献[8]报道，几种生长因子参与调节内皮分化和迁移分化成为功能性血管。但循环 EPCs 和成熟的血液 ECs 之间的相互作用也许在血管形成的起始阶段起到关键的生物学作用。一些研究报道，提供给缺血组织的外源性 EPCs 在损伤后 28 d 和 1 d 的数量不相同，显示不仅 EPCs 及其分泌的或者表达的可溶性因子在新生血管的行程中也起重要作用。为适当组配血管，EPCs 能够协调黏附分子和表达在 EPCs 和内皮细胞表面的其配体，从而恰当地协调复杂的细胞间相互的黏附作用。
在免疫缺陷小鼠急性心肌梗死模型中，移植的人 CD34+ 细胞或者体外扩增的 EPCs 参与心肌新生血管的形成，分化成为成熟的内皮细胞，增加毛细血管密度，抑制心肌纤维化和凋亡，保护左心室功能。将人脐血来源的 CD34+ 细胞移植到卒中 48 h 的免疫缺陷小鼠，诱导缺血区新血管形成，为神经元的再生提供一个良好的环境。CD34+KDR+ 和 CD31+133+EPCs 分化可能在神经缺血性损伤的愈合过程中有确的治疗意义[9]。移植周围血 CD34+ 细胞促进糖尿病小鼠全层皮肤伤的新生血管的形成，从而改善伤口愈合[9-11]。Matsumoto 等的研究[12]显示静脉移植外周血的 CD34+ 细胞，富含 EPCs 的细胞群，通过促进血管生成有利于骨折的愈合。这些结果表明，骨折可能动员EPCs从骨髓移迁到外周血中，在细胞因子的招募下，EPCs归巢到骨折部位，在骨愈合的过程中，增加新生血管形成。
肿瘤源性的旁分泌和近分泌信号诱导骨髓小腔释放 EPCs，迁移到肿瘤位置，例如，肿瘤细胞产生高浓度的血管内皮生长因子，可以吸引骨髓固有的 EPCs 进入到外周循环中，从而加强招募 EPCs 到肿瘤位置[13]。已有假设证明，EPCs 一旦迁移到肿瘤位置，它们通过分泌促血管生成因子维持和调节新生血管的形成，并提供结构功能和直接的管腔进入新生的血管新芽中[14]。EPCs 内的 DNA 连接蛋白抑制因子（Id 蛋白）在肿瘤血管形成的过程中显示出关键的作用，它们和螺旋基元转录因子相互作用，调节分化和细胞周期进程。在胚胎血管发育的过程中，敲除 Id 家族中的两个成员（Id1 和 Id2）会引起胚胎的死亡。具有 Id1 复制功能的 Id3 缺陷小鼠在发育过程中不会死亡，但它们并不支持肿瘤的生长和转移。移植野生型小鼠的骨髓能够恢复肿瘤血管的形成、生长和转移[15]。这充分证明 EPCs 在肿瘤血管再生过程中必不可少的作用。
我们的实验使用 LacZ 基因转染 EPCs，当 MOI 达到 400 的时候，有 97.13% 的 EPCs 可以携带 LacZ 基因存活，在被注射进入小鼠体内后，可以在肿瘤细胞的旁分泌和近分泌因子的作用下趋化迁移到肿瘤位置，一起参与肿瘤血管的形成、肿瘤的形成，图 4 显示，蓝染的携带 LacZ 基因的 EPCs 参与到了肿瘤血管形成过程。
