引用本文： 刘光源, 朱江, 文彦, 何金涛. 非小细胞肺癌ALK、ROS1及RET融合基因检测与临床特性的相关性分析. 中国胸心血管外科临床杂志, 2014, 21(4): 522-525. doi: 10.7507/1007-4848.20140147 复制
非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌总数的80%~85％，是最常见的、死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]。肺癌的综合治疗及个体化治疗已是全球共识。当表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)基因突变在非小细胞肺癌发生、发展过程中的机制明晰后，以小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)为代表的靶向治疗成为继手术、放疗、化疗之后应用最为广泛的治疗方式之一，并且取得了较好的临床效果，基于分子病理诊断的个体化治疗已深入人心。随着肺癌驱动基因研究的深入，研究者们相继发现了间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase，ALK)、ROS1、RET等基因重排在非小细胞肺癌发生中的作用[2-3]，并成功研制了以ALK融合基因为靶点的激酶抑制剂——克唑替尼，已用于临床。已有研究表明ALK，ROS1，RET融合基因在非小细胞肺癌患者中的阳性率分别为3%~7%、1.7%和1%~2%，欧美人种及高加索人群ALK融合基因发生率为2%~5%，ROS1及RET阳性率更低[4-5]。国内小量病例报道ALK融合基因发生率为7%~10%。其阳性率随种族、组织表型、临床特征及检测方法等不同而存在差异。我们通过逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技术检测四川省肿瘤医院310例非小细胞肺癌术后的病理标本，了解ALK、ROS1、RET基因重排在四川地区非小细胞肺癌中的阳性率，并分析其与临床特征的相关性。
1 材料与方法
1.1 临床资料
四川省肿瘤医院肺部肿瘤科2009年3月至2012年3月收治非小细胞肺癌患者310例，均来自四川地区，其中男234例、女76例，年龄29~77岁，中位年龄60岁。组织学类型采用世界卫生组织第3版肺癌组织学分类标准；临床病理分期采用第七版TNM分期。所有患者排除同时患有其它类型的癌症，若有必要，行检查明确是否为原发性肺癌。
1.2 实验材料和仪器
实验仪器采用安捷伦科技有限公司的荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(MX3000P美国)。核糖核酸(RNA)提取试剂盒，脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶及DNA提取试剂盒等均由厦门艾德生物医药科技有限公司提供。
1.3 实验方法
收集外科手术切除的肿瘤组织(病理结果证实为非小细胞肺癌)标本，取出后浸泡于液氮中，随后保存于-80°的冰箱中，标本预处理后经提取DNA、质量控制、加样上机、结果判定等步骤，采用RT-PCR方法检测其ALK、ROS1、RET基因的融合情况。
1.4 统计学分析
采用连续校正卡方检验(continuity correction X2检验)或Fisher精确概率法分析基因重排与年龄、性别、吸烟史、病理类型及组织分化等临床特征的相关性，所有P值均基于双向假设检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。用SPSS 13.0统计软件进行统计处理。
2 结果
2.1 一般情况
非小细胞肺癌患者310例，男234例、女76例，中位年龄60岁；有吸烟史164例，无吸烟史或少量吸烟146例；腺癌142例，鳞癌138例，腺鳞癌10例，其它类型20例。见表 1。所有患者中共发生基因重排17例，其中ALK基因重排15例，阳性率4.84%；RET基因重排2例，阳性率0.64%；ROS1基因重排1例，阳性率0.32%；见表 2。
表1
310例基因检测患者的临床资料(例)
表2
