引用本文： 汤锐, 谷天祥, 师恩祎, 王春, 张光伟, 毛乃惠. 丙戊酸对大鼠胸主动脉瘤抑制作用及机制. 中国胸心血管外科临床杂志, 2015, 22(6): 578-584. doi: 10.7507/1007-4848.20150147 复制
胸主动脉瘤发病率10.4人/10万人/年，其发病病因尚不明确未经治疗的胸主动脉瘤体一旦破裂其死亡率高达50%～80%[1-2]。组织学上的典型改变是中膜和外膜弹性蛋白和胶原的缺失平滑肌细胞凋亡，淋巴细胞和巨噬细胞浸润及新生血管形成。胶原和弹性蛋白的丢失降解起到非常重要的作用[3]，炎症介导下的基质金属蛋白酶类（MMPs）诱导反应[4]，主动脉瘤是一种严重的血管外科疾病，其主要病理改变为内皮细胞损伤及剥脱、中膜平滑肌细胞凋亡、细胞外基质的病理性重塑，同时伴有炎性细胞浸润。大量研究表明，炎性细胞在主动脉瘤形成过程中发挥重要作用[5-6]。我们通过对人动脉瘤组织的研究发现,炎性细胞浸润程度越重，腹主动脉基质损伤程度越重。研究结果发现，在动脉瘤形成早期，腹主动脉尚未扩张之前，即有炎性因子浸润。随着炎性因子浸润程度的逐渐加重，MMPs的种类增加、活性逐渐增高，弹力纤维和胶原纤维损伤程度、腹主动脉的扩张程度逐渐加重。可见炎性细胞浸润与胶原纤维和弹力纤维的损伤密切相关。炎性细胞浸润贯穿于腹主动脉瘤（AAA）形成的全过程，由炎性浸润增加以及MMPs分泌增多在AAA形成中起关键作用。
首先在局部炎症刺激下，炎性因子浸润增加，平滑肌细胞可以分泌蛋白酶，如MMPs，导致细胞外基质蛋白：胶原和弹性蛋白破坏，晚期动脉瘤形成中，动物实验及人体研究表明外部环境的改变，如血管损伤、动脉粥样硬化等可以导致平滑肌细胞（SMC）发生一系列表型转换[7]，包括：细胞增殖及转移能力增强，基因表达形式的改变，比如抑制平滑肌细胞标志基因以及炎症介导下的MMPs诱导反应[8]。在粥样硬化患者中，已经发现SM22α、SMα-肌动蛋白、SM-MHC基因被抑制，MMP-2、MMP-3、和MMP-9的高水平表达[8]。所以在动脉瘤形成过程中，炎性细胞扮演着重要角色。
组蛋白去乙酰化酶（HDAC）对很多细胞增殖分化具有调控作用，近年来已成为癌症、间质纤维化、炎症性疾病及代谢性疾病研究靶点[9]。在血管平滑肌领域，有研究发现组蛋白乙酰化酶可调控平滑肌细胞的分化[10]和内皮细胞增生[11]。HDAC可以影响细胞周期从而调控平滑肌细胞增殖，文献报道HDAC在平滑肌细胞由G1到S期有丝分裂过程中表达增加，在血管损伤后的管腔再狭窄中起重要作用[12]。在多个炎症性疾病动物模型的实验研究中表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACI）具有抗炎作用[13]。HDACI除了通过调控组蛋白乙酰化状态引起炎性细胞因子的表达，还可以通过调控包括转录因子在内的非组蛋白乙酰化状态，抑制或是激活炎性因子的表达，其中最主要的通过对核转录因子KB的抑制实现的。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
2～4个月成年SD大鼠，体重150～200 g，雌雄不拘。分成3组，每组20只。分别为：生理盐水C组、外膜浸泡猪胰弹性蛋白酶（PPE）组（P组）和外膜浸泡PPE+腹腔注射丙戊酸（VPA）组（PV组）。
1.2 方法
1.2.1 模型建立
