引用本文： 王晓龙, 陈新涛, 曲戈, 马海波, 马军, 李印, 秦建军. miR-155在食管鳞癌中的表达及临床意义. 中国胸心血管外科临床杂志, 2015, 22(1): 61-65. doi: 10.7507/1007-4848.20150018 复制
食管癌是目前全世界八大常见的肿瘤之一，同样也是六大导致死亡的癌症之一[1]。尽管食管癌的治疗已取得巨大进展，预后仍然较差，总生存率小于10%，术后5年生存率为20%～40%[2]。食管鳞癌的发病机制尚不清楚，因此寻找有效的分子生物治疗靶点、制定个体化的治疗方案是目前临床的迫切需求。肿瘤被认为是一种复杂的基因病，几乎在所有肿瘤的发生、发展过程中都有癌基因的过表达和/或抑癌基因的表达缺失。微小RNA （miRNA）是近年来发现于真核细胞中的一类长21～22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA。miRNA基因定位于肿瘤关联基因的脆性位点或相关遗传区域，并对这些基因行转录后调控，起到类似于癌基因或抑癌基因的作用[3]。Has-miR-155位于染色体21q21.3，定位于GRCh37。微小RNA-155（MicroRNA 155，miR-155）由一个非编码基因BIC（B-cell integration cluster，BIC）转录而成，位于BIC的第3个外显子[4]。研究表明miR-155参与肿瘤发生、发展相关的许多重要生物学过程，包括增殖、凋亡和转移[5-7]，但miR-155在食管鳞癌发生、发展中的作用和详细分子机制尚不清楚。本研究采用SYBR Green qRT-PCR技术，检测食管鳞癌组织和对应癌旁正常组织miR-155的表达情况，并结合患者病历资料，探讨miR-155表达与食管鳞癌临床病理特征的关系。
1 资料与方法
1.1 组织标本来源
收集2010年1月至2012年11月河南省肿瘤医院胸外科确诊为食管癌并手术治疗的54例患者的新鲜食管癌组织及癌旁正常组织。术前均未行放射治疗、化学治疗、生物治疗等任何治疗，且无家族史。每例标本均采集肿瘤组织（T，避免取肿瘤坏死区）和癌旁正常黏膜组织（N，距离癌组织>5 cm）。所取标本离体时间均<30 min。将组织块剪至1 cm3大小，迅速置于液氮中2～3 min速冻，然后转存于-80 ℃中供提取RNA使用。收集患者性别、年龄、病理号码、病理资料等。每例标本最终组织病理学诊断均为原发性食管鳞癌。其中男47例、女7例，年龄45～82岁，中位年龄为61岁；Ⅰ+Ⅱ期40例，Ⅲa+b期14例。肿瘤分级、TNM分期分别按照2009年美国癌症联合委员会（AJCC）的标准判定。
1.2 主要研究材料和仪器
主要材料：miRNA提取试剂盒（miRNeasy Mini kit，Cat.No.217004）、反转录试剂盒（miScript Reverse Transcription Kit，Cat.No.218061）及荧光实时定量试剂盒（miScript SYBR Green PCR Kit，Cat.No.218073）。引物Hs_miR-155*_1 miScript Primer Assay （MS0000-8778），Hs_RNU6-2_1 （MS00033740） 均为购自Qiagen公司的成品。
主要仪器：匀浆仪（Fastprep-24）、普通PCR仪（Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler） 及7500 Real Time PCR System。
1.3 实验方法
1.3.1 总RNA的提取