基因重排发生率
2.2 ALK基因重排与临床特征的相关性
ALK基因重排更容易发生在60岁以下、不吸烟、腺癌患者中(P < 0.05)；ALK基因重排与患者的性别及肿瘤分化程度无明显相关性，见表 3。
表3
ALK基因重排与临床特征的相关性
2.3 ROS1和RET基因重排
本组患者中ROS1和RET基因重排分别为1例和2例，阳性发生率分别为0.32%和0.64%，均为腺癌患者；其中ROS1同时合并有ALK基因重排。
3 讨论
肺癌是当今世界发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，严重危害人类的生命健康，其中大约有80%~85%为非小细胞肺癌，因此，对于非小细胞肺癌的治疗直接关系到整体肺癌的治疗效果。2004年，美国的科学家报道了表皮生长因子受体(EGFR)突变与酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)吉非替尼疗效之间的关系，开启了靶向治疗的新纪元[6]，随后一系列临床研究奠定了靶向治疗为继手术、化疗、放疗之后最有效的肺癌治疗手段地位[7]。随着驱动基因的研究进展，肺癌的治疗已逐渐发展为以分子病理为基础的个体化、多学科综合治疗；随着基因测序技术的进步，更多的驱动基因在肺癌中被发现，最典型的是ALK融合基因，其发生率虽然不如EGFR突变高，但针对庞大的肺癌发病人群具有显著的临床意义，由此，针对ALK基因重排的蛋白激酶抑制剂——克唑替尼(辉瑞公司)已用于临床，取得了非常好的临床效果。
ALK表达与间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)密切相关，其编码产物是ALCL重要的分子标志物，是由1 620个氨基酸组成的跨膜蛋白，属于酪氨酸受体中的胰岛素受体亚家族[8]，在肺癌中发现的ALK融合基因主要为棘皮动物微管样蛋白4-间变淋巴瘤激酶融合基因(EML4-ALK)。EML4-ALK融合基因由第2号染色体短臂插入引起，使两个EML4-ALK分子的激酶区相互结合，通过自身磷酸化活化下游磷脂酰肌醇3激酶(PIK3)——蛋白激酶B信号传导通路，从而引起细胞向恶性转化。2007年Soda等[9]研究了75例日本非小细胞肺癌患者，首次检测到其中5例(6.7％) EML4-ALK融合基因表达。Wong等[10]对266例非小细胞肺癌患者的组织标本进行EML4-ALK融合基因检测，其中13例为阳性，其中11例为腺癌，2例为腺鳞癌。此后，多个国家均有报道，但阳性发生率有差异[11]，现有的检测方法主要为荧光原位杂交技术(FISH)、免疫组织化学(IHC)和RT-PCR，检测方法不同，其阳性率高低有差异，最佳的检测方法有待评估[12]。我们采用RT-PCR方法进行检测，该方法有灵敏、稳定、程序化操作和质量易于控制等特点。本组患者ALK基因重排检测的阳性率为4.84%，腺癌、年轻、不吸烟或少吸烟患者中阳性率更高，而与性别和肿瘤细胞分化程度无相关性。同时发现ALK基因重排与EGFR突变相互排斥，与国内外报道相一致。另一项在2012ASCO上公布的Ⅱ期临床试验超过900例ALK阳性的晚期非小细胞肺癌患者接受克唑替尼治疗，客观缓解率(ORR) 53%，无进展生存期(PFS) 8.5个月[13]。同时患者临床症状，如疼痛(包括胸痛)、咳嗽、呼吸困难、失眠、疲乏等显著改善，生存质量显著提高。因此，ALK已经成为继EGFR以后重要的、具有显著临床意义的非小细胞肺癌的驱动基因[14-17]。基于本组资料为四川地区患者流行病学分布情况及临床特征，有针对性的对EGFR突变阴性、相对年轻、不吸烟或少吸烟的腺癌患者进行ALK基因筛查，可显著提升阳性患者的检出率，减轻患者的经济负担。
人类ROS1基因属于胰岛素受体家族的一种跨膜酪氨酸激酶，与禽流感肉瘤病毒UR2的v-ros序列具同源性，因此被命名为ROS基因，其编码是胰岛素受体家族的一种跨膜酪氨酸激酶，它由一个酪氨酸激酶区域、一个跨膜区域和一个含N端糖基化位点的细胞外区域组成，编码具有酪氨酸激酶活性的Ⅰ型完整膜蛋白。ROS1基因最显著的特征在于细胞外区域由6个重复序列组成，与纤维连接蛋白具有高度同源性，在细胞黏附中伴有重要的作用[18-19]，它可以直接翻译黏附分子参与细胞内的信号通路。2007年Rikova等[20]发现ROS1融合基因也在肺癌细胞株中表达。在非小细胞肺癌中ROS1基因主要与SLC34A2、CD74发生融合，ROS1融合后成为非小细胞肺癌的驱动基因，进而导致持续性的酪氨酸激酶活化，并与TKI药物的敏感性有关，因为ROS1与ALK的激酶区域有同源性(49%)。
