引用本文： 安康, 刘旭光, 高健, 吕君其, 安君. 微创压力超负荷小鼠心衰模型的建立. 中国胸心血管外科临床杂志, 2016, 23(11): 1099-1102. doi: 10.7507/1007-4848.20160257 复制
小动物（大、小鼠）心衰模型被广泛应用于心肌肥厚的病因、机制以及药理学的研究[1]。目前心衰模型包括药物诱导的小鼠心衰模型、转基因方法制备的心衰模型、小鼠腹腔动-静脉瘘方法的心衰模型以及主动脉缩窄（升主动脉、主动脉弓以及腹主动脉）致超负荷导致的心衰模型等。其中主动脉缩窄致超负荷导致的心衰模型是最为广泛使用的模型[1-2]，但因主动脉缩窄的方法和部位不同，导致心衰模型的重复性、成功率以及心衰程度等不尽相同。我们通过胸骨上窝使用钽夹部分夹闭主动脉弓的方法，使心衰模型的形成时间相对固定，心衰的程度可控，其重复性好。该模型制作技术相对简单，不损伤胸膜，手术时间短，成功率高，现将其方法报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
实验动物：选用雄性昆明种系小鼠，20～25克，鼠龄4周龄，共30只，吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供。假手术组10只；实验组20只，经胸骨上窝利用钽夹部分夹闭主动脉弓组10周。其中部分夹闭主动脉弓为0.35 mm（缩窄后主动脉直径为0.35 mm）10只；部分夹闭主动脉弓为0.25 mm（缩窄后主动脉直径为0.25 mm）10只。
1.2 方法
1.2.1 外科手术
戊巴比妥钠（30 mg/kg体重）腹腔内麻醉，仰卧位固定，用脱毛膏去除颈部及胸部毛发，本组未用呼吸机。在小鼠胸骨上窝纵行切开约1～2 cm皮肤（包括切开上部胸骨1.0～1.2 cm）。外科显微镜下轻柔、钝、锐性剔除胸腺，显露主动脉弓，显露右无名动脉和左颈总动脉间隙，手术组用钽夹部分夹闭右无名动脉和左颈总动脉间的主动脉弓（缩窄后主动脉直径分别为0.35 mm、0.25 mm），缝合颈胸肌、皮肤，完成手术。假手术组，手术操作与模型制备组步骤完全相同，仅不缩窄夹闭主动脉弓。
1.2.2 心脏超声动态观察
手术10周后在麻醉下进行心脏超声动态观察，通过17 mHz探头（General Electric，Vivid V echocardiograph）观察左室后壁舒张期末厚度（LVPWD）、左室舒张期末直径（LVEDD）、短轴缩短率（FS）以及射血分数（EF）。
1.2.3 小鼠体重及心脏称重
心脏超声动态观察完毕后将小鼠用过量戊巴比妥钠处死，分别称体重和心脏重量，计算心脏（heart weight，HW）及小鼠体重（body weight，BW）之比（mg/g）。
1.2.4 血清NT-proBNT检测
取假手术组和主动脉弓部分夹闭组各6只小鼠血液，3 000 rpm离心10 min，取上清，按照酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒操作说明进行检测血清NT-proBNT[3]。
1.2.5 心肌形态学观察
心脏超声动态观察完毕将小鼠用过量戊巴比妥钠牺牲，而后用福尔马林灌注固定，取左室前壁，苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察。
1.3 统计学分析
所有数据均按照均数±标准差（X±s）表示，应用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，组间用单因素ANOVA分析，两组间用配对t检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 手术成功率
假手术组成功率为100%（10/10只）；主动脉弓部分夹闭0.35 mm组为100%（10/10只）；主动脉弓部分夹闭0.25 mm组为40%（4/10只），其中死亡6例。
2.2 HW/BW
钽夹夹闭部分主动脉弓10周后其HW/BW较假手术组明显增加[（8.88±0.25）mg/g vs.（3.75±0.19）mg/g，P < 0.01]。