应用2.5%戊巴比妥40 mg/kg腹膜内注射麻醉大鼠，气管切开后行气管内插管并固定，连接呼吸机，呼吸频率90次/分，吸呼比1∶1.5，压力支持0.01 Mpa。选取胸骨左缘第5肋间开胸，充分显露胸降主动脉，游离动脉，暴露约1 cm，将已用1.5 U/μl猪胰弹性蛋白酶浸泡好的棉纱覆盖血管外膜15～20 min，待血管明显改变及扩张后移除棉纱，肉眼见血管扩张约1.5倍，生理盐水冲洗胸腔。适当调整呼吸机促进左肺复张后，留置胸腔引流管（20G套管针）以5-0 Prolene滑线逐层缝合关闭胸腔。于胸腔引流管充分排气及抽取胸腔积液后，可撤除呼吸机，在充分清理呼吸道分泌物后，用6-0 Prolene滑线缝闭气管及皮肤；见图 1。
图1
大鼠主动脉血管比较
注：A为显露的正常大鼠主动脉血管；B为应用PPE浸泡15 min后的主动脉成瘤血管
1.2.2 成瘤标准
瘤体内径大于正常血管内径50%，并分别通过血管超声检测术后7 d、14 d、21 d的血管瘤增长情况。并于手术日起连续7 d腹腔注射丙戊酸（200 mg/kg），应用超声动态检测并对照；见图 2、表 1。
表1
大鼠术后血管内径监测结果（
图2
大鼠术后在体血管观察
注：血管超声监测说明应用PPE浸泡20 min后扩张明显，并于术后7 d，14 d，21 d分别进行检测记录；*表示血管内径P组、PV组与C组比较，
1.2.3 HE检测
分别将C组、P组、PV组的大鼠分别在第7 d、14 d、21 d（每组5只，共45只）行超声检测后的取材，将取材后主动脉组织放入10%福尔马林固定，部分主动脉组织直接冰冻。将组织标本分别置于无水乙醇分别浸泡，再将脱水组织放入无水乙醇和二甲苯混合溶液中浸泡，最后浸泡二甲苯。把组织标本放入融化的石蜡和二甲苯1∶1等量混合液浸泡，再分别移入融化的石蜡液中浸渍。将浸渍后的组织放在装有蜡液的容器中，迅速放入冷水中冷却。修整组织蜡块形状，置于切片机上，切成5 μm薄片，用毛笔轻托放在纸上。在载玻片上涂上蛋白甘油作为粘附剂，将展平的蜡片铺在玻片上，将载玻片放入45 ℃温箱中干燥。将组织分别放入二甲苯液体、无水乙醇浸泡，最后蒸馏水冲洗，苏木精染色，中性树胶封片。
1.2.4 免疫组织化学检测
将取得组织从低浓度酒精逐渐递升到高浓度酒精进行脱水，浸泡二甲苯并用石蜡包埋后切成5 μm的薄片进行烘干。将制成的切片脱蜡至水后行抗原修复，过氧化氢孵育，再用山羊血清封闭，将一抗IL-1、IL-6、MMP-2、MMP-9及SM22α均用磷酸盐缓冲液（PBS）1∶100稀释后浸泡切片，将二抗用PBS稀释200倍，滴加至完全覆盖组织浸泡，取出切片后滴加辣根过氧化物酶标记亲和素，并将DAB显色试剂A、B等量混合进行显色，苏木素复染，最后再次浸入75%、85%、95%的乙醇中脱水透明后封片，于显微镜下观察。
1.2.5 Western blot检测
蛋白质抽提。蛋白质定量：标准曲线制备，蛋白质待测液制备，二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）反应，数据读取，以标准蛋白浓度及对应吸光值绘制标准曲线；聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)：组装电泳装置，聚丙烯酰胺凝胶制备，蛋白上样液制备，SDS-PAGE，转印，封闭，孵育一抗，孵育二抗，电致化学发光（electrochemiluminescence，ECL）底物发光，抗体剥脱，封闭，孵育内参抗体，孵育二抗，ECL底物发光。
1.3 统计学分析
所有计量资料以均数±标准差（
2 结果
在PPE的作用下，15～20 min后动脉即出现明显扩张，术后应用血管超声检测显示P组及PV组成瘤率较高，但两组之间无明显区别，3周后动脉瘤大小基本稳定，本实验每组20只大鼠，应用PPE浸泡后的扩张率为100%，其中扩张达到正常血管1.5倍的达到标准的32只，成瘤率为80%，其中因人为因素及浸泡过度使血管破裂导致大鼠死亡3只，术后因为切口感染或其他原因致死5只，死亡率为20%。本实验结果高于Castigliano等报道的在腹主动脉中成瘤率60%[14]。