有临床研究表明肿瘤标本中检测到含有EML4-ALK的非小细胞肺癌患者可从ALK特异性激酶抑制剂克唑替尼中获益，能显著延长患者的总生存期[21-22]，另外，克唑替尼已用于ROS1阳性的进展期非小细胞肺癌患者的Ⅰ期临床试验，初步结果显示13例阳性患者在第8周时客观缓解率和疾病控制率分别为54%和85%[23]。针对ALK变异型肺癌的个体化治疗正在不断发展，不同的融合方式产生的酪氨酸激酶活性不同，导致从ALK-TKI中获益的程度可能不同[2]。本组患者中有1例检测出ROS1基因重排，并同时发生ALK基因重排，ALK和ROS1基因重排同时发生的患者激酶抑制剂疗效是否更佳，或有其他临床特点尚需进一步观察。
RET原癌基因由Takahashi等首先在转化小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3细胞)时发现，它因与其他基因重排而活化，因为在转化中发生重排，将它命名为RET基因。它位于10q 11.2，含有21个外显子，全长60 kb，与其他染色体易位或10号染色体发生倒置可使RET活化。RET原癌基因编码一种跨膜的酪氨酸激酶受体RET蛋白，调节细胞的生长、分化。Takeuchi等[24]经分子和组织病理学检测在1 526例肺癌患者样本中发现14例(0.9%)腺癌存在新的融合基因KIF5B-RET和CCDC6-RET。另有文献报道KIF5B-RET基因在肺腺癌的发生率为1%~2%，并发现RET激酶抑制剂凡德他尼(vandetanib)可抑制KIF5B-RET融合基因锚定的NIH3T3细胞的生长活性[25]。研究发现RET基因重排与其他肺癌驱动基因相互排斥，与包括EGFR、KRAS、ALK、HER2、BRAF、ROS1等有排他性，在其他肺癌驱动基因野生型的腺癌患者中有RET基因重排阳性率大约为6.3%。特异性RET激酶抑制剂或多靶点激酶抑制剂有效。该基因重排整体阳性率较低，临床意义有待进一步探讨。
非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌总数的80%~85％，是最常见的、死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]。肺癌的综合治疗及个体化治疗已是全球共识。当表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)基因突变在非小细胞肺癌发生、发展过程中的机制明晰后，以小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)为代表的靶向治疗成为继手术、放疗、化疗之后应用最为广泛的治疗方式之一，并且取得了较好的临床效果，基于分子病理诊断的个体化治疗已深入人心。随着肺癌驱动基因研究的深入，研究者们相继发现了间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase，ALK)、ROS1、RET等基因重排在非小细胞肺癌发生中的作用[2-3]，并成功研制了以ALK融合基因为靶点的激酶抑制剂——克唑替尼，已用于临床。已有研究表明ALK，ROS1，RET融合基因在非小细胞肺癌患者中的阳性率分别为3%~7%、1.7%和1%~2%，欧美人种及高加索人群ALK融合基因发生率为2%~5%，ROS1及RET阳性率更低[4-5]。国内小量病例报道ALK融合基因发生率为7%~10%。其阳性率随种族、组织表型、临床特征及检测方法等不同而存在差异。我们通过逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技术检测四川省肿瘤医院310例非小细胞肺癌术后的病理标本，了解ALK、ROS1、RET基因重排在四川地区非小细胞肺癌中的阳性率，并分析其与临床特征的相关性。
1 材料与方法
1.1 临床资料