2.3 超声动态观察
钽夹部分夹闭主动脉弓10周其LVEDD与假手术组比较显著增大[（9.24±0.23）cm vs.（6.96±0.2）cm，P < 0.01]；LVPWD与假手术组比较显著变薄[（1.43±0.22）mm vs.（1.95±0.14）mm，P < 0.01]；EF与假手术组比较显著变小（44.70%±1.95% vs. 69.80%±2.20%，P < 0.01）；FS与假手术组比较显著变小（20.30%±0.95% vs. 33.90%±1.85%，P < 0.01）。钽夹夹闭部分主动脉弓10周后其NT-proBNT较假手术组明显增加[（459.783±22.79）ng/L，vs.（54.10±8.92）ng/L，P < 0.01）]。
2.4 形态学观察
光镜下假手术组小鼠心肌细胞结构完整，肌纤维排列整齐，第10周心肌纤维保持正常（图 1A）；实验组小鼠部分心肌纤维断裂，心肌细胞呈不同程度变性及肥大，部分心肌细胞呈局灶性或片状坏死（图 1B）。
图1
假手术和实验组术后10周心肌纤维光镜下观察
注：A为假手术组HE ×100；B为实验组HE ×100
3 讨论
各种方法制备的心衰模型广泛应用于机制探讨以及长期药理干预，包括长期生存等研究[1, 3-4]。在制备心衰模型上根据研究目的使用大[5]、中动物[6-7]到小动物[8-11]，采取药物[12-13]、外科手术[8-9, 11]等不同方法。目前最常用的动物是大、小鼠，最常用的制备心衰模型的方法为主动脉“缩窄”，其缩窄部位为升主动脉、主动脉弓、肾动脉上部腹主动脉以及腹主动脉动静脉瘘等。缩窄方法大多是结扎部分主动脉。结扎方法的不利点是结扎后的动脉缩窄直径、程度往往难于控制和统一，因此缩窄后心脏的后负荷不一，故同一批制备的心衰模型形成的时间、程度不一。经典的经胸路径制备心衰模型的技术较难，特别是分离主动脉弓，弓下穿线时容易损伤大血管出血，严重影响了模型的成功率。而本胸骨上窝径路不开胸，技术加结扎方法容易掌握，胸腺剔除和主动脉弓分离较经典路径容易，用钽夹缩窄主动脉弓代替动脉弓下穿线，避免了因穿线导致大血管损伤出血，手术时间明显缩短，成功率高。另一方面，通过钽夹可控制缩窄直径使其心衰模型形成时间基本一致，心脏超声和形态学结果证明，心衰模型的形成时间取决于主动脉缩窄直径。我们通过自制的钽夹钳控制夹闭直径，本实验主动脉缩窄直径为0.35 mm时，10周后形态学上出现心肌纤维断裂，心肌细胞呈不同程度变性及肥大，部分心肌细胞呈局灶性坏死，同时心衰小鼠血清NT-proBNT明显高于假手术组，证明通过该压力超负荷心衰模型的可靠性。NT-proBNT目前已被认为是心功能不全的标志物之一，但并非NT-proBNT增高就诊断为心衰，因为当心肌损伤缺血、坏死、心室容量扩大或心室壁张力增加时，心室肌细胞迅速合成并释放NT-proBNT，引起血中浓度增高[14]。因此，NT-proBNT不能作为诊断心衰的唯一指标，在判断小鼠心衰时应和心脏超声、形态学相结合。也有报道，IL-17A[15]、热休克蛋白[3, 14]在心衰的诊断上与NT-proBNT正相关，甚至优于NT-proBNT可作为心衰的标志物，尤其近来IL-17A与心衰发生、心衰心脏重塑密切相关[8]，血清IL-17A浓度、IL-17A在心肌中的表达可能成为诊断心衰的标志物[16]。
本模型手术的关键是剔除胸腺时勿同时损伤双侧胸膜，如发生双侧胸膜破裂即导致小鼠死亡，而损伤单侧则在缝合颈胸肌、皮肤时排净气体即可，一般不导致小鼠死亡，不影响模型制备。我们也观察了主动脉缩窄后直径为0.25 mm一组10只，但死亡6只（分别在术后2周死亡1例，3周小鼠出现双眼球凸出、失明，死亡3例，4周死亡2例），余下4例在4～5周内死亡，提示主动脉缩窄直径过小引起急剧后负荷增加，可能导致小鼠急性心衰而死亡。而在主动脉缩窄直径为0.35 mm条件下，经10周可制备可靠的心衰模型，但需要通过心脏超声确认后再用于研究。我们认为通过胸骨上窝途径，利用钽夹部分夹闭主动脉弓建立小鼠心衰模型的方法具有：（1）切口小，技术容易掌握；（2）无需使用呼吸机，不开胸，胸部并发症少，避免血管损伤；（3）通过钽夹控制缩窄直径，心衰模型形成时间基本一致等优点，是一种更为安全易行、稳定可靠的压力超负荷心衰模型制备方法。