术后当天应用血管超声对大鼠动脉瘤的监测情况。C组血管内径[（2.05±0.13）mm]无明显变化，同一时间血管内径P组[（3.18±0.26）mm]与PV组[（3.16±0.23）mm]较C组明显扩张。
术后大鼠应用血管超声经胸分别于术后7 d、14 d、21 d进行检测并记录数据，并对成瘤效果行主动脉造影检查。单因素方差分析结果显示各组之间差异有统计学意义（P<0.05，表 1）。
免疫组织化学结果与HE染色结果（图 3～8）基本一致：P组和PV组SM22α高表达，说明SMC增生活跃，动脉瘤组织中IL-1、IL-6、MMP-2、MMP-9高表达（图 9～13）。PV组的MMP-2、MMP-9表达低于P组（图 9～13）。这说明VPA可以抑制基质金属蛋白酶的表达。
图3
术后14 d染色结果HE×40（注：细胞核呈蓝染，细胞质呈红染，P组和PV组的血管壁明显厚于C组，细胞增生活跃，细胞外基质表达增加） 图 4 术后14 d IL-1免疫组织化学染色结果 ×400（注：细胞核呈深蓝色，弹力蛋白层呈浅蓝色，IL-1阳性呈棕色） 图 5 术后14 d IL-6免疫组织化学染色结果 ×400（注：细胞核呈深蓝色，弹力蛋白层呈浅蓝色，IL-6阳性呈棕色） 图 6 术后MMP-2免疫组织化学染色结果 ×400（注：细胞核呈深蓝色，弹力蛋白层呈浅蓝色，MMP-2阳性呈棕色） 图 7 术后MMP-9免疫组织化学染色结果 ×400（注：细胞核呈深蓝色，弹力蛋白层呈浅蓝色，SM22α阳性呈棕色） 图 8 术后14 d SM22α免疫组织化学染色结果 ×400（注：细胞核呈深蓝色，弹力蛋白层呈浅蓝色，MMP-2阳性呈棕色）；A为C组；B为P组；C为PV组
图4
术后IL-1蛋白定量分析
注：IL-1蛋白表达量：*表示蛋白表达P组与C组比较，
图5
术后IL-6蛋白定量分析
注：IL-6蛋白表达量：*表示蛋白表达P组与C组比较，
图6
术后MMP-2蛋白定量分析
注：MMP-2蛋白表达量：*表示蛋白表达P组与C组比较，
图7
术后MMP-9蛋白定量分析
注：MMP-9蛋白表达量：*表示蛋白表达P组与C组比较，
图8
术后SM22α蛋白定量分析
注：SM22α蛋白表达量：*表示蛋白表达P组与C组比较，
3 讨论
动脉瘤的大体病理改变主要表现为中层变性，弹力层、细胞外基质的破坏以及平滑肌细胞的凋亡[15]。目前已发现的与动脉瘤相关的基因包括FBN1[16]，TGFBR1[17]，SMAD3[18]，ACTA2[19]，MYH11[20]等。Kuivaniemi等发现自身免疫也参与了主动脉瘤的发生发展过程[21]。炎症反应同样也是动脉瘤发生发展过程中的一个重要因素，炎症细胞可以分泌多种炎症因子，如细胞因子、趋化因子、白三烯、活性氧自由基及免疫球蛋白等。这些炎症因子可以侵入血管壁及壁内血栓，持续的炎症反应可打破管壁内蛋白水解平衡，进而加重基质成分的降解。Schonbeck等认为主动脉瘤是一种Th2介导的疾病，主要表现为：Th2相关细胞因子IL-4，IL-5和IL-10的高表达以及Th1相关γ-干扰素的少量表达[22]。但是Xiong [23]和Galle等[24]发现在人体及动物动脉瘤只与Th1相关。Lindeman在对动脉瘤炎症指纹图谱进行全面研究之后发现动脉瘤可以被表述为IL-6和IL-8高表达的促炎过程[25]。所以动脉瘤形成是多基因调控多种通道控制的复杂病理过程。