参照miRNeasy Mini kit（QIAGEN）说明书提取细胞总RNA。主要步骤：取冰冻标本，加入Qiazol，使用匀浆机反复研磨至匀浆，室温下静置5 min，移至1.5 ml离心管中；每管加入氯仿，剧烈震荡30 s，室温下静置约5 min；4 ℃ 12 000转/min离心15 min，小心吸取无色上清液至另一1.5 ml EP管（不要碰到中间的白膜），加入无水乙醇，混匀，然后以每次700 μl移至离心柱内，以10 000转/min离心15 s；然后参照说明书用试剂盒内的Buffer纯化RNA，最后以RNase-free water溶解RNA；取1 μl使用RNA核酸定量仪测定OD值，另取5 μl应用1%琼脂糖电泳检测是否具有清晰的3 条带，其余80 ℃保存供反转录使用。
1.3.2 逆转录
在冰上配制逆转录反应液，体系组成见表 1。反应循环参数：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，4 ℃forever。
表1
反转录体系
1.3.3 SYBR Green qRT-PCR扩增在冰上配置20 μl
real-time PCR反应体系，见表 2。反应条件为：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，70 ℃ 34 s，40个循环。记录每个反应管中的荧光信号到达所设立的阈值时经历的循环数即Ct值。将原始数据取3次重复的平均值后用内参基因U6B进行归一化，得出ΔCt，ΔCt=CtmiR-155-CtU6B，应用2-ΔCt分别计算癌组织及配对癌旁组织中miR-155的相对表达量。然后应用2-ΔΔCt方法计算食管鳞癌组织相对于其癌旁正常黏膜组织的miR-155表达水平[8]。其中ΔΔCt=ΔCt（癌组织）-ΔCt（癌旁正常组织）。2-ΔΔCt表示肿瘤组织中所检测目的基因相对于癌旁正常组织的表达倍数。
表2
SYBR Green qRT-PCR扩增体系
1.4 统计学分析
用SPSS 16.0软件进行统计学分析。由于结果数据为非正态分布资料，故对配对样本采用非参数Wilcoxon配对秩和检验，两个独立样本采用Mann-Whitney U检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 总RNA质量检测及qRT-PCR结果
使用miRNA专用提取试剂盒（miRNeasy Mini kit）分别从54例食管鳞癌组织和对应的癌旁正常黏膜组织中提取总RNA后，运用核酸定量仪测定OD值，D260/D280的比值范围在1.8～2.1；1%琼脂糖电泳检测有3条清晰的rRNA带，分别为28 s、18 s和5 s。以上结果表明总RNA样品完整性好，其纯度、浓度符合荧光qRT-PCR的要求。qRT-PCR结果见图 1。
图1
SYBR Green qRT-PCR结果
注：A：miR-155基因PCR产物的熔解曲线峰值约在74.4 ℃；B：U6B基因PCR产物的溶解曲线约在75 ℃，溶解温度均较为均一，峰的形态明显，显示扩增的为特异性序列；C：miR-155扩增曲线良好；D：U6B扩增曲线良好
2.2 miR-155在食管鳞癌组织及癌旁正常黏膜组织中的表达情况
miR-155在食管鳞癌组织中表达量的中位数为0.014 6，相应癌旁正常黏膜组织表达量的中位数为0.051 7；在54例食管鳞癌标本中，有44例（81%）miR-155的相对表达量下降。应用非参数配对秩和检验，食管鳞癌与相应癌旁正常黏膜组织中miR-155表达差异有统计学意义（Z=-4.258，P=0.000），提示miR-155在食管鳞癌组织中的表达显著低于癌旁正常黏膜组织，见图 2。
图2
miR-155在食管鳞癌组织及癌症正常黏膜组织的表达
2.3 miR-155相对于正常黏膜的表达及与临床病理特征的关系
对54例食管鳞癌组织相对于其癌旁正常黏膜组织的miR-155表达水平与患者临床病理参数进行相关性分析，发现miR-155的相对表达与淋巴结转移显著相关（P<0.05），但与年龄、性别、吸烟、饮酒、浸润深度、肿瘤pTNM分期及分化程度等均无明显相关性（P>0.05）。miR-155在有淋巴结转移的患者中相对表达较低，见表 3。
表3
miR-155的相对表达水平与食管鳞癌临床病理特征的关系
3 讨论