小动物（大、小鼠）心衰模型被广泛应用于心肌肥厚的病因、机制以及药理学的研究[1]。目前心衰模型包括药物诱导的小鼠心衰模型、转基因方法制备的心衰模型、小鼠腹腔动-静脉瘘方法的心衰模型以及主动脉缩窄（升主动脉、主动脉弓以及腹主动脉）致超负荷导致的心衰模型等。其中主动脉缩窄致超负荷导致的心衰模型是最为广泛使用的模型[1-2]，但因主动脉缩窄的方法和部位不同，导致心衰模型的重复性、成功率以及心衰程度等不尽相同。我们通过胸骨上窝使用钽夹部分夹闭主动脉弓的方法，使心衰模型的形成时间相对固定，心衰的程度可控，其重复性好。该模型制作技术相对简单，不损伤胸膜，手术时间短，成功率高，现将其方法报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
实验动物：选用雄性昆明种系小鼠，20～25克，鼠龄4周龄，共30只，吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供。假手术组10只；实验组20只，经胸骨上窝利用钽夹部分夹闭主动脉弓组10周。其中部分夹闭主动脉弓为0.35 mm（缩窄后主动脉直径为0.35 mm）10只；部分夹闭主动脉弓为0.25 mm（缩窄后主动脉直径为0.25 mm）10只。
1.2 方法
1.2.1 外科手术
戊巴比妥钠（30 mg/kg体重）腹腔内麻醉，仰卧位固定，用脱毛膏去除颈部及胸部毛发，本组未用呼吸机。在小鼠胸骨上窝纵行切开约1～2 cm皮肤（包括切开上部胸骨1.0～1.2 cm）。外科显微镜下轻柔、钝、锐性剔除胸腺，显露主动脉弓，显露右无名动脉和左颈总动脉间隙，手术组用钽夹部分夹闭右无名动脉和左颈总动脉间的主动脉弓（缩窄后主动脉直径分别为0.35 mm、0.25 mm），缝合颈胸肌、皮肤，完成手术。假手术组，手术操作与模型制备组步骤完全相同，仅不缩窄夹闭主动脉弓。
1.2.2 心脏超声动态观察
手术10周后在麻醉下进行心脏超声动态观察，通过17 mHz探头（General Electric，Vivid V echocardiograph）观察左室后壁舒张期末厚度（LVPWD）、左室舒张期末直径（LVEDD）、短轴缩短率（FS）以及射血分数（EF）。
1.2.3 小鼠体重及心脏称重
心脏超声动态观察完毕后将小鼠用过量戊巴比妥钠处死，分别称体重和心脏重量，计算心脏（heart weight，HW）及小鼠体重（body weight，BW）之比（mg/g）。
1.2.4 血清NT-proBNT检测
取假手术组和主动脉弓部分夹闭组各6只小鼠血液，3 000 rpm离心10 min，取上清，按照酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒操作说明进行检测血清NT-proBNT[3]。
1.2.5 心肌形态学观察
心脏超声动态观察完毕将小鼠用过量戊巴比妥钠牺牲，而后用福尔马林灌注固定，取左室前壁，苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察。
1.3 统计学分析
所有数据均按照均数±标准差（X±s）表示，应用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，组间用单因素ANOVA分析，两组间用配对t检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 手术成功率
假手术组成功率为100%（10/10只）；主动脉弓部分夹闭0.35 mm组为100%（10/10只）；主动脉弓部分夹闭0.25 mm组为40%（4/10只），其中死亡6例。
2.2 HW/BW
钽夹夹闭部分主动脉弓10周后其HW/BW较假手术组明显增加[（8.88±0.25）mg/g vs.（3.75±0.19）mg/g，P < 0.01]。
2.3 超声动态观察