本项研究是首次应用外膜浸泡猪胰弹性蛋白酶的方法制作大鼠胸主动脉瘤模型，形成机理主要是PPE浸泡后血管炎性细胞浸润，对弹性蛋白层的破坏以及MMPs的高表达。实验中我们发现经PPE浸泡过的血管，管壁增厚程度、炎症侵袭程度及平滑肌细胞变异均高于C组。在较小的人体动脉瘤病理检查中也发现了相似的结果[26]，同时也支持了平滑肌细胞、成纤维细胞参与了动脉瘤自我修复的过程。实验中的动脉瘤模型均成梭形扩张，与人体动脉瘤形态相似，故在病理及形态学上能够模拟人体动脉瘤形成过程。
HDAC正在成为肿瘤和其他疾病治疗方面的重要靶点[27]，HDACI可以抑制肿瘤细胞的生长，VPA属于Ⅰ类HDACI，目前对它的研究侧重于血液病和癫痫领域，与血管相关的研究侧重于血管管腔狭窄及内膜损伤修复，针对动脉瘤方面的研究目前尚无文献报道。在血管的损伤与修复过程中，巨噬细胞与平滑肌细胞都起着重要作用，巨噬细胞对炎性介质的吞噬及平滑肌细胞的增殖、迁移、分泌等功能，过度增殖及MMPs所致的炎症反应，可导致血管纤维化[27]，进而丧失血管本来的弹性舒缩功能，容易导致动脉瘤的形成和瘤体破裂。超声结果提示应用VPA后血管管径有减小趋势，说明VPA可以抑制大鼠胸主动脉瘤生长。
组织标本HE染色及免疫组织化学染色结果提示P组和PV组的血管壁明显厚于C组，细胞增生活跃，细胞外基质表达增加，与人体动脉瘤病理标本类似[28]，通过标本染色我们发现，在修复过程中伴随着MMP-9、MMP-2的高表达，基质金属蛋白酶可以破坏细胞外基质，导致血管抵抗张力能力下降。免疫组织化学结果与HE染色结果基本一致：P组和PV组SM22α、IL-1、IL-6高表达，说明炎性细胞及平滑肌细胞增生活跃，同时进一步证实了动脉瘤组织中MMP-2、MMP-9高表达。说明VPA可以抑制基质金属蛋白酶的表达。
在动脉瘤形成过程中，可导致血管壁产生过度的炎症反应，基质金属蛋白酶高表达，细胞外基质破坏加重，进而破坏血管壁的完整性，降低血管壁抵抗张力的能力，所以在高压状态下，容易进一步扩张、形成夹层或破裂。
综上，本研究表明动脉瘤形成早期，IL-1、IL-6表达明显增加，基质金属蛋白酶高表达。VPA通过抑制炎症因子及血管壁内基质金属蛋白酶的产生，增加细胞外基质合成的方式，抑制大鼠胸主动脉瘤进展。
胸主动脉瘤发病率10.4人/10万人/年，其发病病因尚不明确未经治疗的胸主动脉瘤体一旦破裂其死亡率高达50%～80%[1-2]。组织学上的典型改变是中膜和外膜弹性蛋白和胶原的缺失平滑肌细胞凋亡，淋巴细胞和巨噬细胞浸润及新生血管形成。胶原和弹性蛋白的丢失降解起到非常重要的作用[3]，炎症介导下的基质金属蛋白酶类（MMPs）诱导反应[4]，主动脉瘤是一种严重的血管外科疾病，其主要病理改变为内皮细胞损伤及剥脱、中膜平滑肌细胞凋亡、细胞外基质的病理性重塑，同时伴有炎性细胞浸润。大量研究表明，炎性细胞在主动脉瘤形成过程中发挥重要作用[5-6]。我们通过对人动脉瘤组织的研究发现,炎性细胞浸润程度越重，腹主动脉基质损伤程度越重。研究结果发现，在动脉瘤形成早期，腹主动脉尚未扩张之前，即有炎性因子浸润。随着炎性因子浸润程度的逐渐加重，MMPs的种类增加、活性逐渐增高，弹力纤维和胶原纤维损伤程度、腹主动脉的扩张程度逐渐加重。可见炎性细胞浸润与胶原纤维和弹力纤维的损伤密切相关。炎性细胞浸润贯穿于腹主动脉瘤（AAA）形成的全过程，由炎性浸润增加以及MMPs分泌增多在AAA形成中起关键作用。
首先在局部炎症刺激下，炎性因子浸润增加，平滑肌细胞可以分泌蛋白酶，如MMPs，导致细胞外基质蛋白：胶原和弹性蛋白破坏，晚期动脉瘤形成中，动物实验及人体研究表明外部环境的改变，如血管损伤、动脉粥样硬化等可以导致平滑肌细胞（SMC）发生一系列表型转换[7]，包括：细胞增殖及转移能力增强，基因表达形式的改变，比如抑制平滑肌细胞标志基因以及炎症介导下的MMPs诱导反应[8]。在粥样硬化患者中，已经发现SM22α、SMα-肌动蛋白、SM-MHC基因被抑制，MMP-2、MMP-3、和MMP-9的高水平表达[8]。所以在动脉瘤形成过程中，炎性细胞扮演着重要角色。