近来有文献[16]报道，EPCs 逐渐迁移进入患者的恶性胶质瘤中，它们的迁移水平与肿瘤血管形成活动相关。正是基于 EPCs 和肿瘤之间的这种关系，EPCs 被用于治疗胶质瘤的基因携带/输送系统，或者被用于影像探针。Soda 等[17]报道称来自于骨髓的 EPCs 可能通过旁分泌细胞因子启动血管新生过程，而不是结构性的参与血管壁形成。我们的实验显示 EPCs 在肿瘤细胞的旁分泌或者近分泌作用下，迁移到肿瘤位置，在结构上参与肿瘤新生血管的形成。EPCs 可以作为治疗基因的载体，作为生物探针，利用它的迁移和归巢的功能，将 TK 基因运送到肿瘤位置，抑制新生血管的形成，从而阻止肿瘤生长。Wang 等[16]使用 MRI 探测显示，将 USPIO 标记的 EPCs 注入到预先制作好的大脑胶质瘤模型中，EPCs 最快在 24 h 内迁移到肿瘤组织中，参与肿瘤新生血管的形成。我们的实验结果显示 LacZ 标记 EPCs 经小鼠腹股沟注入后 4 周，可在肿瘤组织中检测到蓝染的 EPCs 参与肿瘤血管结构的形成。这样的实验结果为我们提供一条思路，EPCs 可以作为治疗肺癌的靶向载体，为攻克肺癌提出新的治疗方案。
实体肿瘤的生长需要肿瘤基质的形成，它们可以为肿瘤细胞提供氧气和营养，肿瘤基质主要由细胞外基质和各种间充质细胞组成，包括巨噬细胞、内皮细胞、淋巴细胞、纤维母细胞等，众多的人类和动物实验数据显示部分肿瘤基质细胞来源于骨髓[1]。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是多潜能的祖细胞，可以分化为内皮细胞，进而修复损伤的血管内皮或者形成新生血管。EPCs 可以迁移到肿瘤组织，在旁分泌因子的影响下形成肿瘤基质[2]，参与肿瘤新生血管的形成。目前其治疗最令人瞩目的方法就是基因治疗和细胞移植。因此，EPCs 已经成为一种很有前景的血管性及肿瘤性疾病的治疗靶点。
1 材料与方法
1.1 材料
BALB/c（nu/nu）裸鼠 60 只，4～6 周龄，15～25 g，雌雄各半，购于中国医学科学院上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于新华医院动物实验中心，SPF 条件 IVC 中，动物自由摄入灭菌处理的水和饲料。随机分为 2 组：对照组和实验组。每组 30 只。无菌饲料饲养，自由进食。
1.2 实验方法
1.2.1 肺癌动物模型的建立 取 60 只 5 周肺癌建模成功的 BALB/c 小鼠，分为两组，雌雄各半，每组 30 只。取对数生长期的肺癌 SPC-A1 细胞株（中国医学科学院上海细胞研究所细胞库提供），消化后进行细胞计数，台盼蓝测定细胞活力在 95% 以上，然后 1 000 转离心 10 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）重悬细胞，将细胞浓度制成 5×106/ml。用 1 ml 注射针吸取悬液 0.2 ml（约 1×106）注射入小鼠右侧腹股沟皮下；阴性对照组在小鼠右侧腹股沟仅注射 PBS。
1.2.2 腺病毒转染EPCs效率的测定 将 EPCs[3]按 5×104/孔的浓度轻轻地接种于 24 孔板，用 EBM-2 培养 24 h 贴壁后，加入数量不等的 AD5F35LacZ（携带 LacZ 基因的重组腺病毒载体，北京本元正阳基因技术有限公司），分别为 1×106 v.p.、5×106 v.p.、10×106 v.p.、40×106 v.p.