miRNA是近年来发现于真核细胞中的一类长21～22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，可通过与靶mRNA的3′UTRs （untranslated regions，非翻译区）近乎完全互补结合在转录后水平使其降解，或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，从而在基因表达中发挥重要的调节作用[9]。miRNA在细胞核及细胞质中首先被转录为长的初始片段（pri-miRNAs），然后经过一系列的过程生成成熟的miRNA，其过程共分3步：首先细胞核中的miRNA基因生成原始转录片段（pri-miRNAs）；然后经RNA内切酶ⅢDrosha剪切及一系列复杂的过程，生成70 nt长度的miRNA前体（pre-miRNAs）；随后pre-miRNAs被转运到细胞质，在这里被Dicer酶切割成成熟的miRNA[10]。成熟的miRNA能够通过核酸序列互补识别特定的目标mRNA，使之降解或抑制其翻译，从而抑制蛋白质的合成，达到调控基因表达的目的。据推测，miRNA调节着人类1/3的基因，参与机体诸多生理病理过程[11]。根据miRNAs在肿瘤发生发展中作用的不同，有关研究提出了“癌miRNA”与“抑癌miRNA”的观点。例如，miR-21作为一个致癌miRNA，在多种肿瘤的发生和发展中起着重要作用。近来研究发现，miR-21在食管鳞癌组织和食管癌细胞系中显著高表达，它能通过抑制细胞凋亡相关分子来调控细胞增殖与侵袭[12]。Mori等[13]研究证实，miR-21可以与抑癌基因PTEN的3′-UTR结合。Ma等[14]研究发现，miR-21可能通过调节PTEN蛋白的表达而影响哈萨克族人食管鳞癌的发生、发展、浸润和转移。而let-7通过抑制HMGA2的表达在食管鳞癌中扮演着抑癌基因的角色[15]。
本研究采用荧光实时定量PCR法检测了54例食管鳞癌组织及癌旁正常组织中miR-155的表达水平，结果发现在食管鳞癌组织中miR-155表达显著低于癌旁正常黏膜组织。Roldo等[16]研究发现miR-155在胰腺胰岛细胞癌和腺泡细胞癌中均无表达，但是在正常胰腺组织中有表达。同时有关miR-155的肿瘤抑制作用也有报道。Dorsett等[17]证实miR-155是通过减少AID （activation-induced cyt-idinedeaminase）产生的潜在癌基因转位而起到抑制肿瘤的作用。因此，我们推测miR-155在食管鳞癌的发生中可能起着抑癌基因的作用，有望成为食管鳞癌分子防治的相关靶点。有意思的是，有研究表明miR-155在肺癌、乳腺癌等实体肿瘤中呈高表达，已经确认miR-155的高表达与白血病、乳腺癌、肺癌及胃癌的形成和发展有直接联系[18-20]。这可能与miRNA在不同组织的肿瘤中表达具有差异性有关。
在炎症及免疫的病理生理过程中，miR-155同样发挥着重要的作用。巨噬细胞作为炎症和免疫关键细胞之一，在多种炎症递质诱导下miR-155表达增加[21]。Vigorito等[22]证实在淋巴细胞免疫反应及生发中心的形成中miR-155发挥着重要作用。Rodriguez等[23]发现miR-155基因敲除鼠树突状细胞的抗原提呈功能受限。另外，miR-155基因敲除鼠生发中心的功能、T细胞依赖的抗体反应及细胞因子产生均降低[24]，而目前研究发现炎症细胞是肿瘤间质的重要组成部分，在肿瘤发生发展中具有重要的作用。基于以上结果，我们推测miR-155相对表达的降低可能导致机体炎症、免疫反应及相关抑癌机制的失调，进而促进了食管鳞癌的发生。本实验结合病理资料分析，miR-155的相对表达与淋巴结转移显著相关（P<0.05），但与浸润深度、肿瘤的pTNM分期及分化程度等均无明显相关性（P>0.05）；有淋巴结转移的患者中miR-155的表达较低。食管鳞癌中miR-155的相对表达水平在食管鳞癌进展中的作用有待进一步研究。