组蛋白去乙酰化酶（HDAC）对很多细胞增殖分化具有调控作用，近年来已成为癌症、间质纤维化、炎症性疾病及代谢性疾病研究靶点[9]。在血管平滑肌领域，有研究发现组蛋白乙酰化酶可调控平滑肌细胞的分化[10]和内皮细胞增生[11]。HDAC可以影响细胞周期从而调控平滑肌细胞增殖，文献报道HDAC在平滑肌细胞由G1到S期有丝分裂过程中表达增加，在血管损伤后的管腔再狭窄中起重要作用[12]。在多个炎症性疾病动物模型的实验研究中表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACI）具有抗炎作用[13]。HDACI除了通过调控组蛋白乙酰化状态引起炎性细胞因子的表达，还可以通过调控包括转录因子在内的非组蛋白乙酰化状态，抑制或是激活炎性因子的表达，其中最主要的通过对核转录因子KB的抑制实现的。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
2～4个月成年SD大鼠，体重150～200 g，雌雄不拘。分成3组，每组20只。分别为：生理盐水C组、外膜浸泡猪胰弹性蛋白酶（PPE）组（P组）和外膜浸泡PPE+腹腔注射丙戊酸（VPA）组（PV组）。
1.2 方法
1.2.1 模型建立
应用2.5%戊巴比妥40 mg/kg腹膜内注射麻醉大鼠，气管切开后行气管内插管并固定，连接呼吸机，呼吸频率90次/分，吸呼比1∶1.5，压力支持0.01 Mpa。选取胸骨左缘第5肋间开胸，充分显露胸降主动脉，游离动脉，暴露约1 cm，将已用1.5 U/μl猪胰弹性蛋白酶浸泡好的棉纱覆盖血管外膜15～20 min，待血管明显改变及扩张后移除棉纱，肉眼见血管扩张约1.5倍，生理盐水冲洗胸腔。适当调整呼吸机促进左肺复张后，留置胸腔引流管（20G套管针）以5-0 Prolene滑线逐层缝合关闭胸腔。于胸腔引流管充分排气及抽取胸腔积液后，可撤除呼吸机，在充分清理呼吸道分泌物后，用6-0 Prolene滑线缝闭气管及皮肤；见图 1。
图1
大鼠主动脉血管比较
注：A为显露的正常大鼠主动脉血管；B为应用PPE浸泡15 min后的主动脉成瘤血管
1.2.2 成瘤标准
瘤体内径大于正常血管内径50%，并分别通过血管超声检测术后7 d、14 d、21 d的血管瘤增长情况。并于手术日起连续7 d腹腔注射丙戊酸（200 mg/kg），应用超声动态检测并对照；见图 2、表 1。
表1
大鼠术后血管内径监测结果（
图2
大鼠术后在体血管观察
注：血管超声监测说明应用PPE浸泡20 min后扩张明显，并于术后7 d，14 d，21 d分别进行检测记录；*表示血管内径P组、PV组与C组比较，
1.2.3 HE检测
分别将C组、P组、PV组的大鼠分别在第7 d、14 d、21 d（每组5只，共45只）行超声检测后的取材，将取材后主动脉组织放入10%福尔马林固定，部分主动脉组织直接冰冻。将组织标本分别置于无水乙醇分别浸泡，再将脱水组织放入无水乙醇和二甲苯混合溶液中浸泡，最后浸泡二甲苯。把组织标本放入融化的石蜡和二甲苯1∶1等量混合液浸泡，再分别移入融化的石蜡液中浸渍。将浸渍后的组织放在装有蜡液的容器中，迅速放入冷水中冷却。修整组织蜡块形状，置于切片机上，切成5 μm薄片，用毛笔轻托放在纸上。在载玻片上涂上蛋白甘油作为粘附剂，将展平的蜡片铺在玻片上，将载玻片放入45 ℃温箱中干燥。将组织分别放入二甲苯液体、无水乙醇浸泡，最后蒸馏水冲洗，苏木精染色，中性树胶封片。
1.2.4 免疫组织化学检测