四川省肿瘤医院肺部肿瘤科2009年3月至2012年3月收治非小细胞肺癌患者310例，均来自四川地区，其中男234例、女76例，年龄29~77岁，中位年龄60岁。组织学类型采用世界卫生组织第3版肺癌组织学分类标准；临床病理分期采用第七版TNM分期。所有患者排除同时患有其它类型的癌症，若有必要，行检查明确是否为原发性肺癌。
1.2 实验材料和仪器
实验仪器采用安捷伦科技有限公司的荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(MX3000P美国)。核糖核酸(RNA)提取试剂盒，脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶及DNA提取试剂盒等均由厦门艾德生物医药科技有限公司提供。
1.3 实验方法
收集外科手术切除的肿瘤组织(病理结果证实为非小细胞肺癌)标本，取出后浸泡于液氮中，随后保存于-80°的冰箱中，标本预处理后经提取DNA、质量控制、加样上机、结果判定等步骤，采用RT-PCR方法检测其ALK、ROS1、RET基因的融合情况。
1.4 统计学分析
采用连续校正卡方检验(continuity correction X2检验)或Fisher精确概率法分析基因重排与年龄、性别、吸烟史、病理类型及组织分化等临床特征的相关性，所有P值均基于双向假设检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。用SPSS 13.0统计软件进行统计处理。
2 结果
2.1 一般情况
非小细胞肺癌患者310例，男234例、女76例，中位年龄60岁；有吸烟史164例，无吸烟史或少量吸烟146例；腺癌142例，鳞癌138例，腺鳞癌10例，其它类型20例。见表 1。所有患者中共发生基因重排17例，其中ALK基因重排15例，阳性率4.84%；RET基因重排2例，阳性率0.64%；ROS1基因重排1例，阳性率0.32%；见表 2。
表1
310例基因检测患者的临床资料(例)
表2
基因重排发生率
2.2 ALK基因重排与临床特征的相关性
ALK基因重排更容易发生在60岁以下、不吸烟、腺癌患者中(P < 0.05)；ALK基因重排与患者的性别及肿瘤分化程度无明显相关性，见表 3。
表3
ALK基因重排与临床特征的相关性
2.3 ROS1和RET基因重排
本组患者中ROS1和RET基因重排分别为1例和2例，阳性发生率分别为0.32%和0.64%，均为腺癌患者；其中ROS1同时合并有ALK基因重排。
3 讨论
肺癌是当今世界发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，严重危害人类的生命健康，其中大约有80%~85%为非小细胞肺癌，因此，对于非小细胞肺癌的治疗直接关系到整体肺癌的治疗效果。2004年，美国的科学家报道了表皮生长因子受体(EGFR)突变与酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)吉非替尼疗效之间的关系，开启了靶向治疗的新纪元[6]，随后一系列临床研究奠定了靶向治疗为继手术、化疗、放疗之后最有效的肺癌治疗手段地位[7]。随着驱动基因的研究进展，肺癌的治疗已逐渐发展为以分子病理为基础的个体化、多学科综合治疗；随着基因测序技术的进步，更多的驱动基因在肺癌中被发现，最典型的是ALK融合基因，其发生率虽然不如EGFR突变高，但针对庞大的肺癌发病人群具有显著的临床意义，由此，针对ALK基因重排的蛋白激酶抑制剂——克唑替尼(辉瑞公司)已用于临床，取得了非常好的临床效果。
ALK表达与间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)密切相关，其编码产物是ALCL重要的分子标志物，是由1 620个氨基酸组成的跨膜蛋白，属于酪氨酸受体中的胰岛素受体亚家族[8]，在肺癌中发现的ALK融合基因主要为棘皮动物微管样蛋白4-间变淋巴瘤激酶融合基因(EML4-ALK)。EML4-ALK融合基因由第2号染色体短臂插入引起，使两个EML4-ALK分子的激酶区相互结合，通过自身磷酸化活化下游磷脂酰肌醇3激酶(PIK3)——蛋白激酶B信号传导通路，从而引起细胞向恶性转化。2007年Soda等[9]研究了75例日本非小细胞肺癌患者，首次检测到其中5例(6.7％) EML4-ALK融合基因表达。