综上所述，本研究结果提示miR-155相对表达量的下降可能导致相关抑癌机制的失调，进而有利于食管鳞癌的发生、发展，其确切机制有待进一步研究。随着研究的深入，相信miR-155可能成为一个全新的食管鳞癌诊断和治疗靶点。
食管癌是目前全世界八大常见的肿瘤之一，同样也是六大导致死亡的癌症之一[1]。尽管食管癌的治疗已取得巨大进展，预后仍然较差，总生存率小于10%，术后5年生存率为20%～40%[2]。食管鳞癌的发病机制尚不清楚，因此寻找有效的分子生物治疗靶点、制定个体化的治疗方案是目前临床的迫切需求。肿瘤被认为是一种复杂的基因病，几乎在所有肿瘤的发生、发展过程中都有癌基因的过表达和/或抑癌基因的表达缺失。微小RNA （miRNA）是近年来发现于真核细胞中的一类长21～22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA。miRNA基因定位于肿瘤关联基因的脆性位点或相关遗传区域，并对这些基因行转录后调控，起到类似于癌基因或抑癌基因的作用[3]。Has-miR-155位于染色体21q21.3，定位于GRCh37。微小RNA-155（MicroRNA 155，miR-155）由一个非编码基因BIC（B-cell integration cluster，BIC）转录而成，位于BIC的第3个外显子[4]。研究表明miR-155参与肿瘤发生、发展相关的许多重要生物学过程，包括增殖、凋亡和转移[5-7]，但miR-155在食管鳞癌发生、发展中的作用和详细分子机制尚不清楚。本研究采用SYBR Green qRT-PCR技术，检测食管鳞癌组织和对应癌旁正常组织miR-155的表达情况，并结合患者病历资料，探讨miR-155表达与食管鳞癌临床病理特征的关系。
1 资料与方法
1.1 组织标本来源
收集2010年1月至2012年11月河南省肿瘤医院胸外科确诊为食管癌并手术治疗的54例患者的新鲜食管癌组织及癌旁正常组织。术前均未行放射治疗、化学治疗、生物治疗等任何治疗，且无家族史。每例标本均采集肿瘤组织（T，避免取肿瘤坏死区）和癌旁正常黏膜组织（N，距离癌组织>5 cm）。所取标本离体时间均<30 min。将组织块剪至1 cm3大小，迅速置于液氮中2～3 min速冻，然后转存于-80 ℃中供提取RNA使用。收集患者性别、年龄、病理号码、病理资料等。每例标本最终组织病理学诊断均为原发性食管鳞癌。其中男47例、女7例，年龄45～82岁，中位年龄为61岁；Ⅰ+Ⅱ期40例，Ⅲa+b期14例。肿瘤分级、TNM分期分别按照2009年美国癌症联合委员会（AJCC）的标准判定。
1.2 主要研究材料和仪器
主要材料：miRNA提取试剂盒（miRNeasy Mini kit，Cat.No.217004）、反转录试剂盒（miScript Reverse Transcription Kit，Cat.No.218061）及荧光实时定量试剂盒（miScript SYBR Green PCR Kit，Cat.No.218073）。引物Hs_miR-155*_1 miScript Primer Assay （MS0000-8778），Hs_RNU6-2_1 （MS00033740） 均为购自Qiagen公司的成品。
主要仪器：匀浆仪（Fastprep-24）、普通PCR仪（Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler） 及7500 Real Time PCR System。
1.3 实验方法
1.3.1 总RNA的提取
参照miRNeasy Mini kit（QIAGEN）说明书提取细胞总RNA。主要步骤：取冰冻标本，加入Qiazol，使用匀浆机反复研磨至匀浆，室温下静置5 min，移至1.5 ml离心管中；每管加入氯仿，剧烈震荡30 s，室温下静置约5 min；4 ℃ 12 000转/min离心15 min，小心吸取无色上清液至另一1.5 ml EP管（不要碰到中间的白膜），加入无水乙醇，混匀，然后以每次700 μl移至离心柱内，以10 000转/min离心15 s；然后参照说明书用试剂盒内的Buffer纯化RNA，最后以RNase-free water溶解RNA；取1 μl使用RNA核酸定量仪测定OD值，另取5 μl应用1%琼脂糖电泳检测是否具有清晰的3 条带，其余80 ℃保存供反转录使用。