和 100×106 v.p，即感染复数（multiplicity of infection，MOI）为 10 v.p./cell、50 v.p./cell、100 v.p./cell、400 v.p./cell、1 000 v.p./cell），37℃ 孵育 3 h 后，弃上液，换用新鲜 EBM-2 培养，72 h 后吸净 EBM-2 培养液，用 PBS 冲洗3次，每孔加入细胞固定液 1 ml，30 min 后吸出固定液，再用 PBS 冲洗3次，加入 X-Gal 染液（LacZ 报告基因检测试剂盒，Sigma USA）1 ml/孔，置于 37℃ 温箱 2 h，吸出染液，用PBS 清洗3次，每孔加入 70% 甘油 1 ml，置于 4℃ 冰箱 30 min。染成蓝色的细胞为 LacZ 基因转染成功的细胞。每组样本随机选取 3 个视野，相差倒置显微镜下计数蓝染细胞数，取均值作为腺病毒EPCs转染率。
1.2.3 转染 lacZ 基因的 EPC 参与肺癌转移灶新生血管的检测 从肺癌模型建立后第 4 周，对照组每只小鼠从尾静脉注射约 5×105 个未转染 lacZ 基因的 EPCs，实验组每只小鼠从尾静脉注射约 5×105 个转染 lacZ 基因的 EPCs，常规相同条件饲养，从第 6 周开始，每周从实验组和对照组中随机各取出 10 只裸鼠，脱臼法处死，迅速打开胸腔取出全肺，将其用生理盐水冲洗后放入 4% 多聚甲醛固定 24 h，然后进行病理学检测：先进行 X-gal 染液显色，然后进行 HE 染色。
1.3 统计学分析
使用统计分析软件 SPSS 19.0 对所获数据进行统计学分析，计数资料使用 χ2 检验，计量资料采用均数±标准差（
）表示，正态分布的计量资料比较采用方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺部转移癌模型的形成
裸鼠接种 SPC-A1 肿瘤细胞后前 6 周，裸鼠肺组织未见明显转移灶。第 6 周后肺组织表面见散在灰白色半透明结节（图 1），直径 0.5～1.0 mm。镜下可见少量微小转移灶。至第 8 周后，肺部肿瘤数量和体积逐渐增加，至第 12 周时肺组织出现弥漫性转移结节，肺表面呈灰白污秽色。第 6～12 周，肺部转移瘤的数量逐渐增加，增加速度加快，差异有统计学意义（P<0.01，表 1）；12～14 周期间，肺部转移瘤数量增加趋于平稳，差异无统计学意义（P>0.05，表 1）。
表1
移植时间与小鼠肺部转移灶数量关系（
）
2.2 LacZ 对EPCs的转染
采用 X-Gal 染色试剂盒检测 AD5F35LacZ 对EPCs的转染，染成蓝色的细胞为 LacZ 基因转染成功的细胞（图 1）。这些细胞经过注射、迁移、锚定、趋化、归巢等过程参与到肺癌血管的形成过程中，为我们的进一步检测奠定基础。
图1
蓝染细胞为 LacZ 转染成功的 EPCs
2.3 MTT 法检测 EPCs 转染腺病毒后存活率
EPCs 转染了腺病毒后会影响 EPCs 生存率，转染 1 d 和 3 d 后 EPCs 会出现一部分死亡，但转染 7 d 后，EPCs 死亡出现减少，开始增殖，直到 10 d 后增殖到转染时的状态，490 nm 处的吸光光度值和 EPCs 存活率呈正相关（表 2、图 2）。
表2
转染 AD5F35 LacZ 基因的 EPCs 不同时间的 490 nm 吸光光度值（
）
图2
转染 AD5F35 LacZ 基因的 EPCs 不同时间的存活率
2.4 EPCs转染 LacZ 基因效率的测定