Wong等[10]对266例非小细胞肺癌患者的组织标本进行EML4-ALK融合基因检测，其中13例为阳性，其中11例为腺癌，2例为腺鳞癌。此后，多个国家均有报道，但阳性发生率有差异[11]，现有的检测方法主要为荧光原位杂交技术(FISH)、免疫组织化学(IHC)和RT-PCR，检测方法不同，其阳性率高低有差异，最佳的检测方法有待评估[12]。我们采用RT-PCR方法进行检测，该方法有灵敏、稳定、程序化操作和质量易于控制等特点。本组患者ALK基因重排检测的阳性率为4.84%，腺癌、年轻、不吸烟或少吸烟患者中阳性率更高，而与性别和肿瘤细胞分化程度无相关性。同时发现ALK基因重排与EGFR突变相互排斥，与国内外报道相一致。另一项在2012ASCO上公布的Ⅱ期临床试验超过900例ALK阳性的晚期非小细胞肺癌患者接受克唑替尼治疗，客观缓解率(ORR) 53%，无进展生存期(PFS) 8.5个月[13]。同时患者临床症状，如疼痛(包括胸痛)、咳嗽、呼吸困难、失眠、疲乏等显著改善，生存质量显著提高。因此，ALK已经成为继EGFR以后重要的、具有显著临床意义的非小细胞肺癌的驱动基因[14-17]。基于本组资料为四川地区患者流行病学分布情况及临床特征，有针对性的对EGFR突变阴性、相对年轻、不吸烟或少吸烟的腺癌患者进行ALK基因筛查，可显著提升阳性患者的检出率，减轻患者的经济负担。
人类ROS1基因属于胰岛素受体家族的一种跨膜酪氨酸激酶，与禽流感肉瘤病毒UR2的v-ros序列具同源性，因此被命名为ROS基因，其编码是胰岛素受体家族的一种跨膜酪氨酸激酶，它由一个酪氨酸激酶区域、一个跨膜区域和一个含N端糖基化位点的细胞外区域组成，编码具有酪氨酸激酶活性的Ⅰ型完整膜蛋白。ROS1基因最显著的特征在于细胞外区域由6个重复序列组成，与纤维连接蛋白具有高度同源性，在细胞黏附中伴有重要的作用[18-19]，它可以直接翻译黏附分子参与细胞内的信号通路。2007年Rikova等[20]发现ROS1融合基因也在肺癌细胞株中表达。在非小细胞肺癌中ROS1基因主要与SLC34A2、CD74发生融合，ROS1融合后成为非小细胞肺癌的驱动基因，进而导致持续性的酪氨酸激酶活化，并与TKI药物的敏感性有关，因为ROS1与ALK的激酶区域有同源性(49%)。
有临床研究表明肿瘤标本中检测到含有EML4-ALK的非小细胞肺癌患者可从ALK特异性激酶抑制剂克唑替尼中获益，能显著延长患者的总生存期[21-22]，另外，克唑替尼已用于ROS1阳性的进展期非小细胞肺癌患者的Ⅰ期临床试验，初步结果显示13例阳性患者在第8周时客观缓解率和疾病控制率分别为54%和85%[23]。针对ALK变异型肺癌的个体化治疗正在不断发展，不同的融合方式产生的酪氨酸激酶活性不同，导致从ALK-TKI中获益的程度可能不同[2]。本组患者中有1例检测出ROS1基因重排，并同时发生ALK基因重排，ALK和ROS1基因重排同时发生的患者激酶抑制剂疗效是否更佳，或有其他临床特点尚需进一步观察。
RET原癌基因由Takahashi等首先在转化小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3细胞)时发现，它因与其他基因重排而活化，因为在转化中发生重排，将它命名为RET基因。它位于10q 11.2，含有21个外显子，全长60 kb，与其他染色体易位或10号染色体发生倒置可使RET活化。RET原癌基因编码一种跨膜的酪氨酸激酶受体RET蛋白，调节细胞的生长、分化。Takeuchi等[24]经分子和组织病理学检测在1 526例肺癌患者样本中发现14例(0.9%)腺癌存在新的融合基因KIF5B-RET和CCDC6-RET。另有文献报道KIF5B-RET基因在肺腺癌的发生率为1%~2%，并发现RET激酶抑制剂凡德他尼(vandetanib)可抑制KIF5B-RET融合基因锚定的NIH3T3细胞的生长活性[25]。研究发现RET基因重排与其他肺癌驱动基因相互排斥，与包括EGFR、KRAS、ALK、HER2、BRAF、ROS1等有排他性，在其他肺癌驱动基因野生型的腺癌患者中有RET基因重排阳性率大约为6.3%。特异性RET激酶抑制剂或多靶点激酶抑制剂有效。该基因重排整体阳性率较低，临床意义有待进一步探讨。