1.3.2 逆转录
在冰上配制逆转录反应液，体系组成见表 1。反应循环参数：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，4 ℃forever。
表1
反转录体系
1.3.3 SYBR Green qRT-PCR扩增在冰上配置20 μl
real-time PCR反应体系，见表 2。反应条件为：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，70 ℃ 34 s，40个循环。记录每个反应管中的荧光信号到达所设立的阈值时经历的循环数即Ct值。将原始数据取3次重复的平均值后用内参基因U6B进行归一化，得出ΔCt，ΔCt=CtmiR-155-CtU6B，应用2-ΔCt分别计算癌组织及配对癌旁组织中miR-155的相对表达量。然后应用2-ΔΔCt方法计算食管鳞癌组织相对于其癌旁正常黏膜组织的miR-155表达水平[8]。其中ΔΔCt=ΔCt（癌组织）-ΔCt（癌旁正常组织）。2-ΔΔCt表示肿瘤组织中所检测目的基因相对于癌旁正常组织的表达倍数。
表2
SYBR Green qRT-PCR扩增体系
1.4 统计学分析
用SPSS 16.0软件进行统计学分析。由于结果数据为非正态分布资料，故对配对样本采用非参数Wilcoxon配对秩和检验，两个独立样本采用Mann-Whitney U检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 总RNA质量检测及qRT-PCR结果
使用miRNA专用提取试剂盒（miRNeasy Mini kit）分别从54例食管鳞癌组织和对应的癌旁正常黏膜组织中提取总RNA后，运用核酸定量仪测定OD值，D260/D280的比值范围在1.8～2.1；1%琼脂糖电泳检测有3条清晰的rRNA带，分别为28 s、18 s和5 s。以上结果表明总RNA样品完整性好，其纯度、浓度符合荧光qRT-PCR的要求。qRT-PCR结果见图 1。
图1
SYBR Green qRT-PCR结果
注：A：miR-155基因PCR产物的熔解曲线峰值约在74.4 ℃；B：U6B基因PCR产物的溶解曲线约在75 ℃，溶解温度均较为均一，峰的形态明显，显示扩增的为特异性序列；C：miR-155扩增曲线良好；D：U6B扩增曲线良好
2.2 miR-155在食管鳞癌组织及癌旁正常黏膜组织中的表达情况
miR-155在食管鳞癌组织中表达量的中位数为0.014 6，相应癌旁正常黏膜组织表达量的中位数为0.051 7；在54例食管鳞癌标本中，有44例（81%）miR-155的相对表达量下降。应用非参数配对秩和检验，食管鳞癌与相应癌旁正常黏膜组织中miR-155表达差异有统计学意义（Z=-4.258，P=0.000），提示miR-155在食管鳞癌组织中的表达显著低于癌旁正常黏膜组织，见图 2。
图2
miR-155在食管鳞癌组织及癌症正常黏膜组织的表达
2.3 miR-155相对于正常黏膜的表达及与临床病理特征的关系
对54例食管鳞癌组织相对于其癌旁正常黏膜组织的miR-155表达水平与患者临床病理参数进行相关性分析，发现miR-155的相对表达与淋巴结转移显著相关（P<0.05），但与年龄、性别、吸烟、饮酒、浸润深度、肿瘤pTNM分期及分化程度等均无明显相关性（P>0.05）。miR-155在有淋巴结转移的患者中相对表达较低，见表 3。
表3
miR-155的相对表达水平与食管鳞癌临床病理特征的关系
3 讨论