钽夹部分夹闭主动脉弓10周其LVEDD与假手术组比较显著增大[（9.24±0.23）cm vs.（6.96±0.2）cm，P < 0.01]；LVPWD与假手术组比较显著变薄[（1.43±0.22）mm vs.（1.95±0.14）mm，P < 0.01]；EF与假手术组比较显著变小（44.70%±1.95% vs. 69.80%±2.20%，P < 0.01）；FS与假手术组比较显著变小（20.30%±0.95% vs. 33.90%±1.85%，P < 0.01）。钽夹夹闭部分主动脉弓10周后其NT-proBNT较假手术组明显增加[（459.783±22.79）ng/L，vs.（54.10±8.92）ng/L，P < 0.01）]。
2.4 形态学观察
光镜下假手术组小鼠心肌细胞结构完整，肌纤维排列整齐，第10周心肌纤维保持正常（图 1A）；实验组小鼠部分心肌纤维断裂，心肌细胞呈不同程度变性及肥大，部分心肌细胞呈局灶性或片状坏死（图 1B）。
图1
假手术和实验组术后10周心肌纤维光镜下观察
注：A为假手术组HE ×100；B为实验组HE ×100
3 讨论
各种方法制备的心衰模型广泛应用于机制探讨以及长期药理干预，包括长期生存等研究[1, 3-4]。在制备心衰模型上根据研究目的使用大[5]、中动物[6-7]到小动物[8-11]，采取药物[12-13]、外科手术[8-9, 11]等不同方法。目前最常用的动物是大、小鼠，最常用的制备心衰模型的方法为主动脉“缩窄”，其缩窄部位为升主动脉、主动脉弓、肾动脉上部腹主动脉以及腹主动脉动静脉瘘等。缩窄方法大多是结扎部分主动脉。结扎方法的不利点是结扎后的动脉缩窄直径、程度往往难于控制和统一，因此缩窄后心脏的后负荷不一，故同一批制备的心衰模型形成的时间、程度不一。经典的经胸路径制备心衰模型的技术较难，特别是分离主动脉弓，弓下穿线时容易损伤大血管出血，严重影响了模型的成功率。而本胸骨上窝径路不开胸，技术加结扎方法容易掌握，胸腺剔除和主动脉弓分离较经典路径容易，用钽夹缩窄主动脉弓代替动脉弓下穿线，避免了因穿线导致大血管损伤出血，手术时间明显缩短，成功率高。另一方面，通过钽夹可控制缩窄直径使其心衰模型形成时间基本一致，心脏超声和形态学结果证明，心衰模型的形成时间取决于主动脉缩窄直径。我们通过自制的钽夹钳控制夹闭直径，本实验主动脉缩窄直径为0.35 mm时，10周后形态学上出现心肌纤维断裂，心肌细胞呈不同程度变性及肥大，部分心肌细胞呈局灶性坏死，同时心衰小鼠血清NT-proBNT明显高于假手术组，证明通过该压力超负荷心衰模型的可靠性。NT-proBNT目前已被认为是心功能不全的标志物之一，但并非NT-proBNT增高就诊断为心衰，因为当心肌损伤缺血、坏死、心室容量扩大或心室壁张力增加时，心室肌细胞迅速合成并释放NT-proBNT，引起血中浓度增高[14]。因此，NT-proBNT不能作为诊断心衰的唯一指标，在判断小鼠心衰时应和心脏超声、形态学相结合。也有报道，IL-17A[15]、热休克蛋白[3, 14]在心衰的诊断上与NT-proBNT正相关，甚至优于NT-proBNT可作为心衰的标志物，尤其近来IL-17A与心衰发生、心衰心脏重塑密切相关[8]，血清IL-17A浓度、IL-17A在心肌中的表达可能成为诊断心衰的标志物[16]。
本模型手术的关键是剔除胸腺时勿同时损伤双侧胸膜，如发生双侧胸膜破裂即导致小鼠死亡，而损伤单侧则在缝合颈胸肌、皮肤时排净气体即可，一般不导致小鼠死亡，不影响模型制备。我们也观察了主动脉缩窄后直径为0.25 mm一组10只，但死亡6只（分别在术后2周死亡1例，3周小鼠出现双眼球凸出、失明，死亡3例，4周死亡2例），余下4例在4～5周内死亡，提示主动脉缩窄直径过小引起急剧后负荷增加，可能导致小鼠急性心衰而死亡。而在主动脉缩窄直径为0.35 mm条件下，经10周可制备可靠的心衰模型，但需要通过心脏超声确认后再用于研究。我们认为通过胸骨上窝途径，利用钽夹部分夹闭主动脉弓建立小鼠心衰模型的方法具有：（1）切口小，技术容易掌握；（2）无需使用呼吸机，不开胸，胸部并发症少，避免血管损伤；（3）通过钽夹控制缩窄直径，心衰模型形成时间基本一致等优点，是一种更为安全易行、稳定可靠的压力超负荷心衰模型制备方法。