MOI 是指感染时病毒数和细胞数的比值，在 MOI 不同数值的情况下，腺病毒转染EPCs的效率不同，在一定范围内，转染率随 MOI 的增加而增加。在 MOI 达到 400 时，转染率最大，为 97.13±2.08。在一定MOI范围内，EPCs的转染率随着感染复数的增加而升高，但 MOI 并不与转染率成线性关系，当 MOI 超过一定数量时，由于病毒数量增多，毒性加强，细胞死亡率上升，转染率反而下降（表 3）。
表3
腺病毒对内皮祖细胞的转染率与 MOI 的关系（
）
2.5 转染 LacZ 基因的 EPCs 参与肺肿瘤血管的形成
第 6 周、第 7 周处死裸鼠进行病理检查未发现 EPCs 迁移到肿瘤位置，参与肿瘤血管的形成；第 8 周时，对照组经过 X-gal 染色后，未发现有蓝染的 EPCs 参与肿瘤血管的形成（图 3），实验组经过 X-gal 染色后，显示一些新生的小毛细血管管腔内有蓝染的细胞贴壁，说明 EPCs 迁移至肿瘤位置，归巢并黏附于血管壁上参与血管的形成（图 4）；另一些标记的 EPCs 已经变成长条形，向内皮细胞转变，若干内皮细胞围成一圈，基本形成血管的轮廓，显示出有蓝染的 EPCs 迁移到肿瘤位置，参与肿瘤新生血管的形成（图 4 箭头所示）。
图3
对照组未见蓝染细胞参与新生血管的形成（×100）
图4
第 8 周实验组可见蓝染细胞参与新生血管的形成（×100）
3 讨论
血管生成在许多生理和病理过程中都起到关键的作用，包括正常组织的生长和愈合，也包括肿瘤的生长过程。1997 年，Asahara 等[4]纯化出一群循环细胞，具有内皮细胞和祖细胞的特性，被称为 EPCs，在雌鹿肢体缺血模型的体内和体外实验中，均证实这些细胞在出生后的血管形成过程中可以分化为内皮细胞[5]。EPCs 是一群具有高增殖潜能的细胞，它们可以分化为成熟的内皮细胞，参与肿瘤新生血管的形成。EPCs 参与血管的形成是一个多步骤的过程，包括：（1）EPCs 从骨髓中迁移出来；（2）EPCs 积极躲避并跨内皮溢出进入生长中的肿瘤细胞间隙；（3）EPCs 合并进入已有的新生血管中，或者在旁分泌的作用下形成新血管[5]。EPCs 能对低氧组织、肿瘤细胞或者炎症细胞分泌的细胞因子做出反应，从骨髓中迁移出来，归巢到这些位置，分化为成熟的内皮细胞，分泌促血管生成因子，参与并有利于新生血管的形成[6]。EPCs 的迁移总是跟随着血管的形成过程，循环的 EPCs 受到缺血组织、炎症细胞或者肿瘤细胞分泌的细胞因子的招募，迁移到病理组织位置参与新生血管的形成[7]。
从第 6～12 周，肺部转移瘤的数量逐渐增加，增加速度加快，差异有统计学意义；第 12～14 周期间，肺部转移瘤数量增加趋于平稳，差异无统计学意义。所以，我们选择在肺部转移瘤增加期间注射 EPCs，使 EPCs 的介入和肿瘤的形成同步化，从而方便 EPCs 参与到肺癌血管形成的过程中。
文献[8]报道，几种生长因子参与调节内皮分化和迁移分化成为功能性血管。但循环 EPCs 和成熟的血液 ECs 之间的相互作用也许在血管形成的起始阶段起到关键的生物学作用。一些研究报道，提供给缺血组织的外源性 EPCs 在损伤后 28 d 和 1 d 的数量不相同，显示不仅 EPCs 及其分泌的或者表达的可溶性因子在新生血管的行程中也起重要作用。为适当组配血管，EPCs 能够协调黏附分子和表达在 EPCs 和内皮细胞表面的其配体，从而恰当地协调复杂的细胞间相互的黏附作用。