将取得组织从低浓度酒精逐渐递升到高浓度酒精进行脱水，浸泡二甲苯并用石蜡包埋后切成5 μm的薄片进行烘干。将制成的切片脱蜡至水后行抗原修复，过氧化氢孵育，再用山羊血清封闭，将一抗IL-1、IL-6、MMP-2、MMP-9及SM22α均用磷酸盐缓冲液（PBS）1∶100稀释后浸泡切片，将二抗用PBS稀释200倍，滴加至完全覆盖组织浸泡，取出切片后滴加辣根过氧化物酶标记亲和素，并将DAB显色试剂A、B等量混合进行显色，苏木素复染，最后再次浸入75%、85%、95%的乙醇中脱水透明后封片，于显微镜下观察。
1.2.5 Western blot检测
蛋白质抽提。蛋白质定量：标准曲线制备，蛋白质待测液制备，二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）反应，数据读取，以标准蛋白浓度及对应吸光值绘制标准曲线；聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)：组装电泳装置，聚丙烯酰胺凝胶制备，蛋白上样液制备，SDS-PAGE，转印，封闭，孵育一抗，孵育二抗，电致化学发光（electrochemiluminescence，ECL）底物发光，抗体剥脱，封闭，孵育内参抗体，孵育二抗，ECL底物发光。
1.3 统计学分析
所有计量资料以均数±标准差（
2 结果
在PPE的作用下，15～20 min后动脉即出现明显扩张，术后应用血管超声检测显示P组及PV组成瘤率较高，但两组之间无明显区别，3周后动脉瘤大小基本稳定，本实验每组20只大鼠，应用PPE浸泡后的扩张率为100%，其中扩张达到正常血管1.5倍的达到标准的32只，成瘤率为80%，其中因人为因素及浸泡过度使血管破裂导致大鼠死亡3只，术后因为切口感染或其他原因致死5只，死亡率为20%。本实验结果高于Castigliano等报道的在腹主动脉中成瘤率60%[14]。
术后当天应用血管超声对大鼠动脉瘤的监测情况。C组血管内径[（2.05±0.13）mm]无明显变化，同一时间血管内径P组[（3.18±0.26）mm]与PV组[（3.16±0.23）mm]较C组明显扩张。
术后大鼠应用血管超声经胸分别于术后7 d、14 d、21 d进行检测并记录数据，并对成瘤效果行主动脉造影检查。单因素方差分析结果显示各组之间差异有统计学意义（P<0.05，表 1）。
免疫组织化学结果与HE染色结果（图 3～8）基本一致：P组和PV组SM22α高表达，说明SMC增生活跃，动脉瘤组织中IL-1、IL-6、MMP-2、MMP-9高表达（图 9～13）。PV组的MMP-2、MMP-9表达低于P组（图 9～13）。这说明VPA可以抑制基质金属蛋白酶的表达。
图3
术后14 d染色结果HE×40（注：细胞核呈蓝染，细胞质呈红染，P组和PV组的血管壁明显厚于C组，细胞增生活跃，细胞外基质表达增加） 图 4 术后14 d IL-1免疫组织化学染色结果 ×400（注：细胞核呈深蓝色，弹力蛋白层呈浅蓝色，IL-1阳性呈棕色） 图 5 术后14 d IL-6免疫组织化学染色结果 ×400（注：细胞核呈深蓝色，弹力蛋白层呈浅蓝色，IL-6阳性呈棕色） 图 6 术后MMP-2免疫组织化学染色结果 ×400（注：细胞核呈深蓝色，弹力蛋白层呈浅蓝色，MMP-2阳性呈棕色） 图 7 术后MMP-9免疫组织化学染色结果 ×400（注：细胞核呈深蓝色，弹力蛋白层呈浅蓝色，SM22α阳性呈棕色） 图 8 术后14 d SM22α免疫组织化学染色结果 ×400（注：细胞核呈深蓝色，弹力蛋白层呈浅蓝色，MMP-2阳性呈棕色）；A为C组；B为P组；C为PV组
图4
术后IL-1蛋白定量分析
注：IL-1蛋白表达量：*表示蛋白表达P组与C组比较，
图5
术后IL-6蛋白定量分析
注：IL-6蛋白表达量：*表示蛋白表达P组与C组比较，
图6