miRNA是近年来发现于真核细胞中的一类长21～22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，可通过与靶mRNA的3′UTRs （untranslated regions，非翻译区）近乎完全互补结合在转录后水平使其降解，或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，从而在基因表达中发挥重要的调节作用[9]。miRNA在细胞核及细胞质中首先被转录为长的初始片段（pri-miRNAs），然后经过一系列的过程生成成熟的miRNA，其过程共分3步：首先细胞核中的miRNA基因生成原始转录片段（pri-miRNAs）；然后经RNA内切酶ⅢDrosha剪切及一系列复杂的过程，生成70 nt长度的miRNA前体（pre-miRNAs）；随后pre-miRNAs被转运到细胞质，在这里被Dicer酶切割成成熟的miRNA[10]。成熟的miRNA能够通过核酸序列互补识别特定的目标mRNA，使之降解或抑制其翻译，从而抑制蛋白质的合成，达到调控基因表达的目的。据推测，miRNA调节着人类1/3的基因，参与机体诸多生理病理过程[11]。根据miRNAs在肿瘤发生发展中作用的不同，有关研究提出了“癌miRNA”与“抑癌miRNA”的观点。例如，miR-21作为一个致癌miRNA，在多种肿瘤的发生和发展中起着重要作用。近来研究发现，miR-21在食管鳞癌组织和食管癌细胞系中显著高表达，它能通过抑制细胞凋亡相关分子来调控细胞增殖与侵袭[12]。Mori等[13]研究证实，miR-21可以与抑癌基因PTEN的3′-UTR结合。Ma等[14]研究发现，miR-21可能通过调节PTEN蛋白的表达而影响哈萨克族人食管鳞癌的发生、发展、浸润和转移。而let-7通过抑制HMGA2的表达在食管鳞癌中扮演着抑癌基因的角色[15]。
本研究采用荧光实时定量PCR法检测了54例食管鳞癌组织及癌旁正常组织中miR-155的表达水平，结果发现在食管鳞癌组织中miR-155表达显著低于癌旁正常黏膜组织。Roldo等[16]研究发现miR-155在胰腺胰岛细胞癌和腺泡细胞癌中均无表达，但是在正常胰腺组织中有表达。同时有关miR-155的肿瘤抑制作用也有报道。Dorsett等[17]证实miR-155是通过减少AID （activation-induced cyt-idinedeaminase）产生的潜在癌基因转位而起到抑制肿瘤的作用。因此，我们推测miR-155在食管鳞癌的发生中可能起着抑癌基因的作用，有望成为食管鳞癌分子防治的相关靶点。有意思的是，有研究表明miR-155在肺癌、乳腺癌等实体肿瘤中呈高表达，已经确认miR-155的高表达与白血病、乳腺癌、肺癌及胃癌的形成和发展有直接联系[18-20]。这可能与miRNA在不同组织的肿瘤中表达具有差异性有关。
在炎症及免疫的病理生理过程中，miR-155同样发挥着重要的作用。巨噬细胞作为炎症和免疫关键细胞之一，在多种炎症递质诱导下miR-155表达增加[21]。Vigorito等[22]证实在淋巴细胞免疫反应及生发中心的形成中miR-155发挥着重要作用。Rodriguez等[23]发现miR-155基因敲除鼠树突状细胞的抗原提呈功能受限。另外，miR-155基因敲除鼠生发中心的功能、T细胞依赖的抗体反应及细胞因子产生均降低[24]，而目前研究发现炎症细胞是肿瘤间质的重要组成部分，在肿瘤发生发展中具有重要的作用。基于以上结果，我们推测miR-155相对表达的降低可能导致机体炎症、免疫反应及相关抑癌机制的失调，进而促进了食管鳞癌的发生。本实验结合病理资料分析，miR-155的相对表达与淋巴结转移显著相关（P<0.05），但与浸润深度、肿瘤的pTNM分期及分化程度等均无明显相关性（P>0.05）；有淋巴结转移的患者中miR-155的表达较低。食管鳞癌中miR-155的相对表达水平在食管鳞癌进展中的作用有待进一步研究。
综上所述，本研究结果提示miR-155相对表达量的下降可能导致相关抑癌机制的失调，进而有利于食管鳞癌的发生、发展，其确切机制有待进一步研究。随着研究的深入，相信miR-155可能成为一个全新的食管鳞癌诊断和治疗靶点。