在免疫缺陷小鼠急性心肌梗死模型中，移植的人 CD34+ 细胞或者体外扩增的 EPCs 参与心肌新生血管的形成，分化成为成熟的内皮细胞，增加毛细血管密度，抑制心肌纤维化和凋亡，保护左心室功能。将人脐血来源的 CD34+ 细胞移植到卒中 48 h 的免疫缺陷小鼠，诱导缺血区新血管形成，为神经元的再生提供一个良好的环境。CD34+KDR+ 和 CD31+133+EPCs 分化可能在神经缺血性损伤的愈合过程中有确的治疗意义[9]。移植周围血 CD34+ 细胞促进糖尿病小鼠全层皮肤伤的新生血管的形成，从而改善伤口愈合[9-11]。Matsumoto 等的研究[12]显示静脉移植外周血的 CD34+ 细胞，富含 EPCs 的细胞群，通过促进血管生成有利于骨折的愈合。这些结果表明，骨折可能动员EPCs从骨髓移迁到外周血中，在细胞因子的招募下，EPCs归巢到骨折部位，在骨愈合的过程中，增加新生血管形成。
肿瘤源性的旁分泌和近分泌信号诱导骨髓小腔释放 EPCs，迁移到肿瘤位置，例如，肿瘤细胞产生高浓度的血管内皮生长因子，可以吸引骨髓固有的 EPCs 进入到外周循环中，从而加强招募 EPCs 到肿瘤位置[13]。已有假设证明，EPCs 一旦迁移到肿瘤位置，它们通过分泌促血管生成因子维持和调节新生血管的形成，并提供结构功能和直接的管腔进入新生的血管新芽中[14]。EPCs 内的 DNA 连接蛋白抑制因子（Id 蛋白）在肿瘤血管形成的过程中显示出关键的作用，它们和螺旋基元转录因子相互作用，调节分化和细胞周期进程。在胚胎血管发育的过程中，敲除 Id 家族中的两个成员（Id1 和 Id2）会引起胚胎的死亡。具有 Id1 复制功能的 Id3 缺陷小鼠在发育过程中不会死亡，但它们并不支持肿瘤的生长和转移。移植野生型小鼠的骨髓能够恢复肿瘤血管的形成、生长和转移[15]。这充分证明 EPCs 在肿瘤血管再生过程中必不可少的作用。
我们的实验使用 LacZ 基因转染 EPCs，当 MOI 达到 400 的时候，有 97.13% 的 EPCs 可以携带 LacZ 基因存活，在被注射进入小鼠体内后，可以在肿瘤细胞的旁分泌和近分泌因子的作用下趋化迁移到肿瘤位置，一起参与肿瘤血管的形成、肿瘤的形成，图 4 显示，蓝染的携带 LacZ 基因的 EPCs 参与到了肿瘤血管形成过程。
近来有文献[16]报道，EPCs 逐渐迁移进入患者的恶性胶质瘤中，它们的迁移水平与肿瘤血管形成活动相关。正是基于 EPCs 和肿瘤之间的这种关系，EPCs 被用于治疗胶质瘤的基因携带/输送系统，或者被用于影像探针。Soda 等[17]报道称来自于骨髓的 EPCs 可能通过旁分泌细胞因子启动血管新生过程，而不是结构性的参与血管壁形成。我们的实验显示 EPCs 在肿瘤细胞的旁分泌或者近分泌作用下，迁移到肿瘤位置，在结构上参与肿瘤新生血管的形成。EPCs 可以作为治疗基因的载体，作为生物探针，利用它的迁移和归巢的功能，将 TK 基因运送到肿瘤位置，抑制新生血管的形成，从而阻止肿瘤生长。Wang 等[16]使用 MRI 探测显示，将 USPIO 标记的 EPCs 注入到预先制作好的大脑胶质瘤模型中，EPCs 最快在 24 h 内迁移到肿瘤组织中，参与肿瘤新生血管的形成。我们的实验结果显示 LacZ 标记 EPCs 经小鼠腹股沟注入后 4 周，可在肿瘤组织中检测到蓝染的 EPCs 参与肿瘤血管结构的形成。这样的实验结果为我们提供一条思路，EPCs 可以作为治疗肺癌的靶向载体，为攻克肺癌提出新的治疗方案。