术后MMP-2蛋白定量分析
注：MMP-2蛋白表达量：*表示蛋白表达P组与C组比较，
图7
术后MMP-9蛋白定量分析
注：MMP-9蛋白表达量：*表示蛋白表达P组与C组比较，
图8
术后SM22α蛋白定量分析
注：SM22α蛋白表达量：*表示蛋白表达P组与C组比较，
3 讨论
动脉瘤的大体病理改变主要表现为中层变性，弹力层、细胞外基质的破坏以及平滑肌细胞的凋亡[15]。目前已发现的与动脉瘤相关的基因包括FBN1[16]，TGFBR1[17]，SMAD3[18]，ACTA2[19]，MYH11[20]等。Kuivaniemi等发现自身免疫也参与了主动脉瘤的发生发展过程[21]。炎症反应同样也是动脉瘤发生发展过程中的一个重要因素，炎症细胞可以分泌多种炎症因子，如细胞因子、趋化因子、白三烯、活性氧自由基及免疫球蛋白等。这些炎症因子可以侵入血管壁及壁内血栓，持续的炎症反应可打破管壁内蛋白水解平衡，进而加重基质成分的降解。Schonbeck等认为主动脉瘤是一种Th2介导的疾病，主要表现为：Th2相关细胞因子IL-4，IL-5和IL-10的高表达以及Th1相关γ-干扰素的少量表达[22]。但是Xiong [23]和Galle等[24]发现在人体及动物动脉瘤只与Th1相关。Lindeman在对动脉瘤炎症指纹图谱进行全面研究之后发现动脉瘤可以被表述为IL-6和IL-8高表达的促炎过程[25]。所以动脉瘤形成是多基因调控多种通道控制的复杂病理过程。
本项研究是首次应用外膜浸泡猪胰弹性蛋白酶的方法制作大鼠胸主动脉瘤模型，形成机理主要是PPE浸泡后血管炎性细胞浸润，对弹性蛋白层的破坏以及MMPs的高表达。实验中我们发现经PPE浸泡过的血管，管壁增厚程度、炎症侵袭程度及平滑肌细胞变异均高于C组。在较小的人体动脉瘤病理检查中也发现了相似的结果[26]，同时也支持了平滑肌细胞、成纤维细胞参与了动脉瘤自我修复的过程。实验中的动脉瘤模型均成梭形扩张，与人体动脉瘤形态相似，故在病理及形态学上能够模拟人体动脉瘤形成过程。
HDAC正在成为肿瘤和其他疾病治疗方面的重要靶点[27]，HDACI可以抑制肿瘤细胞的生长，VPA属于Ⅰ类HDACI，目前对它的研究侧重于血液病和癫痫领域，与血管相关的研究侧重于血管管腔狭窄及内膜损伤修复，针对动脉瘤方面的研究目前尚无文献报道。在血管的损伤与修复过程中，巨噬细胞与平滑肌细胞都起着重要作用，巨噬细胞对炎性介质的吞噬及平滑肌细胞的增殖、迁移、分泌等功能，过度增殖及MMPs所致的炎症反应，可导致血管纤维化[27]，进而丧失血管本来的弹性舒缩功能，容易导致动脉瘤的形成和瘤体破裂。超声结果提示应用VPA后血管管径有减小趋势，说明VPA可以抑制大鼠胸主动脉瘤生长。
组织标本HE染色及免疫组织化学染色结果提示P组和PV组的血管壁明显厚于C组，细胞增生活跃，细胞外基质表达增加，与人体动脉瘤病理标本类似[28]，通过标本染色我们发现，在修复过程中伴随着MMP-9、MMP-2的高表达，基质金属蛋白酶可以破坏细胞外基质，导致血管抵抗张力能力下降。免疫组织化学结果与HE染色结果基本一致：P组和PV组SM22α、IL-1、IL-6高表达，说明炎性细胞及平滑肌细胞增生活跃，同时进一步证实了动脉瘤组织中MMP-2、MMP-9高表达。说明VPA可以抑制基质金属蛋白酶的表达。
在动脉瘤形成过程中，可导致血管壁产生过度的炎症反应，基质金属蛋白酶高表达，细胞外基质破坏加重，进而破坏血管壁的完整性，降低血管壁抵抗张力的能力，所以在高压状态下，容易进一步扩张、形成夹层或破裂。
综上，本研究表明动脉瘤形成早期，IL-1、IL-6表达明显增加，基质金属蛋白酶高表达。VPA通过抑制炎症因子及血管壁内基质金属蛋白酶的产生，增加细胞外基质合成的方式，抑制大鼠胸主动脉瘤进展。
